دراسة كيفية تنظيم الميكروبات التركيب الكيميائي للbilayers الفردية سوف أبلغ معرفتنا بآليات القتل بالمضادات الحيوية، ومقاومة مضادات الميكروبات ومرض pathogenesis. هذه التقنية تقسم غلاف الخلية من البكتيريا السالبة الغرام إلى كسرين محددين دون استخدام المنظفات. لذلك، يمكن تقييم الدهون والبروتينات والسكريات في بيئة شبه أصلية.
بعض الخطوات تعتمد على الوقت وتتطلب التركيز والتنسيق. في البداية، استخدم عينة أو اثنتين. عندما يزيد مستوى الراحة للمرء، يمكن إضافة المزيد من العينات.
ولا ينبغي معالجة أكثر من ست عينات في وقت واحد. هذا هو إجراء لعدة أيام ونقاط التفتيش البصرية مفيدة لتقييم فعالية والخطأ. قبل تنفيذ هذه الخطوات النهائية في بعض الأحيان.
خط البكتيريا من الأسهم المجمدة الجلسرين على لوحات أجار الطازجة. بمجرد تطوير المستعمرات، وتخزين لوحات في أربع درجات مئوية. استخدام مستعمرة واحدة لتلقح أنبوب خمسة ملليلتر مليئة وسائل الإعلام مرق والثقافة البكتيريا كما هو مطلوب بين عشية وضحاها.
مرة أخرى تمييع الثقافة البكتيرية بين عشية وضحاها في لتر واحد من وسائل الإعلام مرق المفضل واحتضان القارورة. عندما يتم تحقيق الكثافة البصرية المطلوبة، وإزالة القارورة من الحاضنة ووضعها على الجليد. قياس الكثافة البصرية للثقافة في 600 نانومتر وحساب حجم الثقافة التي تعادل ما بين ستة وثماني مرات 10 إلى الحادي عشر مستعمرة البكتيريا تشكيل وحدات.
أضف هذا الحجم من الثقافة إلى أنبوب الطرد المركزي وتأكد من أن الثقافات المتبقية تبقى على الجليد حتى يتم استخدامها. بيليه البكتيريا عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقائق ina زاوية ثابتة، والطرد المركزي عالية السرعة في 7، 000 إلى 10، 000 مرات G وأربع درجات مئوية. بعناية طهر المابير وتجاهله.
Resuspend كل بيليه الخلية في 12.5 ملليلتر من العازلة A.إضافة شريط ضجة المغناطيسي إلى تعليق الخلية. إضافة 180 ميكرولترات من 10 ملليغرام لكل ملليلتر lysozyme إلى كل resuspension الخلية. بعد جمع البكتيريا المعالجة lysozyme EDTA عن طريق الطرد المركزي ، قم بسرعة بإضافة مثبطات البروتياز وكلوريد المغنيسيوم والنيوكلاز إلى البكتيريا وتجميل الخلايا بسرعة في Buffer B.Stir لمدة دقيقتين ، مع الحفاظ على التعليقات على الجليد.
بعد ذلك، أضف 12.5 ملليلتر من محلول EDTA 1.5 ملليمولار لكل خلية إعادة تعليق والاستمرار في التحريك على الجليد لمدة سبع دقائق إضافية. decant التعليقات في أنابيب مخروطية 15 ملليلتر. الطرد المركزي تعليق في 9، 000 إلى 11، 000 مرات G لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية.
تخلص من المواد الخارقة في حاوية نفايات الخطر الحيوي واحتفظ بالكريات على الجليد. إضافة 25 ملليلتر من المخزن المؤقت B إلى كل بيليه الخلية. ثم، إضافة 55 ميكرولتررس من كلوريد المغنيسيوم الضرس واحد، ميكرولتر واحد من rnase / dnase / nuclease الكاشف وميكر واحد من كوكتيل مثبطات البروتياز.
resuspend الكريات في الخليط. بقوة ماصة ودوامة حتى الحلول تبدو متجانسة. تخزين التعليقات على الجليد.
صب العينة في الاسطوانة عينة المهيجين وتقديم الخلية إلى 20،000 PSI. لتجنب الهباء الجوي من مسببات الأمراض، شرط الجهاز المضغوط في المخزن المؤقت B وضبط مستويات الضغط قبل إضافة تعليق البكتيرية. إشراك خلية الضغط والتلميح 10 ملليلتر من العازلة B كإجراء وقائي.
جمع الخلية في أنابيب مخروطية 50 ملليلتر على الجليد مع الحفاظ أيضا على عينات الجليد. لتحقيق التحلل الكامل ، كرر هذه العملية ثلاث إلى خمس مرات. ل بيليه المتبقية، سليمة، والمواد الخلوية، الطرد المركزي العينات البكتيرية lysed في 6، 169 مرات G وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
توزيع المواد العملاقة التي تحتوي الآن على الأغشية المتجانسة، في زجاجات البولي للطرد فائقة المركز. فائقة التركيز lysates الخلية في 184، 500 مرة G وأربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل. تجاهل supernatants والاحتفاظ الكريات الغشاء على الجليد.
