وغالبا ما يتم تقييم عواقب الطفرات على التعبير الجيني نوعيا عن طريق التهجين في الموقع وسجل عموما بصريا، وهو أمر ذاتي ومتحيز من قبل توقعات الباحث. ويوفر هذا الأسلوب طريقة أكثر اتساقاً لمقارنة التجارب في الموقع عن طريق قياس كثافة الصورة وإزالة هذا التحيز. ويمكن أيضاً تكييف هذا الأمر بسهولة مع نظم نموذجية أخرى تستخدم التهجين في الموقع كقارئ للتعبير الجيني.
ابدأ بتصوير الأجنة المهجنة الموضعية أو الملطخة بـ ISH. إعداد محلول الجلسرول ومزجها لتجانس. نقل الأجنة إلى محلول الجلسرين مع ماصة باستور ثلاثة ملليلتر وتركها لتسوية لمدة خمس دقائق على الأقل.
إعداد وتسمية ما يكفي من أنابيب PCR لنقل الأجنة الملطخة ب ISH بعد التصوير، ثم استخدام ماصة باستور ثلاثة ملليلتر لإضافة 100٪ غليسيرول إلى الجزء السفلي من بئر من شريحة الاكتئاب الزجاج. نقل جنين واحد ملطخ ب ISH إلى الشريحة الزجاجية وتوجيهه تحت مجهر ستيريو مجهز بكاميرا رقمية وإضاءة أسفل وأعلى. باستخدام الجنين الأول، ضبط الإضاءة ووقت التعرض في التكبير المطلوب.
صورة أكبر عدد من الأجنة كما هو مطلوب وتسمية كل صورة مع عدد فريد. بعد التصوير، قم بنقل كل جنين إلى أنبوب PCR يحمل نفس العدد وإذا لزم الأمر قم بتكفير الجلسرين الزائد من أنابيب PCR. لاستخراج الحمض النووي، إضافة 40 إلى 75 ميكرولترات من عازلة التحلل القلوية مثل HoTSHOT إلى كل أنبوب.
احتضان الأنابيب في 95 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة تقريبا ثم تبريدها إلى أربع درجات مئوية. إضافة حجم مساو من العازلة تحييد والمضي قدما مع genotyping لطفرة الفائدة. لإجراء تحليل الصورة، حدد الصورة وافتحها في فيجي وقم بعكسها بالنقر فوق تحرير ثم عكس، ثم قم بتحويل نوع الصورة إلى 8 بت بالنقر فوق علامة التبويب "صورة" وتحديد الكتابة وتحديد 8 بت.
حدد أداة المضلع وارسم منطقة الاهتمام أو عائد الاستثمار يدوياً على الصورة حول المنطقة التي تحتوي على إشارة ISH التي يجب قياسها. اضغط على T لفتح مدير ROI وحدد المنطقة التي تهمك، ثم انقر على قياس. نسخ القيمة الوسط من إطار النتائج إلى جدول بيانات.
لقياس كثافة الخلفية، قم بنقل عائد الاستثمار إلى منطقة في الجنين بدون تلطيخ وانقر على إضافة في مدير عائد الاستثمار. حدد منطقة الخلفية وانقر على قياس، ثم سجل قيمة شدة المتوسط في جدول البيانات. الحصول على متوسط كثافة البيكسل لإشارة التهجين NC2 عن طريق طرح متوسط شدة الخلفية من المنطقة الملطخة.
بعد تحديد متوسط كثافة البيكسل لكل عينة، قم بتعيين نمط جيني لكل عينة. إذا لم يتم تحديد النمط الجيني، استبعاد العينة من التحليل اللاحق. فرز متوسط قيم كثافة العينة وفقاً للنمط الجيني، ثم تابع الاختبارات الإحصائية.
وقد ثبت فائدة هذه التقنية على ISH لdnmt3bb. 1 في الأجنة من runx1 هيتروزيجوس في كروس. انخفاض في dnmt3bb.
تم الكشف عن تعبير 1 في المسوخ المتجانسة runx1 المتجانسة بينما أظهرت أجنة غير المتغايرة أي اختلافات كبيرة في dnmt3bb. 1 تعبير. عند محاولة تحديد تأثير طفرة lmo4 على التعبير runx1، لم يظهر هذا التحليل اختلافات كبيرة في التعبير بين نوع البرية وهيموزيغوس lmo4 المسوخ.
ومع ذلك، تم الكشف عن انخفاض صغير في التعبير runx1 بواسطة QPCR الجنين واحد. في حوالي 0.4٪ من الأجنة runx1 مسبار، وكان ISH خلفية عالية التي أسفرت عن عدد سلبي عندما تم طرحها من الإشارة. وفي مثل هذه الحالات، استبعدت الأجنة من التحليل.
وقد تم اختبار أربع مناطق مختلفة على الأجنة لتحسين تصحيحات الخلفية. في حين كان هناك فرق مستقر نسبيا في كثافة العائد على الاستثمار في أي من المجالات الخلفية ، R3 أظهرت دائما كثافة أعلى من العائد على الاستثمار ، وينبغي عدم استخدامها لتصحيح الخلفية. وقد ثبت أن R1 وR4 أكثر المجالات ملاءمة لتصحيح الخلفية.
من المهم العثور على أفضل الظروف للتصوير والحفاظ عليها دون تغيير طوال التجربة. نوصي أيضًا بتحديد كثافة البكسل قبل تعيين النمط الجيني لكل عينة.
