تحديد الطفرات من خلال ذوبان عالية الدقة في عدد السكان من الأرز الحرث

وسيكون من المفيد جدا لتكاثر الصفات التي يصعب تقنيا أو مكلفة لتحديدها، مثل مقاومة المرض، والمحتوى المعدني. انها بسيطة جدا ، فعالة من حيث التكلفة ، وعالية الإنتاجية التقنية. للبدء، ضع أربعة أقراص ورقة في كل بئر من لوحة PCR 96-well.

إضافة 50 ملليلتر من حل عازلة A في كل بئر. تجميد لوحة في الفريزر ناقص 80 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ثم، إلغاء تجميد لوحة في درجة حرارة الغرفة.

احتضان في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. إضافة 50 ميكرولترات من المخزن المؤقت B إلى كل بئر، ويخلط جيدا من قبل دوامة. أجهزة الطرد المركزي لوحة لمدة دقيقة واحدة في 1، 500 مرات ز.

جمع المابير كما DNA لPCR. أولاً، استخدم الحمض النووي الفائق من نموذج PCR لتحسين درجة حرارة الدنال. إضافة الكواشف وميكر واحد من الحمض النووي الفائق في كل PCR جيدا.

ضع أنابيب PCR في كتلة حرارية قابلة للتدرج، واضبط برنامج التدفئة وفقًا للمخطوطة لتحديد درجة حرارة الوَجَر المثلى لكل جزء مستهدف. تنفيذ الكهرباء للمنتج PCR على 1٪ agarose هلام لفحص amplicons. تحديد درجة حرارة القطع المثلى التي تمكن من تضخيم محدد للجزئة المستهدفة.

لإجراء تحليل HRM، والجمع بين الكواشف، بما في ذلك ميكرولتر واحد من صبغة الفلورانس 10 مرات وميكر واحد من ناظر الحمض النووي في كل بئر من لوحات HRM المتوافقة. في كل لوحة، وتشمل عينة واحدة من نوع البرية الأبوة والأمومة واحد السيطرة السلبية دون الحمض النووي. إضافة قطرة من الزيوت المعدنية إلى كل بئر لمنع التبخر.

ثم، ختم لوحة مع فيلم لاصق، والطرد المركزي في 1،000 مرات ز لمدة دقيقة واحدة. تشغيل PCR باستخدام درجة حرارة الحناء الأمثل. الآن، إزالة الفيلم لاصق من لوحة، وإدراج لوحة في آلة إدارة الموارد البشرية.

في البرنامج، حدد تشغيل جديد من قائمة الملفات، أو اضغط على الزر تشغيل في أعلى الشاشة. حدد درجات حرارة البداية والنهاية للذوبان من 55 إلى 95 درجة مئوية. حدد عينات لتحليل ذوبان عالية الدقة، واستبعاد عينات مشابهة لتحكم سالب.

تطبيع منحنيات ذوبان أن يكون لها نفس بداية وتنتهي fluorescence. يؤكد بصرياً أن مؤشرات درجة الحرارة القصوى الأدنى والأدنى هي في منطقة من المنحنيات. الحفاظ على دلتا F، الفرق من الفلوريسنس، مستوى في الإعداد الافتراضي من 05.

من قائمة تحديد المقاييس، حدد المتغير المشترك مقابل، واختر الحساسية العادية. حدد H12 لاستخدام النوع البرية كتحكم. وتعتبر العينات ذات قيمة دلتا F أكبر من 05 تحتوي على نبات متحول.

ثم، باستخدام طريقة CTAB، استخراج الحمض النووي من كل من النباتات الأربعة من بركة متحولة مع منحنى ذوبان مختلفة كثيرا عن نوع البرية. بعد القياس الكمي باستخدام مقياس الطيف، ضبط الحمض النووي مع NanoDrop 2000 إلى تركيز نهائي من حوالي 25 نانوغرام لكل ميكرولتر. إضافة 0.4 microliters من التمهيدي PCR في عينة الحمض النووي في أنابيب PCR، ووضعها في دورة حرارية، وضبط البرنامج لتضخيم جزء الهدف.

ثم، إرسال منتجات PCR إلى شركة لتسلسل. بعد تسلسل سانجر، قارن الآفة الجزيئية من خلال مقارنة التسلسلات بين مصنع M2 والنوع البري. في هذه الدراسة، أظهر مسح وتحليل شتلات M2 للطفرات في جينات OsLCT1 أو SPDT أن معظم العينات كانت لها منحنيات ذوبان لا تختلف بشكل كبير عن النوع البري مع دلتا F أقل من 05.

وأظهرت المسوخ منحنيات إدارة الموارد البشرية مختلفة بشكل كبير مع دلتا FS أكبر من 05 في درجات حرارة من 90 إلى 92 درجة مئوية و 81.5 إلى 83.5 درجة مئوية، على التوالي. تم تأكيد نوع الطفرة والموضع على الجينات من 4, 560 M2 الشتلات من قبل الكروماتوجات التسلسل. تم تحديد موقع heterozygous مع طفرة من G إلى A في 4، 304 أزواج قاعدة من OsLCT1.

واحدة من النيوكليوتيدات واحد ظهرت في 4، 240 أزواج قاعدة OsLCT1، ولوحظ حذف ثلاثي نوكليوتيد TTC في موقف 5، 948 إلى 5، 950 أزواج قاعدة SPDT. أنا أمثل PCR قبل تحليل الموارد البشرية. الصبغة في الجل هو قليلا الضارة.

تذكر أن تضع على قفازات عند تشغيل هلام.