يستخدم بروتوكولنا للتعبير عن البروتين الخالي من الخلايا استخراج خام نشط للغاية من البكتيريا سريعة النمو Vibrio natriegens ، والتي يتم إعدادها باستخدام عملية sonication -centrifugation بسيطة وفعالة من حيث الوقت. ويمكن تحقيق إعداد استخراج الخلايا الخام وتخليخل البروتين الخالي من الخلايا في يوم إلى يومين من قبل مستخدم واحد يسمح بدمج هذه التقنية بسهولة في خطوط الأنابيب لأغراض الإنتاج البيولوجي أو تطبيقات البيولوجيا التركيبية. لبدء غسل ملليلتر واحد من ثقافة فيبريو natriegens بين عشية وضحاها من قبل الطرد المركزي في جهاز طرد مركزي benchtop في 10، 600 مرة ز لمدة دقيقة واحدة.
استلهمت من فوق دون إزعاج بيليه، و resuspend في ملليلتر واحد من وسائل الإعلام LB-V2 الطازجة. تلقيح ملليلتر واحد من الثقافة بين عشية وضحاها غسلها في لتر واحد من وسائل الإعلام الطازجة LB-V2 النمو في قارورة أربعة لتر حائرة erlenmeyer مع غطاء عقيم لتحقيق واحد إلى واحد ألف تخفيف الحصص التموينية. تنمو الثقافة في 30 درجة مئوية في حين تهتز إلى 225 دورة في الدقيقة.
استخدام مقياس الطيف لرصد الثقافات OD 600. وعندما تصل إلى 1.0 زائد أو ناقص 0.2 حصاد الثقافة عن طريق الطرد المركزي في اثنين من أنابيب 500 ملليلتر في 3، 500 مرة ز لمدة 20 دقيقة في أربع درجات مئوية، ومن ثم وضع على الجليد. التعرق ومعالجة بيليه على الفور.
قبل البدء في إجراء تحلل الخلايا بارد حديثا أعدت S30 تحلل العازلة الرقم النزلي 7.7 إلى ما يقرب من أربع درجات مئوية، استخدم 10 ملليلتر من هذا المخزن المؤقت S30 تحلل الباردة لإعادة تعليق جميع الكريات الناتجة عن نفس ثقافة لتر واحد. ونقل التعليق إلى أنبوب 50 ملليلتر. الطرد المركزي هذا التعليق في 3،500 مرات ز لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية، ومن ثم الطامح عظمى دون إزعاج بيليه ووضعها على الجليد.
العمل في غرفة باردة إضافة 500 ميكرولترات من S30 الباردة العازلة تحلل إلى بيليه في أنبوب 50 ملليلتر وضعت على الجليد. استخدام طرف ماصة تتحمل واسعة لإعادة تعليق بيليه ونقلها بعناية إلى أنبوب مليلتر اثنين أيضا على الجليد. من أجل إنتاج مقتطفات الخام نشطة جدا يجب علينا التأكد من أن الخلايا ليست أكثر من المخفف مع S30 العازلة، ولكن لديها ما يكفي من السوائل ل sonication كفاءة.
ملء 600 ملليلتر منقار مع الجليد ووضع حامل أنبوب ملليلتر اثنين على رأس الجليد. دوامة الأنبوب لفترة وجيزة لتجانس الخلايا. قم بالتمرير لإزالة أي خلايا في الجزء السفلي من الغطاء، ووضعها في حامل أنبوب مع غطاء مفتوح.
انخفاض تلميح sonicator في تعليق الخلية في الأنبوب بحيث يكون فقط تحت سطح السائل. إعداد مجموعة sonication باستخدام sonicator والتحقيق مع قطر طرف 1/8 بوصة. تعيين sonicator في تردد 20 كيلو هرتز و 50 ٪ السعة.
نبض على الوقت من 10 ثانية، ونبض إيقاف الوقت من 60 ثانية. تشغيل بروتوكول صوتنة نبض لمدة ثلاث دورات. ثم استخراج الخلية الخام بالطرد المركزي في 16،000 مرات ز لمدة 30 إلى 45 دقيقة في أربع درجات مئوية حتى lysate خال من أي حطام الخلوية.
فحص الخلايا بصريا كما يحدث sonication أمر بالغ الأهمية لضمان أن سونيكيشن عملت كما هو متوقع. العمل في غرفة باردة aliquot 50 ميكرولترات من super الناتجة إلى أنابيب جديدة ملليلتر التأكد من عدم إزعاج بيليه. فلاش تجميد هذه مقتطفات الخلية الخام وضع الأنابيب في حامل أنبوب مع سلسلة غمس تعلق وغمرها في ديوار تحتوي على النيتروجين السائل والتحقق مما إذا كان المجمدة.
