وهذا البروتوكول هام لأنه يفتح الباب أمام مزيد من البحث في تصميم النظم البيولوجية النانوية التي هي في حالة توازن ديناميكي. هذه التقنية تملأ جزءا من الفجوة بين الهياكل الهندسية والطبيعية لأنها تمكن من دراسة ما يمكن أن نسميه، الشفاء الذاتي"أو الاستبدال الديناميكي للمكونات الجزيئية. أهم نصيحة لمحاولة هذه التقنية للمرة الأولى هو التأكد من أن المجرب يتبع جميع بروتوكولات السلامة.
أولاً، إعداد حلول الأسهم كما هو موضح في بروتوكول النص. ماصة 21.8 ميكرولترات من BRB80 العازلة في أنبوب صغير أجهزة الطرد المركزي الصغيرة. إضافة 1 ميكرولتر من محلول مخزون كلوريد المغنيسيوم، 1 ميكرولتر من حل الأسهم GTP، و 1.2 ميكرولترات من حل الأسهم DMSO لإنهاء إعداد العازلة نمو microtubule.
لبدء البلمرة microtubule، إضافة 6.25 ميكرولترات من المخزن المؤقت للنمو microtubule مباشرة إلى 20 ميكروغرام aliquot من tubulin مسيل ليوبيلي؛المسمى ليكون متحمسا في 647 نانومتر. دوامة في 40 RPS لمدة 5 ثوان. يبرد aliquot على الجليد لمدة 5 دقائق.
ثم، احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. لبدء الاستقرار microtubule، إضافة 5 ميكرولترات من حل باكليتاكسل aliquoted إلى 490 ميكرولترات من المخزن المؤقت BRB80. دوامة الحل في 30 RPS لمدة 10 ثانية.
مرة واحدة في 45 دقيقة من الحضانة لmicrotubules هو ما يصل، إضافة 5 ميكرولترات من هذا الحل إلى BRB80، وخليط باكليتاكسيل، لإنشاء حل MT100. أولا ، إضافة 9.0 ميكرولترات من المحلول aliquoted casein إلى 291 ميكرولترات من المخزن المؤقت BRB80. Pipette 83 ميكرولترات من حل الكازين BRB80 في أنبوب جديد 6 ملليلتر أجهزة الطرد المركزي الصغيرة.
إضافة 1 ميكرولتر من د-جلوكوز, الجلوكوز أوكسيديز, كاتالاز, DTT, فوسفات الكرياتين, والفوسوفكيناز. ثم، إضافة 1 ميكرولتر من الأسهم ATP الحل إلى حل حركية. نفض الغبار، أو دوامة aliquot لتوزيع المواد الكيميائية بشكل متجانس.
المقبل، إضافة 1 ميكرولتر من الحل kinesin أعدت إلى حل حركية، بحيث التركيز النهائي هو 20 نانومولار. أضف 10 ميكروليتر من حل MT100 إلى حل الحركة. بالنسبة لخلايا التدفق، استخدم كل من غطاء كبير و coverlip صغير.
شطف جميع الأغطية مرتين مع الإيثانول ومرتين مع الماء فائقة الpure. Sonicate الأغلفة المغسولة في الماء فائقة الpure لمدة 5 دقائق. ثم جفف الأغطية في فرن عند درجة حرارة تتراوح بين 50 و 75 درجة مئوية.
استخدام منظف للأشعة فوق البنفسجية الأوزون لعلاج جانب واحد من كل غطاء لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وفي الظروف الجوية العادية. باستخدام ملاقط، الوجه كل غطاء واستخدام الأشعة فوق البنفسجية الأوزون لعلاج الجانب غير المعالجة كذلك. Sonicate الأغطية المعالجة في الماء فائقة الخطورة لمدة 5 دقائق.
ثم جففها في فرن عند درجة حرارة تتراوح بين 50 و 75 درجة مئوية. بعد ذلك، دون معدات واقية كما هو موضح في بروتوكول النص. غمر كل غطاء في محلول ملحي لمدة 15 ثانية.
غسل الغطاءات مرتين في التولوين وثلاث مرات في الميثانول. استخدام النيتروجين المضغوط لتجفيف الأغطية. مرة واحدة في الأغطية جافة، وقطع قطعة من الشريط على الوجهين التي هي 2 سم في 2.5 سم.
قطع هذه القطعة إلى نصفين عمودياً إلى شرائط سنتيمتر واحد بمقدار 2.5 سنتيمتر. وضع غطاء كبير على ممسحة مهمة حساسة والعصا الشريط شرائط عليه، طول الحكمة على طول حواف لإنشاء 1 سنتيمتر في 2.5 منطقة سنتيمتر بين قطعة من الشريط. عصا غطاء صغير على أعلى الشريط الشريط لإنهاء تجمع خلية تدفق.
أولاً، تدفق ما يقرب من 20 ميكرولترات من حل PEG-PPG-PEG-PEG في خلية التدفق المجمعة. السماح للحلول امتصاص على السطح لمدة 5 دقائق، ثم، تبادل هذا الحل مع 20 ميكرولترات من المخزن المؤقت BRB80 ثلاث مرات عن طريق تدفق المخزن المؤقت في. تدفق 20 ميكرولترات من حل حركية في خلية تدفق.
بعد ذلك، قم بختم حواف خلية التدفق بالشحوم لمنع التبخر إذا كانت التجربة المخطط لها أطول من ساعة. إجراء التصوير باستخدام نوع موضوعية مجموع المجهر فلوريسنس الداخلية. وضع قطرة من زيت الغمر على الهدف.
بعد ذلك، ضع خلية التدفق على منصة المجهر. وجلب الهدف حتى يكون هناك اتصال بين النفط على الهدف والخلايا تدفق. استخدم نظام تغطية المجهر المتشابك لمنع جميع ضوء الليزر من الهروب.
ثم، قم بتشغيل الليزر والتركيز على السطح السفلي من خلية التدفق باستخدام ليزر 642 نانومتر لصورة ميكروتومبولس، و488 نانومتر ليزر لتصوير محركات kinesin GFP. سجل الصور أو مقاطع الفيديو التي تهمك. يمكن تسجيل الصور طالما هناك حركة في خلية التدفق.
في هذه الدراسة، يتم عرض نظام نانوي نشط، الذي يجمع نفسه الذاتي لبنات البناء الملزمة ضعيفة لبناء مسارها الخاص. باستخدام المجهر tirf ، يتم تصوير ميكروتومات مزلق بشكل منفصل من محركات kinesin. Microtubules مرئية عند الإثارة مع ليزر 647 نانومتر.
و kinesin GFP مرئية عندما متحمس مع ليزر 488 نانومتر. وكان الوقت بين الإثارة والضوء الأحمر والأخضر أقل من ثانية واحدة. كما يمكن أن نرى، مزلق microtubules تجميع محركات kinesin من الحل وإيداعها على السطح.
تبقى محركات كينسين في أعقاب ميكروتومات لفترة قصيرة من الزمن قبل العودة إلى الحل. من المهم جدا أن يكون التركيز الصحيح من الكواشف في antifade من حل الحركة ، وإلا ، فإن تبييض الصورة من شأنه أن يسبب فشل التجربة. هذه التقنية تمهد الطريق لاستخدام أكثر كفاءة من المحركات البروتينية في أنظمة المهندس نانوي.
وهكذا ، تمكين تصميم ودراسة أكثر تعقيدا النانوية.
