سوف CRISPR / Cas9 تحرير الجينات في الأسماك الكهربائية ضعيفة ، لا سيما في سياق مقارن ، وتمكين الباحثين لاختبار الفرضيات حول كيفية الجينات المحددة والتباين الجينية تسهم في الاختلاف الظاهري. CRISPR/Cas9 هي طريقة فعالة لتوليد الأجنة المتحولة F-صفر. يسمح هذا البروتوكول للباحثين بإجراء تلاعبات CRISPR-Cas9 في نوعين متطورين بشكل متقارب من الأسماك الكهربائية الضعيفة.
ومفتاح استخدام هذا النهج مع إدخال بعض التعديلات على الأسماك الكهربائية الأخرى أو الأنواع الأخرى من الأسماك هو توافر الموارد المستنسخة أو الجينومية لصنع الـ sgRNAs. يمكن أن يكون من الصعب إجراء الحقن المجهري وتصور الخلايا في موقع ثلاثي الأبعاد داخل مستوى 2D. الحصول على مستعمرة صغيرة حمار وحشي للبيض لممارسة تقنيات الحقن المجهرية العامة.
إثبات الإجراء مع سافاس كونستانتينو سيكون جاريد طومسون، وهو فني من مختبري. بعد إسكان أنواع الأسماك ذات الأهمية في ظل ظروف التربية المناسبة، وتحديد الأسماك الإناث التي تظهر gravid. في (بي غوديريو)، سيكون لدى الأنثى تورم الغدد التناسلية فقط في فتحة التهوية.
في B.brachyistius الإناث سوف يكون البطون منتفخة وتبدو عميقة الجسم. بعد التخدير، إضافة عامل تفريخ إلى أربعة أضعاف حجم DPBS في أنبوب PCR مع خلط شامل. الحل سوف تصبح غائمة.
استخدام ماصة لقياس الجرعة المحسوبة والاستغناء عن وكيل المخفف unto قطعة من البلاستيك الحراري قبل سحب الحل في حقنة الزجاج الدقة مجهزة 28 قياس 19 إلى 25 ملليلتر طول إبرة مشطوفة. حقن الحل في العضلات الجذع الظهرية بمعدل سلس والسماح للإبرة الجلوس لمدة 2-4 ثوان قبل الإزالة. ثم، على الفور وضع الأسماك في المياه النظام العذبة للانتعاش.
لجمع الحيوانات المنوية B.gauderio، بعد 24 ساعة، حدد سمكة كبيرة الذكور وبأسرع وقت ممكن بعد التخدير، وتجفيف الأسماك جيدا، وخاصة حول الرأس وتنفيس. وضع الجانب البطني الأسماك المجففة حتى, أمام اليسار في حامل المناسبة, مغطاة في منشفة ورقية رطبة غارقة MS222 مع الرأس بالتوازي مع الجدول قدر الإمكان. تطبيق الضغط فورا في السد إلى اتجاه المرسخ مع الضغط على الفور الضوء على الرناد نحو تنفيس واستخدام micropipetter مع طرف، وجمع بعناية الحيوانات المنوية كما هو تقلص من الذكور في زيادات 50 ميكرولتر.
إضافة aliquot من الحيوانات المنوية مباشرة على 500 microliter كميات من الحيوانات المنوية الموسع الحل على الجليد. مباشرة بعد جمع، ووضع الأسماك في حماية اللورة معطف المياه المعالجة المنتج نظام طازج. لجمع البيض B.gauderio، بعد تجفيف سمكة أنثى B.gauderio تخدير، على الفور وضع الأسماك على جانبها مع الرأس التي تواجه اليد غير دومينانت وتطبيق الضغط في السد إلى الاتجاه الرسترالي مع ضوء الضغط medially على السناد نحو تنفيس.
باستخدام أداة البوليتيترافلورو الإيثيلين، وجمع بعناية البيض كما يتم ضغطها من كلواكا ووضع البيض بسرعة في طبق بيتري مغطاة صغيرة. إذا كان العمل وحده بعد الضغط، لمس كتلة البيض إلى قاعدة طبق بيتري الصغيرة كما يتم طردهم من الأنثى. مباشرة بعد جمع البيض، ووضع الأسماك في حماية من اللوين معطف المنتج المعالجة المياه النظام الطازج.
