هنا نقدم بروتوكول قوي للكشف عن البكتيريا داخل أنسجة المثانة الخزعة، والتي لها تطبيقات واسعة على العديد من أنواع الأنسجة حيث يشتبه في وجود البكتيريا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها غير متحيزة. وهو يسمح للباحث للكشف عن البكتيريا داخل الأنسجة دون معرفة مسبقة من الأنواع البكتيرية الموجودة.
قد تساعد هذه التقنية في تحديد ما إذا كانت البكتيريا قد غزت جدران المثانة للنساء المصابات بعدوى المسالك البولية المتكررة وإعلام الخيارات العلاجية مثل اختيار المضادات الحيوية المخترقة للأنسجة. في حين أن مصممة للأنسجة المثانة، يمكن تطبيق هذه التقنية على نطاق واسع على الأنسجة الأخرى مع السكان البكتيرية المقيم مع الحد الأدنى من التحسين. الأفراد الذين هم جديدة لهذه التقنية قد النضال مع وضع coverlip والتصوير.
التركيز على تحسين وضع الأغطية للحد من الفقاعات وممارسة التصوير على عينات غير الثمينة. المساعدة في إثبات هذا الإجراء سيكون جاشكاران غادفي، طالب دراسات عليا في مختبري. لبدء هذا الإجراء، تنظيف غطاء دخن فارغة أو مجهزة بشكل مناسب مجلس الوزراء السلامة البيولوجية مع 70٪ الإيثانول.
إعداد كافة المخازن المؤقتة الضرورية والكواشف كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد ذلك، تنظيف خمس جرار كوبلين مع 70٪ الإيثانول والسماح للجران الجافة. عندما تكون الجرار جافة، قم بتسميةها كما هو موضح هنا وملءها بـ 100 ملليلتر من الحل المناسب.
في غطاء الدخان، ضع منزلتين لكل خزعة في رف شريحة عمودي. ضع رف الشريحة العمودي في جرة Xylenes 1 كوبلين لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، قم بإزالة رف الشريحة من الجرة ولطخة الجزء السفلي على منشفة ورقية لإزالة الزيلين الزائد.
ضع الحامل في جرة Xylenes 2 لمدة 10 دقائق. ثم إعادة هيدرات أقسام الأنسجة دي paraffinized في يغسل الإيثانول المتعاقبة لمدة 10 دقائق لكل من. عندما تكون الغسلات كاملة، لطخة الجزء السفلي من رف الشريحة على المناشف الورقية لإزالة الإيثانول الزائد ووضع الرف في جرة كوبلين التي تحتوي على 100 ملليلتر من تصفية معقمة، والمياه المقطرة مزدوجة لمدة 10 دقيقة.
خلال هذا الغسل، تمييع المسابير إلى 10 نانوموللار في العازلة التهجين لإنشاء حل تلطيخ، مع التأكد من إعداد 150 ميكرولترات من حل تلطيخ لكل شريحة. إعداد غرفة الترطيب لكل مسبار عن طريق إضافة غارقة، تكوم مهمة حساسة مسح والمياه المعقمة إلى خزان من صندوق تلميح P1000. ضع خرطوشة حامل التلميح في الأعلى حيث ستجلس الشرائح.
عند الانتهاء من الغسيل النهائي، قم بإزالة الشريحة من رف الشريحة ووضعها على منشفة ورقية جديدة، وجانب الأنسجة. استخدام مهمة حساسة مسح لتجفيف الشريحة، مع الحرص على الداب بلطف فقط بالقرب ولكن ليس على قسم الخزعة للفتيل بعيدا الماء. باستخدام قلم مُهدّم، قم برسم حد حول قسم الخزعة ووضع جانب نسيج الشريحة في غرفة الترطيب.
بعد ذلك، ضع غرفة الترطيب في حاضنة تعيين إلى 50 درجة مئوية. ما بين 50 و 150 ميكرولترات من حل تلطيخ مباشرة على الجزء العلوي من الأنسجة بحيث المستطيل الذي أدلى به الحدود المائية حول الأنسجة يتم تعبئة وإغلاق مربع بلطف. احتضان بين عشية وضحاها في 50 درجة مئوية في الظلام.
إذا كانت الحاضنة لديها نافذة، وتغطية ذلك بخرق الألومنيوم الطرافة لخلق بيئة مظلمة. في صباح اليوم التالي، قم بإزالة الشرائح من غرف الترطيب وإبعاد أي حل تهجين متبقي مع مسح مهمة حساسة. ثم ضع الجانبين في رف تلطيخ عمودي.
ضع رف التلوين في جرة كوبلين ملفوفة رقائق الألومنيوم تحتوي على 100 ملليلتر من عازلة الغسيل قبل الدافئة لمدة 10 دقائق. كرر هذه الخطوة غسل مرتين أكثر مع عازلة غسل الطازجة في الجرار كوبلين جديدة. خلال هذه الخطوات غسل، وإعداد وصمة مضادة عن طريق تمييع محلول الأسهم من Hoechst 33342 في عازلة غسل، بنسبة واحد إلى 1000.
