مع استخدام هذا البروتوكول يمكن للباحثين تحديد exome رواية أو خارج الخلية على أساس الخلايا الخلوية الصغيرة القائمة والأنسجة المتقدمة لسرطان البروستاتا. عزل RNA من كل من أنسجة F-F-B والحويصلات خارج الخلية غالبا ما يكون تحديا لأن معظمها إما دي خلق أو هو في كمية محدودة هذا الجسيم سوف تفصّل على أساليب مختلفة لتحسين المدخلات R-N-A ومكتبات C-D-N-A للجينات الأكثر تحديدا حرة وعالية الجودة لبيانات الجيل القادم التسلسل. القادم تسلسل الجنرال يقدم منصة أشمل لفهم تغيير الجزيء في الورم الذي يكمن وراء تطور الورم يتم تحسين هذا الجسيم مع سرطان البروستاتا العينة السريرية، ويمكن أن توفر رؤى جديدة في علم الأحياء الكامنة وراء سرطان البروستاتا العدوانية المتقدمة.
تحسين المكتبات C-D-N-A من مواد الإدخال المنخفضة هو خطوة حاسمة لتشغيل تسلسل ناجح من المهم جدا لذلك لتوليد مكتبات C-D-N-A عالية الجودة للحصول على نتائج دقيقة. بعد إجراء تشريح الجزئي للأنسجة كما فعلت سابقا المضي قدما في عزل المصل المستمدة E-V في ذوبان الصفوف من عينات مصل المريض في أربع درجات مئوية. نقل 110 ميكرو لتر من عينة مصل المذاب إلى أنبوب وتدور في ألفي مرة G لمدة ثلاثين دقيقة.
انتخاب نادين سوبر لعزل E-V أو exosome اللاحقة والتخلص من بيليه debree. في 30 microleters من كاشف عزل المصل إلى ناينت السوبر. احتضانه أربع درجات مئوية لمدة ثلاثين دقيقة.
تدور في عشرة آلاف مرة G لمدة عشر دقائق. انتخاب عظمى ه-V nadent بعناية دون إزعاج بيليه في أنبوب 1.5 ملليلتر منفصلة وتخزين ناقص 80 درجة مئوية للتحليل في المستقبل. ثم قم بإعادة تعليق بيليه E-V في 70 لترًا صغيرًا من P-B-S المعدة في مياه خالية من النوى.
بعد عزل مجموع R-N-A من الأنسجة تشريح الدقيقة، وتنقية E-V باستخدام مجموعات تجارية أداء إعداد المكتبة في خمسة لترات صغيرة من 40 نانوغرام تطبيع لكل ميكرو لتر R-N-A عينة في لتر واحد من ثلاثة محول رئيس الوزراء. قبل سخنا دورة الحرارية إلى 70 درجة مئوية واحتضان العينة لمدة دقيقتين. نقل العينات على الفور على الجليد.
في أنبوب منفصل مزيج لترين ميكرو من العازلة الربط, لتر صغير واحد من مثبط RNase لتر صغير واحد من T4 RNA ligase اثنين, متحولة الحذف. مزيج فطيرة معاً الفراش صعودا وهبوطا. ثم إضافة أربعة لترات صغيرة من هذا المزيج إلى أنبوب مع R-N-A 3 محول رئيس الوزراء على الجليد.
سخني الدورة الحرارية إلى 28 درجة مئوية. ووضع الأنبوب في دورة حرارية لاحتضان لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك، إضافة لتر صغير واحد من وقف الحل في الأنبوب مع الحفاظ على العينة على دورة الحرارية.
احتضان في 28 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة أخرى. ثم إزالة على الفور الأنبوب والحفاظ على الجليد. في أنبوب منفصل إضافة ميكرولتر واحد من خمسة محول رئيس الوزراء.
نقل إلى دورة حرارية التي تم تسخينها مسبقا إلى 70 درجة مئوية. واحتضان لمدة دقيقتين. ضع الأنبوب على الجليد على الفور لمنع إعادة اليانين للمحولات.
إضافة لتر صغير واحد من عشرة millimole A-T-P إلى أنبوب D المحي خمسة محول رئيس الوزراء. مزيج الوَمّة الفطيرة الضمّة وإضافة لتر صغير واحد من T4 R-N-A ligase إلى المزيج. مزيج الفطيرة معا.