بالنسبة لـ B.gauderio في الإخصاب في المختبر، أضف 100 ميكرولترات من محلول SES المختلط بشكل جيد للحيوانات المنوية مباشرة فوق كتلة البويضة، تليها ملليلتر واحد من مياه النظام العذب. اخلطي تعليق الأماشعة جيدًا لمدة 30 إلى 60 ثانية قبل إضافة ملليلتر إضافي من 0.22 ميكرومتر مصفّح من مياه النظام إلى الخلايا. ضع الطبق مع وقت الإخصاب في المختبر ووضع الطبق في حاضنة درجة مئوية 29 ، ووضع مؤقت لمدة 50 دقيقة للتحقق من تقدم التطوير.
خلال فترة الإخصاب، استخدم طرف ماصة microloader لتحميل حمولة 2 microliters من محلول الحقن من الفائدة في إبرة الحقن المجهري وطرد السائل أقرب إلى طرف ممكن. عندما تكون خلية واحدة في القطب الحيواني من خلية واحدة على الأقل، نقل الطبق تحت مجهر تشريح واستخدام زوج من ملقط غرامة لكسر طرف إبرة في زاوية مشطوفة نحو حيث يبدأ تفتق الإبرة لإثبات صلابة. وينبغي أن تتحمل من الإبرة تبقى صغيرة قدر الإمكان مع الحفاظ على تفتق جامدة.
تحديد zygotes النامية تحت المجهر واستخدام ماصة نقل البلاستيك مع قطع تلميح لوضع 10 إلى 20 بيضة في أقل قدر ممكن من الماء على حافة شريحة المجهر الزجاجي المنصوص عليها في الجزء العلوي المقلوب من طبق بيتري. باستخدام مسح مهمة حساسة، اضغط بلطف على الشريحة لإزالة المياه الزائدة للسماح للبيض بالتمسك بقوة بحافة الشريحة. وسوف يكون الماء الأشرار تحت الشريحة وسحب البيض ضد الحافة.
يجب أن يكون هناك ما يكفي من الماء فقط للحفاظ على البيض رطبة مع الحفاظ على القليل من الرطوبة الدائمة لتجنب حركة البيض أثناء الحقن. محاذاة البيض ضد الشريحة عموديا، عمودي على إبرة تقترب، واستخدام micromanipulator لوضع الإبرة ضد المشيمية. ثم، عقد الإبرة في زاوية 45 درجة تقريبا، وإدراج طرف الأولى في chorion ومن ثم، في خلية واحدة، وحقن من خلال صفار إذا كان ذلك ممكنا.
إزالة أي البيض المكسور أثناء الحقن مع ملقط غرامة. عندما تم حقن كل من البيض، واستخدام زجاجة بخ من 0.22 ميكرومتر المسام تصفية المياه النظام لطرد بلطف البيض من مرحلة الحقن في طبق بيتري جديد قطره 100 ملليمتر. بعد اختيار RNAs دليل قصير ناجح والتوليف، يمكن اختبار الانقسام في المختبر لاختيار لصغر الخلايا واحدة.
بعد PCR تنظيف والاستنساخ، في هذه التجربة التمثيلية، تم تحديد الطفرات المستحثة CRISPR-Cas9 في استنساخ B.gauderio و B.brachyistius الفردية مع انخفاض سعة التفريغ الكهربائي للأعضاء القوي، في حين أن الضوابط غير المحددة المعروضة فقط الأنماط الجينية المشار إليها. التصور من سعة تصريف الأعضاء الكهربائية بين المسوخ كريسبر وأكد وحجم وكيل مطابقة الضوابط غير مفككة أظهرت أن كلا SCN-4 AA متحولة B.brachyistius وأجنة B.gauderio كان أقل بكثير من نطاقات تصريف الجهاز الكهربائي من الضوابط. عند إجراء الحقن الدقيقة، تحرك بأسرع وتعمد قدر الإمكان لزيادة عدد الأجنة المحقونة أحادية الخلية التي تبقى على قيد الحياة.
لا تضيع الوقت مع البيض الصعب. وبمجرد تحديد المسوخ الناجحة، يمكن لطرق التربية التقليدية أن تخلق خطوطاً متحولة مستقرة، مما يقضي على المخاوف المتعلقة بالفسيفساء المرتبطة بالفسيفساء. وسيتيح هذا البروتوكول للباحثين إجراء دراسات جينية مقارنة مع التحقق الوظيفي في نوعين من الأسماك الكهربائية المتطورة بشكل متقارب.
