RNA المعدلة هي طريقة جديدة لنقل الجينات إلى القلب، والأعضاء الأخرى. هذا البروتوكول سوف توفر نهجا دقيقا لتقديم الجينات المطلوبة بشكل عابر إلى القلب، بعد احتشاء عضلة القلب. لا يقتصر هذا الأسلوب على احتشاء عضلة القلب ، ولكن يمكن تطبيقه أيضًا على إعادة حقن الإقفار ، ونماذج الانقباض الأبهري العرضية.
يتم استخدام الحمض النووي الريبي المعدل في العديد من التجارب السريرية البشرية. ومع ذلك، لا يوجد بروتوكول موحد للجينات المنقولة إلى القلب باستخدام هذه الطريقة. سوف مظاهرة البصرية تمكين الباحثين لحقن بشكل صحيح الحمض النووي الريبي المعدلة في المواقع المناسبة في القلب.
إثبات procedule سيكون أجيت Magadum، زميل ما بعد الدكتوراه، وإيلينا شيبوركو مشرف الحيوانات من مختبرنا. استنادا إلى تركيز التي أعدت سابقا في وزارة الدفاع، حساب حجم MODRNA اللازمة لحقن 100 ميكروغرام. يجعل وحدات متساوية من حلول السكروز والسيترات.
ثم إضافة حجم محسوب من MODRNA، ومحلول ملحي يكفي لجعل حجم الحقن إلى 60 ميكرولترات. بعد تخدير الحيوان، وضعه الجانب البطني، مع فمها في مواجهة المجرب. ثم للحفاظ على مجرى الهواء المفتوح من خلال إجراء النوبات داخل منطقة التنفّاض، اسحب اللسان برفق.
ضبط زاوية الرقبة لتصويب مسار النوبات، ودفع في قنية الاحتضان. مراقبة حركة الصدر من الماوس للتحقق من أن كلا الرئتين تلقي الأوكسجين. يجب أن يكون معدل التنفس حوالي 120 نفسا في الدقيقة.
لبدء ربط LAD، بدوره الماوس بعناية على الجانب الأيمن. رفع الجلد ، وإجراء استئصال الصدر من الجانب الأيسر بين الأضلاع الثالثة والرابعة. افتح الصدر بعناية، دون لمس الرئتين بأية أجسام حادة.
ضع الداخرات في الشق للحفاظ على تجويف الصدر مفتوحًا ، مما يوفر رؤية واضحة للقلب. بعد ذلك، قم بتحريك الرئتين إلى حافة الشق، وأزل جزء الكيس الحفّار الذي يغطي القلب. حدد بعناية LAD، وهو وعاء أحمر فاتح عميق، يقع بين الشريان الرئوي والوعاء الأيسر.
Ligate LAD القريب مع خياطة حريرية واحدة. باستخدام حقنة الأنسولين، وتقديم ما مجموعه 60 ميكرولترات من محلول MODRNA إلى القلب. حقن 20 ميكروليتر داخل العضل، في ثلاثة مواقع مختلفة.
موقع واحد على كل جانب من ربط واحد في قمة القلب. أفضل طريقة لحقن الحمض النووي الريبي المعدلة في المواقع الصحيحة، هو مراقبة تلون الأنسجة تحت المجهر، بعد انسداد LAD. أيضا عندما حقن، لا تذهب عميقا جدا في الأنسجة للوصول إلى غرف القلب في الدورة الدموية.
أغلق الشق الصدري في الطبقات. وكان أول استخدام 6-0 الحرير تشغيل الغرز لتكييف الأضلاع. ثم استخدام 5-0 الحرير تشغيل الغرز لإغلاق الجلد.
لمرحلة الانتعاش، وإزالة القنيولا، والسماح للتنفس العفوي. وضع الحيوان على وسادة التدفئة حتى يستعيد وعيه. لا تترك الحيوان دون مراقبة حتى يكون مستيقظا تماما.
لإدارة الألم بعد الجراحة، حقن البوبرينورفين تحت الجلد على فترات 12 ساعة لمدة ثلاثة أيام. بجرعة 0.1 ملليغرام لكل كيلوغرام من وزن الجسم. بعد 24 ساعة من ربط LAD وحقن luciferase modRNA في فئران CFW ، تم التحقق من صحة transfection عن طريق التحقق من تعبير بروتين luciferase باستخدام نظام تصوير الإضاءة الحيوية.
يمكن الكشف عن إشارة luciferase بوضوح في الصور مقارنة الفئران التحكم، إلى الفئران حقن مع luciferase وزارة الدفاع الأمريكية. يظهر القياس الكمي لإشارة لوسيفيراز تعبيرًا بروتينيًا أعلى بكثير في الفئران المعالجة منه في الفئران الخاضعة للتحكم. تم التحقق من صحة التعبير CRE modRNA من خلال التحقق من ترجمته وتوزيعه الحيوي في فئران ROSA26 mTmG المعدلة وراثيا.
بعد 24 ساعة من الجراحة وحقن مودرنا cre، تم إصلاح الفنون ومعالجتها من أجل الإصابة بالمناعة مع علامة cardiomyocyte، وتروبونين القلبي الأول، وعلامة النوى DAPI. وكان التعبير الناجح cre واضحًا بسبب ظهور كريميوسيتس ملونة خضراء. تظهر صورة مدمجة الخلايا النشطة حول موقعي الحقن المرئيين.
الأزرق هو وصمة عار النووية DAPI. يمكن لمنصة الحمض النووي الريبي المعدلة تقديم جين واحد أو تركيبات جينية في مجموعة متنوعة من الأعضاء. وبالتالي يمكن استخدامها لأغراض علاجية، مثل تصحيح الاضطرابات الوراثية، أو تفعيل آليات مفيدة في الجسم.
إن المستحضرات الدوائية الفريدة للرنا المعدل تمكننا من تقييم وظيفة الجينات مباشرة بعد حقنها. وهذا يمكن الباحث من استهداف مسارات الإشارات ، والتي يتم تغييرها في الساعات القليلة الأولى من الاحتشاح.