نقل ثلاثة ميكروليتر من هذا المزيج إلى أنبوب يحتوي على ثلاثة محول رئيس مُضَمّل R-N-A. وضع أنبوب على دورة الحرارية التي تم تسخينها قبل إلى 28 درجة مئوية واحتضان لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك على الفور نقل أنبوب على الجليد وإما المضي قدما مع العينات أو تخزين في ناقص 80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.
لتنفيذ R-T-P-C-R، استخدم ligers الدقيقة الستة من كل محول مُتَجَلّج R-N-A وأضيف ليجر صغير واحد من R-N-A-R-T التمهيدي إليها. نقل أنبوب إلى دورة حرارية محمّاة مسبقا إلى 70 درجة مئوية واحتضان لمدة دقيقتين. نقل الأنبوب إلى الجليد.
في أنبوب منفصل مزيج لترين من الصغر 5X, العازلة حبلا, 5 اللترات الصغيرة من 12.5 milimoler DNTP, لتر صغير واحد من 100 ميليمولار DTT, لتر صغير واحد من مثبط R-N-A, ولتر صغير واحد من النسخ العكسي. إضافة خمسة ميكروليترات من هذا المزيج إلى الحمض النووي الريبي محول الربط ونقلها إلى دورة الحرارية التي تم تسخينها إلى 50 درجة مئوية لاحتضان لمدة ساعة واحدة. بعد ساعة واحدة نقل محول ربط الحمض النووي مجانية على الفور إلى الجليد.
في أنبوب منفصل، مزيج 25 ميكرولترات من مزيج PCR، واثنين من لترات صغيرة من الجيش الملكي النيبالي PCR التمهيدي، واثنين من لترات صغيرة من مؤشر RNA PCR التمهيدي، و 8.5 ميكرولترات من المياه الحرة للرنا. إضافة 37.5 ميكرولترات من هذا المزيج إلى 12.5 ميكرولترات من محول CDNA ربط. نقل أنبوب إلى دورة الحرارية التي تم تسخينها إلى 98 درجة مئوية.
برنامج دورة الحرارية كما اقترح في بروتوكول الشركة المصنعة مع عدد دورة معدلة إلى 15. بعد الانتهاء، والحفاظ على العينة في درجة حرارة أربع درجات مئوية. استمر أو اخزن عند درجة مئوية سالبة 80 لاستخدامها في المستقبل.
لتنقية الحمض النووي المجاني المُلّق، أضف عشرة ميكرولترات من صبغة تحميل الحمض النووي إلى كل عينة حمض نووي مجانية. وإلى عشرة ميكروليتر من هذا الأخير القرار عالية والعرف RNA الأخيرة. تشغيل 30 ميكرولترات من كل عينة في اثنين من الممرات منفصلة المجاورة لبعضها البعض في هلام بولياكريلاميد TBE ستة في المئة.
مع العرف RNA الأخير ودقة عالية، والمساحة المتوسطة بين العينات مختلفة اثنين. تشغيل الجل في واحد X TBE العازلة في 145 فولت لمدة 30 إلى 40 دقيقة تقريبا. تتبع الجبهة الزرقاء السفلى من صبغة التحميل.
وقف الكهرباء عندما يقترب من الجزء السفلي من هلام. نقل الجل في واحد X TBE العازلة مع 5 ميكروغرام لكل ملليمتر بروميد الإتهيديوم. تصور الجل في transilluminator وقطع هلام على وجه التحديد بين الزوج قاعدة 145 وعلامات الزوج قاعدة 160 وأعلى قليلا من علامة زوج قاعدة 145 لتجنب التلوث مع غمة محول.
خطوة حاسمة هي تنقية CDNA الربط التي تتم عن طريق قطع هلام على وجه التحديد كما تمايم محول تشغيل تفقد جدا للعلامة التجارية المطلوبة. نقل القطع هلام إلى أنابيب كسر الحمض النووي أبقى في أنابيب جمع اثنين ملليمتر. تدور في 20 ألف مرة G لمدة دقيقتين.
وإضافة ثلاثمائة لتر صغير من المياه الخالية من RNase والسماح لها بتدوير بلطف على الروك بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. لتنفيذ هطول الحمض النووي في اليوم التالي نقل محتويات الأنبوب إلى 5 ميكرون أنابيب التصفية. تدور 600 مرة G لمدة عشر ثوان بدقة.
