Rhabdomyosarcoma هو شكل نادر من ساركوما الأنسجة الرخوة تتميز الأنسجة النسيجية من قبل مورفولوجيا الأنسجة والتعبير عن علامات ميوجيني. ومع ذلك ، بالنظر إلى وجود أنواع فرعية مختلفة من هذه الأورام وعدم تجانس المحفزات التي تساهم في تكوينها ، كان تحديد خلية المنشأ صعبًا للغاية. هنا ونحن وصف أساليب استنساخ وموثوق بها لتحديد الخلية الأصلية من rhabdomyosarcomas بدءا من أنسجة الورم الحصاد حديثا من الفئران وهذا المقايسة هو فحص تشكيل أورام.
المزايا الرئيسية للأورام تشكيل مقايسة هو أنه يعتمد على الخصائص الخلوية التي من المعروف أن تكون موجودة في الخلايا التي تنشأ الورم ويمكن أيضا أن تستخدم لتوسيع وإثراء سكان الخلايا المحددة. وعلاوة على ذلك، هيكلها spheroid تقليد بيئة الورم، وبالتالي يمكن استخدامها كدراسات فحص المخدرات. هذه الطريقة لديها القدرة على تطبيقها على أنواع أخرى من الأورام لأنها لا تتطلب معرفة مسبقة من علامات الجزيئية ولكن قد تتطلب تحسين ظروف الثقافة.
قد يستغرق الورم بعض الوقت لتشكيل, خاصة إذا كان يحاول تحديد عدد الخلايا النادرة داخل الورم. وبالتالي، لا يُقترح النظر إلى طبق الثقافة الفرعية كل يوم، لأنه قد يؤثر سلبًا على نتائج تجاربك. ابدأ من خلال الاحماء لوحة 10 سنتيمترا مع خمسة ملليلتر من وسائل الإعلام العزل في حاضنة في 37 درجة مئوية.
تزن 500 إلى 1000 ملليغرام من نسيج الورم ووضعها في لوحة. جلب لوحة مع أنسجة الورم إلى غطاء الثقافة العقيمة و mince مع شفرة الحلاقة. للحصول على الهضم الأمثل، تأكد من أن أحجام القطع المفروم موحدة.
نقل الأنسجة المفرومة والخلايا وسائط العزل إلى أنبوب جهاز طرد مركزي 15 ملليلتر. غسل لوحة مع أربعة ملليلتر آخر من وسائل الإعلام وإضافة ذلك إلى الأنبوب. إضافة 700 وحدة لكل ملليلتر من محلول الكولاجيناز للأنبوب واحتضانه في حمام مائي مهتز عند 37 درجة مئوية لمدة 1 1/2 ساعة.
بعد الحضانة، تدور أسفل الأنسجة في 300 مرات ز لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. pirate المابير دون تعطيل بيليه، ثم إعادة تعليق بيليه في 10 ملليلتر من حل الهضم الثاني واحتضان في حمام الماء يهز لمدة 30 دقيقة أخرى. بعد عملية الهضم الثانية، الماصات تعليق الخلية صعودا وهبوطا وتمريرها من خلال مرشح النايلون 70 ميكرومتر على أنبوب الطرد المركزي 50 ملليلتر.
ثم غسل مرشح مع 10 ملليلتر من وسائل الإعلام عزل الخلية وتدور أسفل الأنسجة في 300 مرة ز لمدة خمس دقائق. التعرق وssuspend بيليه في 20 ملليلتر من وسائل الإعلام خلية الورم. نقل التعليق إلى لوحة ثقافة 15 سنتيمترا ووضع الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
في اليوم التالي، قم بتغيير الوسائط لإزالة الحطام والخلايا الميتة التي قد تؤثر سلبًا على بقاء الخلايا. عند هذه النقطة، قم بتقييم التقاء الخلايا والسماح للخلايا بالنمو في الحاضنة حتى تصل إلى 90٪ مراقبة الخلايا كل يوم وتغيير الوسائط كل يومين. لاشتقاق أورام غلاف، استخدم الخلايا في الممر P1 أو P2 لتجنب اختيار الخلايا من خلال ممرات متعددة.
غسل طبق الخلية مع برنامج تلفزيوني ومن ثم تغطيتها مع حل مفرزة. وضعها في الحاضنة لمدة خمس إلى 10 دقائق ثم تأكيد الانفصال من خلال النظر في لوحة تحت مجهر brightfield. بمجرد انفصال الخلايا، أضف سائل الخلايا السرطانية إلى اللوحة ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي.
تدور الخلايا في أسفل في 300 مرة ز لمدة خمس دقائق، وإزالة فائقة، وإعادة تعليق الخلايا في وسائل الإعلام أوراموسفير. بعد إعادة تعليق الخلايا، عد لهم باستخدام Trypan الأزرق وحساب تركيز الخلايا. لوحة العدد الصحيح من الخلايا في لوحة 96-جيدا منخفضة المرفق ووضع الخلايا في الحاضنة حتى نهاية التجربة، مع الحرص على عدم إزعاج لوحة ما لم تجديد وسائل الإعلام.