إلى نفس الأنبوب، أضف أليكسا-555 جرثومة القمح agglutinin إلى تركيز نهائي من خمسة ميكروغرام لكل ملليلتر واليكسا-555 فالويدين إلى تركيز نهائي من 33 نانوموللار. تخزين في الظلام حتى جاهزة للاستخدام. عندما يتم الغسل النهائي، وإزالة الشرائح من جرة كوبلين وفتيل بلطف بعيدا أي العازلة غسل الزائدة مع مسح مهمة حساسة.
وضع الشرائح الأنسجة الجانب على منشفة ورقية وإضافة ما بين 50 و 150 ميكرولترات من وصمة مضادة مباشرة على رأس الأنسجة بحيث يتم تعبئة الحدود المائية، ولكن لا تفيض. غطي ما يصل إلى أربع شرائح مع أعلى صندوق التبريد واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، ضع الشرائح مرة أخرى في رف التلوين وغسلها مرتين أكثر في جرار كوبلين التي تحتوي على عازلة غسيل طازجة، مع كل غسل دائم 10 دقائق.
ثم يجف جيدا الشرائح ووضعها الجانب الأنسجة حتى على منشفة ورقية تحت أعلى cryobox. الضغط على قطرة واحدة من تصاعد وسائل الإعلام مباشرة على رأس الأنسجة ووضع بلطف coverslip الحجم المناسب على القمة. اضغط بلطف على أي فقاعات والسماح للشرائح coverlip لعلاج بين عشية وضحاها في الظلام.
في اليوم التالي، ختم حواف الأغطية إلى الشريحة مع معطف خفيف من طلاء الأظافر واضحة والسماح الجافة في الظلام لمدة 10 دقائق، قبل تخزينها في الظلام عند أربع درجات مئوية. عندما تكون جاهزة لتصوير الخزعات الملطخة ، قم بالتبديل على المجهر confocal والبرامج المرتبطة بالمجهر. ابدأ بشريحة إيجابية FISH والتبديل إلى وضع مرئي الكمبيوتر.
حدد القنوات ل 405 و 488 و 555. تعيين الثقب باستخدام أطول قناة طول موجي، والتي في هذه الحالة هو 555. ثم ابحث عن المستوى البؤري الحالي للتصور للبكتيريا المسماة في قناة 488.
دون تغيير المستوى البؤري، تعيين كسب، قوة الليزر، وعوض لكل قناة بحيث لا تكون الإشارة مشبعة والخلفية غير مصححة. الحصول على الصورة في جميع القنوات الثلاث. في هذه الدراسة، يتم الكشف عن البكتيريا المرتبطة الأنسجة في خزعات المثانة البشرية من قبل 16S rRNA FISH.
وقد تم تحسين هذا البروتوكول للكشف غير متحيزة من البكتيريا المرتبطة الغشاء المخاطي للمثانة في أقسام خزعة المثانة البارافين جزءا لا يتجزأ. يظهر هنا هي ميكروجرافات تمثيلية من تجربة باستخدام هذا البروتوكول على أقسام من خزعات المثانة التي تم الحصول عليها من النساء المصابات بالتهابات المسالك البولية المتكررة. يتم تهجين قسمين متسلسلين إما مع RRNA 16S العالمي أو تحقيقات التدافع.
صور ع مأخوذة من نفس المنطقة من الأنسجة والبكتيريا واضحة للعيان في الأنسجة المهجّنة مع تحقيقات 16S RRNA، ولكن ليست مع التحقيق التدافع. كما أن النتائج الإيجابية الكاذبة ممكنة أيضاً. في هذا ممثل إيجابية كاذبة، يتم الكشف عن إشارة المقابلة للكولاجين أو الإيلاستين ذات الفيورات في القنوات 405 و 488 في كل من 16S rRNA والتدافع مسبار أقسام خزعة هجين، وتسليط الضوء على أهمية استخدام دائما التحكم في التحقيق التدافع.
لمنع تبييض الصور، تقليل تعرض الأنسجة للضوء بعد تطبيق المسابير. في حين أن هذه التقنية تسمح للكشف غير المتحيزة من البكتيريا في الأنسجة البشرية، فإنه لا يعطي معلومات محددة الأنواع. يمكن استخدام متعددة الأسماك مع مسابير محددة التصنيف لتحديد جنس أو الأنواع الموجودة.
قبل أن يتم تطوير هذه التقنية ، لم يكن قد ثبت من قبل أن البكتيريا يمكن أن تغزو جدار المثانة من مرضى التهاب المسالك البولية البشرية المتكررة. ونحن نستخدم الآن جنس وأجناس محددة تحقيقات لتحديد الأنواع البكتيرية الموجودة. يجب استخدام Xylenes في غطاء الدخان بسبب سميتها.
يجب الحرص على عدم النظر مباشرة في الليزر أثناء التصوير. يجب إيقاف تشغيل الليزر أثناء وضع الشريحة تحت الهدف.