ثم إضافة اثنين microliters من الجليكوجين thirty microliters من ثلاثة خلات الصوديوم الضرس، 1X بيليه الطلاء، و 975 ميكرولترات من الإيثانول 100 في المئة إلى الحمض النووي مائل. تدور في 17،000 مرات G في 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. تجاهل المابير و إضافة 75 في المئة الإيثانول لغسل بيليه.
بعد الغزل في 17 ألف مرة G في أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق تجاهل supernatant واحتضان الأنابيب في 37 درجة مئوية على كتلة حرارية تتبخر تماما الإيثانول. إعادة تعليق بيليه مع 12 ميكرولترات من 10 ملليمولار tricider كلوريد في PH 8.5. المقبل إجراء فحص جودة المكتبة عن طريق تخفيف الحمض النووي المنقى والمجانى عشر مرات واستخدام ميكرولتر واحد من CDNA المخفف لتشغيل على bioanalyzer.
تأكد من أن حجم منتج الحمض النووي المجاني يتوافق مع نطاق الحمض النووي الريبي الصغير في المخطط الكهربائي بين 136 و160 زوجًا أساسيًا. حساب إجمالي ال molarity لكل عينة. تطبيع كل عينة إلى 2 نانوموللار باستخدام هيدروكلوريد ثلاثي في PH 8.5.
عقد المكتبات عن طريق خلط وحدات التخزين على قدم المساواة من كل عينة نانومولر اثنين في واحد 200 ميكرولتر PCR أنبوب. التشويه والتسلسل التاليين للخطوات كما هو موضح في المخطوطة. في هذه الدراسة تم إعداد المكتبة بعد عزل الحمض النووي الريبي وتم إجراء فحص الجودة.
حجم المنتج للمحول Rnase الصغرى ربط تتوافق مع حوالي 136 إلى 160 أزواج قاعدة لكل عينة. تظهر الأقسام البارزة مدى الجل الذي تم استئصاله بدقة لمكتبة الحمض النووي الريبي الصغيرة لإعداده. يُظهر هذا الشكل الهلام الكهربائي والكتروفيري لمكتبة الحمض النووي المجانية المنقية.
تشريح micro أنسجة FFPE والمصل المشتق EV. المقاييس التمثيلية من سلسلة RNA صغيرة توضح الكثافة العنقودية المتوقعة ، نقاط Q ، نسبة تصفية تمرير الكتلة ، ومعدلات الغلة والخطأ المقدرة للأنسجة FFP التشريحية الدقيقة والمصل المشتق EV. وأظهرت درجة Q في كلتا العينتين قيمة أعلى من ثلاثة تشير إلى 99.9 في المئة من دقة المكالمة الأساسية.
وكانت معدلات الخطأ كلها أقل من واحد. وينبغي تنفيذ كل خطوة في إعداد المكتبة بعناية وينبغي نقل الأنابيب على الفور إلى الجليد بعد كل حضانة. وهناك خطوة حاسمة في البروتوكول هو قطع هلام على وجه التحديد لضمان أن يكون لديك محول DIMER مكتبة CDNA الحرة والنقية.
يتطلب إنشاء مكتبة CDNA التحسين لتشغيل تسلسل عالي الجودة. فهم هذا البروتوكول سوف تساعد المشاهدين في استقراء هذه التفاصيل الدقيقة إلى غيرها من التحضير مكتبة التسلسل من عينات مصدر محدود تشير إلى المصل والحويصلات خارج الخلية. وقد ساعدتنا هذه التقنية في تحديد ميكروز الجديدة التي ترتبط العدوانية الأورام ومقاومة العلاج في مرضى سرطان البروستاتا النقيلي.
يمكن استقراء هذه التقنيات لأنواع الأمراض الأخرى التي يمكن أن تساعد في اكتشاف العلامة الحيوية Novel. وبما أن هذه التقنية تستخدم مواد بيولوجية مثل عينات مصل الأنسجة والزقاق المشتقة، ينبغي اتخاذ الاحتياطات المناسبة. وعلاوة على ذلك، فإن بروميد الإثيديوم مادة مسرطنة معروفة وينبغي معالجتها بعناية فائقة باستخدام هذا البروتوكول.