بعد الانتهاء من التجربة، وتحديد أورام السيلفيرات يدويا تحت المجهر brightfield أو باستخدام برنامج سيليغو. يمكن تقييم عدد وحجم أورام الأص وراتين نتيجة لهذه الحسبة. لإعداد أورامفيرس لزرع allograft، وجمع جميع أورامpheres التي تم الحصول عليها من نوع خلية معينة أو العلاج.
الطرد المركزي في أورامpheres وإزالة بعناية فائقة مع ماصة ملليمتر واحد تليها ماصة 200 ميكرولتر، ثم غسلها مع 10 ملليلتر من برنامج تلفزيوني معقمة. تدور في أوراموسفيرس أسفل مرة أخرى ويكبر برنامج تلفزيوني. إضافة 500 ميكرولتر إلى ملليلتر واحد من حل مفرزة الخلايا على رأس بيليه أوراموسفير وتحتضن الخلايا في حمام مائي يهز في 37 درجة مئوية.
تحقق من تطور عملية الهضم كل 10 دقائق. تستغرق العملية بأكملها ما يصل إلى 30 دقيقة. إذا كان هضم أوراموسفير في حمام الماء المهتز لا يكفي للحصول على حل خلية واحدة ، يقترح اضطراب ميكانيكي من خلال الأنابيب صعودا وهبوطا.
لاحظ أنه بعد الغزل في أورامpheres لا تشكل بيليه مستقرة، لذلك التعرق ينبغي أن يتم بعناية مع ماصات ملليلتر واحد والماصات 200 ميكرولتر. مرة واحدة يتم الحصول على حل خلية واحدة، إضافة حجم من وسائل الإعلام خلية الورم وتدور عليه في 300 مرة ز لمدة خمس دقائق في 4 درجات مئوية. بعد هذا الطرد المركزي، يجب أن يتم تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة على الجليد.
Resuspend الخلايا في وسائل الإعلام خلية الورم البارد والخلايا الحية العد باستخدام استبعاد Trypan الأزرق. تحديد العدد الصحيح من الخلايا ل allograft وتمييع في 50 ميكرولترات من وسائل الإعلام خلية الورم البارد. ضع طرف ماصة في سائل الخلايا السرطانية الباردة لتبريده ثم استخدامه لأخذ 50 ميكرولترات من محلول ECM البارد وإضافته إلى الأنبوب مع الخلايا ، مع التأكد من عدم إزالة أنبوب ECM من الجليد أثناء هذه العملية.
الحفاظ على الخلايا على الجليد حتى زرع ووضع توج، 0.5 ملليلتر حقنة الأنسولين مع إبرة 29 قياس على الجليد. بعد التأكد من أن الماوس قد تم تخديره بشكل صحيح ، حلق الجانب الأيمن من الحيوان ، pirate محلول الخلية في الحقنة المبردة ، وحقن الخلايا تحت الجلد في المنطقة الحليقة. إذا تم إجراء الحقن بشكل صحيح، سوف تتشكل نتوءات مرئية تحت الجلد.
يمكن استخدام هذا البروتوكول لتشكيل أورام بشكل موثوق لتحديد مجموعات الخلايا النادرة المسؤولة عن تطوير ساركوما الأنسجة الرخوة. جزء أساسي من هذا الفحص هو التمييز بين الخلايا والخلايا، والتي تظهر اختلافات واضحة في التشكل. لتحديد التركيز الأمثل الذي البروتين من مصلحة يؤدي إلى تأثير على الخلايا السرطانية، فمن الضروري لتقييم مستوى التعبير عن أهداف المصب البروتين.
وأظهرت ثلاثة من الجينات المختبرة استجابة تعتمد على الجرعة لعلاج البروتين المؤتلف ولم يفعل واحد. من أجل وضع بروتوكول فعال، تم تحليل آثار transfection على الخلايا السرطانية الكامنة؛ تم اختبار اثنين من كميات مختلفة من الكاشف والكفاءة تم تقييمها مع plasmid مراسل GFP. وأسفرت كميات أقل من الكاشف عن زيادة كفاءة نقل الملوثات.
وكان لا بد من تنفيذ بروتوكول من خطوتين لتنفيذ transfection على الخلايا في التعليق. تم إجراء عملية نقل على الخلايا المتصّنة وبعد 24 ساعة تم فصلها ومطلوها في التعليق؛ وبعد سبعة أيام، كانت الفرائح السرطانية الخاضعة للرقابة تعبر عن GFP. بعد الحصول على أورامفيرز، وعلاجها، وزرعها فمن الممكن لمقارنة تأثير هذا العلاج المختلفة في نمو الورم في الجسم الحي.
وستتيح هذه الطرق للعلماء الإجابة على الأسئلة التي لا تزال قائمة في الخلية الأصلية للrhabdomyosarcomas مع وضع الأساس لفحص المخدرات في الوقت نفسه.