باستخدام الزجاج، Dounce التجانس، resuspend الكريات الغشاء في ملليلتر واحد من محلول التدرج sucrose isopycnic منخفضة الكثافة. ثم، استخدام الزجاج، ماصة باستور لنقل التجانس العينة إلى أنبوب microcentuge 1.5 ملليلتر ووضع الأنبوب على الجليد. لتحضير تدرج السكروز، أمسك أنبوبًا مفتوحًا مكشوفًا جدًا أو أنبوبًا مفتوحًا جدًا في وضع مائل قليلاً.
إضافة ببطء مليلتر من محلول السكروز أعلى كثافة. ثم إضافة أربعة ملليلترات من محلول السكروز أقل كثافة. عند إعداد تدرج الكثافة، أضف محلول السكروز ببطء لتجنب خلط الطبقات.
وينبغي أن تكون طبقات السكروز مرئية قليلا وتظهر محددة بشكل عام. بعد ذلك ، أضف الكسر الكلي للغشاء الذي تم إعادة الاعتماد عليه سابقًا في ملليلتر واحد من الكثافة المنخفضة ، محلول السكروز ال isopycnic. وأخيرا، ملء ما تبقى من الأنبوب بإضافة ما يقرب من ستة ملليلتر من الكثافة المنخفضة، محلول التدرج sucrose isopycnic.
فائقة التركيز طرد العينات باستخدام الدوار دلو يتأرجح في 288، 000 مرات G وأربع درجات مئوية لمدة 16 إلى 23 ساعة. قطع نهاية قبالة تلميح P1000 ماصة حوالي خمسة ملليلتر من هذه النقطة. بعد اكتمال الطرد المركزي، استخدم الماصة لإزالة الطبقة العلوية البنية من الأنبوب.
نقل هذه الطبقة، التي تحتوي على جزء الغشاء الداخلي، إلى زجاجة البولي للطرد فائقة التركيز. ترك حوالي مليلتر من محلول السكروز فوق الواجهة بين السكروز 53٪و 73٪ سكروز لضمان أن الجزء السفلي من الغشاء الأبيض الخارجي لا يعبر تلويث جزء الغشاء الداخلي. مرة أخرى باستخدام طرف P1000 ماصة مع نهاية إزالتها، وإزالة طبقة الغشاء الخارجي ونقله إلى زجاجة البولي.
ملء الفراغ المتبقي من زجاجة البولي مع العازلة تخزين غشاء معزولة ومزيج عن طريق عكس أو pippetting. احتفظ بالعينات على الجليد. لجمع الأغشية، طرد زجاجات البولي في 184، 500 مرات G وأربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة.
وأخيرا ، والتخلص من كبرى وإضافة 500 إلى 1 ، 000 ميكرولترات من المخزن العازلة. إعادة تعليق الأغشية عن طريق التجانس Dounce. جمع العينات في اثنين ملليلتر microcentrifuge أنابيب.
تم كشط الكريات الغشاء الكلي، Dounce متجانسة و ultracentrifuged على التدرجات كثافة السكروز لفصل الأغشية الداخلية والخارجية. وكان تدرج كثافة السكروز بنسبة 20٪ 53٪73٪ كافياً لتقسيم بعض السلالات البكتيرية. ولكن ليس لتقسيم A.baumannii التي تم تقسيمها بنجاح باستخدام 20٪ 45 ٪ 73 ٪ التدرج.
لتقييم كفاءة الفصل، تم اختبار عينات غشاء لdhydrogenase NADH، وهو إنزيم يقع في الغشاء الداخلي البكتيري. انخفاض في الكثافة البصرية في 340 نانومتر يشير إلى وجود الانزيم. تم قياس الكثافة البصرية ل50 ميكروغرام عينات من كسور الغشاء الداخلي والخارجي من نوع البرية S.typhimurium، E.coli K12 DH5a وgale متحولة S.typhimurium.
أضيف تركيز أعلى من البروتين عند تحليل نقاء كسور غشاء A.baumannii لأن الفحص الأولي باستخدام 50 ميكروغرام يشير إلى أن المستويات النسبية من dehydrogenase NADH كانت أقل بالنسبة لـ A.baumannii من السلالات البكتيرية الأخرى. لتقييم التلوث المتقاطع لكسور الغشاء الداخلي مع كسور الغشاء الخارجي، تم استخراج LPS و LOS وتصور. تم تحميل المقتطفات على هلام بولياكريلاميد وملطخة برو كيو الزمرد 300.
Acinetobacter baumannii هو أولوية قصوى ، متعددة الأدوية المقاومة ، مسببات الأمراض البشرية. وينبغي أن يساعد هذا البروتوكول الباحثين في فهم أدوار lipooligosaccharides، فوسفوليبيدات وبروتينات الدهون في آليات المقاومة والفوعة من هذا الممرض فريدة ومهمة. هذه الطريقة مثالية لتحليل المصب من الفوسفوليبيدات، الكربوهيدرات الجليجليبيدس، والبروتينات والجزيئات الصغيرة التي توجد عادة داخل الأغشية المزدوجة من البكتيريا السلبية الغرام.
