النقش الدقيق هو أداة قوية جدا لأنه يسمح لدراسة الاستجابات الخلوية لتحديد الإشارات الكيميائية الحيوية والفيزيائية الحيوية التي تواجهها الخلايا في الكائنات الحية. على النقيض من الأساليب الأخرى، يتم وصف أكثر مرونة لإنشاء نمط. على سبيل المثال، فإنه يسمح بإنتاج التدرجات وأنماط صغيرة من البروتينات المتعددة مع قابلية التكاثر العالية.
تستخدم مجموعتنا ليماب ليس فقط لدراسة المسارات العصبية، ولكن أيضا كيف تستجيب الخلايا الأخرى للإشارات التي لها تأثير على انتشار الخلايا، والتمايز، والهجرة. يستخدم النقش الصغير للإجابة على الأسئلة الأساسية في بيولوجيا الخلايا. ويمكن استخدام المعرفة المكتسبة لتعديل الأجهزة الموجودة في الطب التجديدي، على سبيل المثال، إصلاح الأعصاب بعد إصابة الأعصاب الطرفية.
تبدأ من خلال تصميم قوالب للنقش على برنامج الرسم الرقمي. حدد حجم صورة 1، 824 بكسل في الطول و 1، 140 بكسل في العرض. تصميم القالب، وحفظ القالب كملف TIFF 8 بت.
قبل النقش، وتنظيف وتنشيط السطح مع نظافة البلازما باستخدام ضغط عملية من 1، 000 إلى 1، 300 ملليتور وقوة 29.6 واط لمدة دقيقة إلى خمس دقائق. استخدم طبقًا زجاجي القاع بحجم بئر داخلي 20 ملليمترًا وسمك الزجاج من 0.16 إلى 0.19 ملليمتر. حدد إما طبقًا من ستة بئرين أو طبقًا واحدًا ، اعتمادًا على عدد الحالات التي يتم اختبارها.
قص الإستنسل PDMS تحت ظروف معقمة لضمان أنها تناسب في قاع الزجاج الداخلي جيدا. إزالة حشوات microwell الداخلية مع ملقط العقيمة، والتمسك الاستنسل على الزجاج جيدا. إعداد 0.1 ملليغرام لكل ملليلتر PLL-PEG حل في برنامج تلفزيوني، وإضافة 20 ميكرولترات لكل ميكروويل.
ثم، احتضان الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد الحضانة، وإزالة 15 ميكرولترات من PLL-PEG من كل بئر، وغسلها خمس مرات مع 20 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني دون السماح لها الجافة. إعداد microwell واحد لخلق نمط مرجعي عن طريق إزالة 18 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني من بئر واحد وإضافة خمسة microliters من الضوئيات، وترك برنامج تلفزيوني في microwells المتبقية.
ثم، استخدم أداة تمييز الفلورسنت لوضع علامة على بئر زجاجي داخلي فارغ. وضع جيدا فوق الهدف، وضبط التركيز الهدف حتى شعار PRIMO وشعار شعار رعاية الخلايا الخاصة بك"هي في التركيز. ثم، تسجيل موقف Z من المستوى البؤري.
لإنشاء نمط مرجعي، تصور حافة microwell مع ضوئي باستخدام الضوء المنقولة من خلال الكاميرا، واختيار رمز العائد على الاستثمار من القائمة اليمنى. حدد PRIMO لتحميل قالب النمط المطلوب، والذي سيتم إسقاطه على عائد الاستثمار كوحدة تصميم. انتقل إلى منطقة محيطية من microwell، حدد قفل، وضبط التركيز إلى موضع Z للمعايرة.
ثم حدد تشغيل لبدء تشغيل النقش المرجعي. غسل نموذج صغير المرجع ثلاث مرات مع 20 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني لإزالة الضوئيات. ثم، إضافة 20 ميكرولترات من المصفوفة الفلورية المسمى خارج الخلية، أو ECM، حل البروتين.
احتضان الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 إلى 20 دقيقة، مع التأكد من حماية المرجع جيدا من الضوء. بعد الحضانة، وإزالة 18 ميكرولترات من محلول البروتين، وغسل البئر ثلاث مرات مع 20 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني. استخدام مجهر epifluorescence لتصور نمط المرجعية.
ضبط التركيز على حواف النقش من خلال مسار الكاميرا، وسجل موضع Z وفقًا لأفضل تركيز. هذا الموقف سيكون التركيز الأمثل ليزر المستخدمة في النقش اللاحقة. في ظل ظروف معقمة، وإزالة 18 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني من جميع microwells.
إضافة خمسة ميكروليترس من الضوئيات إلى كل بئر، والتجانس عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. إذا كان نقش بروتينات متعددة في نفس microwell، تحميل جميع مجموعات من قوالب نمط المطلوب في وقت واحد. ثم حدد عدد الصفوف والأعمدة والجرعة.
حفظ تكوين القالب كملف في البرنامج. انتقل إلى المنطقة التي تم إنتاج نمط المرجع فيها، وضبط التركيز على الموضع المثالي Z. ثم، حدد تشغيل لبدء تشغيل ضوئي.
وحدات التصميم تتحول من الأحمر إلى الأزرق كما يتم الانتهاء من photopatterning. إزالة الضوئي من microwells عن طريق غسلها ثلاث مرات مع 20 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني. بعد الغسيل الأخير، وإزالة 18 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني من كل microwell، وإضافة 20 ميكرولترات من محلول بروتين ECM.
احتضان الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 إلى 30 دقيقة، مع التأكد من حمايته من الضوء. بعد ذلك، قم بإزالة 15 ميكرولترات من محلول بروتين ECM، وغسل الويلات الدقيقة ثلاث مرات باستخدام 20 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني. لمنع الربط المتبادل ، أضف 20 ميكرولترات من PLL -PEG ، أو BSA ، إلى microwells ، واحتضان الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة ، في الظلام.
ثم، إزالة 15 ميكرولترات من وكيل حجب، وغسل جميع microwells ثلاث مرات مع 20 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني. إزالة 18 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني، وإضافة 5 ميكرولترات من الضوئيات إلى كل microwell، وضمان أن الضوئيينيتات هو متجانس على سطح كامل من microwells. انتقل إلى أول ميكروويل، ثم قم بتحميل تكوين القالب المحفوظة مسبقاً.
ثم، حدد الإجراءات التي سيتم منقوشة للجولة الثانية من photopatterning، مع التأكد من إلغاء تحديد الإجراءات من الجولة الأولى. بعد photopatterning، وإزالة PLPP عن طريق الغسيل مع برنامج تلفزيوني. ثم، احتضان لمدة 20 دقيقة مع محلول بروتين ECM الثاني، وغسل microwells ثلاث مرات مع 20 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني.
استخدام مجهر epifluorescence لتصور وصورة الأنماط المطبوعة. عندما تكون جاهزة لطبقة الخلايا، إضافة ملليلتر واحد من المتوسطة مع الخلايا إلى الزجاج الداخلي جيدا، مع التأكد من تغطية جميع microwells. ووضع طبق الثقافة في 37 درجة مئوية، وحاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪.
لضمان أن الأنماط المتولدة هي تمثيل دقيق للقالب، يتم الحصول على قياسات كثافة الفلوريسنس على طول المشارب، ومن منطقة خلفية مقابلة فوق كل شريط. يتم تحقيق أنماط صغيرة محددة قابلة للاستنساخ تتراوح بين 20 إلى 2 ميكرومتر في العرض ، ولكن يمكن ملاحظة تأثير الحافة عند طباعة ميزات 20 ميكرومتر أو أوسع. يتم الحصول على تركيزات البروتين المحددة إما عن طريق احتضان مع تركيزات متفاوتة من البروتين، أو اختلاف جرعة الليزر التي تستخدم لشق الفيلم antiadhesive.
كثافة الليزر يتناسب مع مستوى الرمادي القالب، وتوليد التدرجات من الإضاءة الأشعة فوق البنفسجية. قياس ملف تعريف شدة الفلوريسين على طول شريط التدرج، هو خطي في قالب النمط، وفي نمط التدرج المولد. يمكن استخدام هذا البروتوكول لإنشاء أنماط صغيرة مع بروتينات متعددة في نفس الميكويل ، مثل الأنماط المتقاطعة مع خطوط أفقية من الليفية ، وخطوط عمودية من اللامينين.
ولكن خطوة عرقلة ضرورية لمنع ربط عبر البروتينات. ويمكن بعد ذلك أنماط عبر ولدت تستخدم لمقايس الخلوية مع خطوط الخلايا العصبية، أو خلايا CAD، أو الخلايا العصبية الأولية، DRGs الفئران. عند تنفيذ هذا البروتوكول، فإن أهم الجوانب التي يجب تذكرها هي القيام بمعايرة النظام المناسبة، وعدم السماح للميكرويات بالجفاف أثناء خطوات الغسيل المتعددة، واستخدام المعايير الصحيحة لاحتضان البروتين والحجب.
عادة ما ينطوي تحليل سلوك الخلية على المجهر ، مثل الفلوريسنس ، الفاصل الزمني ، AFM. ويمكن أن يشمل التوصيف الآخر أساليب كيميائية حيوية أخرى، مثل تحديد سمات التعبير الجيني.