لأداء التعبير عن البروتين خالية من الخلايا باستخدام قالب الحمض النووي ذوبان 10X مزيج الطاقة حل رئيسي، 4X الحمض الأميني ماجستير مزيج aliquots، والحمض النووي قالب في درجة حرارة الغرفة. ثم إزالة البوليميراز T7 RNA ومثبطات RNAse من الفريزر ناقص 20 درجة مئوية ووضعها على الجليد. مرة واحدة في قالب الحمض النووي، 10X مزيج الطاقة حل رئيسي، و 4X الأحماض الأمينية الرئيسية مزيج يذوب، مكان على الجليد.
إعداد مزيج رد فعل خال من الخلايا الرئيسية عن طريق إضافة كل عنصر في الترتيب الدقيق إلى أنبوب مليلتر اثنين على الجليد، ونفض الغبار بلطف الأنبوب بعد كل إضافة إلى المزيج الرئيسي. إزالة فيبريو natriegens الخلية الخام lysate من الفريزر ناقص 80 درجة مئوية ووضعها على الجليد لمدة 10 إلى 20 دقيقة حتى يذوب. إضافة حجم مناسب من استخراج الخلية الخام المذابة إلى مزيج التفاعل الرئيسي خالية من الخلايا ومزيج بلطف باستخدام ماصة.
لأداء نقطة النهاية خالية من الخلايا التعبير البروتين باستخدام thermocycler، أولا إضافة 10 ميكرولترات من مزيج رد فعل تفاعل خالية من الخلايا الرئيسية في بئر من الجزء السفلي من لوحة PCR 96-well مع التأكد من خلط المزيج الرئيسي عن طريق نفض الغبار الأنبوب بلطف بين كل نقل إلى لوحة PCR. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 1،000 مرات ز لمدة 10 ثوان لتجميع أي مزيج الرئيسي التي قد تكون عالقة على جانبي الآبار. ثم ختم الآبار مع لاصق لوحة لمنع التبخر.
ضع اللوحة في دراجة حرارة حرارية راكد عند 26 درجة مئوية مع غطاء ساخن ينضبط عند 105 درجة مئوية. بعد احتضان التفاعلات في لوحة PCR لمدة لا تقل عن ثلاث ساعات ، يمكن تنقية البروتينات المعبر عنها ، كمياً واستخدامها في عمليات المصب. لمراقبة حركية التعبير عن البروتين الخالية من الخلايا باستخدام ماص قارئ لوحة 10 ميكرولترات لكل بئر من مزيج التفاعل الرئيسي الخالي من الخلايا إلى الجزء السفلي من لوحة سوداء 384-well ممسحة مع قيعان زجاجية واضحة.
وختم الآبار مع لاصق لوحة واضحة لمنع التبخر. ضع لوحة المقايسة في قارئ لوحة مضبوطة عند 26 درجة مئوية وحضن لمدة ثلاث إلى ست ساعات مع مراقبة الإثارة الفلورية المناسبة / الأطوال الموجية للانبعاثات المقابلة للبروتين المعبّر عنه. نظام التعبير خال من الخلايا الموصوفة في هذا البروتوكول تحقيق أفضل النتائج مع قالب dna plasmid تسفر عن كمية أعلى بكثير من البروتين من نفس الكمية من الحمض النووي الخطي كما هو مبين في نقطة النهاية والمقايسات الحركية.
ويمكن أيضا استخدام الرنا الرنا التي تولدها ردود الفعل النسخ في المختبر، ولكن هناك حاجة إلى كميات أكبر من مرنا. وقد تأثر إنتاج البروتين بشكل كبير من خلال تركيز أيونات المغنيسيوم والبوتاسيوم. في ظل ظروف محسنة تم العثور على تركيز أيونات المغنيسيوم الأمثل ليكون 3.5 ملليمتر، ولليون البوتاسيوم، 80 ملليمولار.
وبالتالي فإن الانحرافات عن هذه التركيزات الأيونية المثلى قد تؤدي إلى انخفاض قدرة هذا التعبير على إنتاج غلات كبيرة من البروتينات. من المهم أن تبقي جميع الكواشف على الجليد أو العمل في غرفة التبريد قدر الإمكان. بالإضافة إلى ذلك، صوتنة السليم والكامل أمر بالغ الأهمية لنجاح هذا البروتوكول.
بعد هذا البروتوكول سيكون لدى المستخدمين القدرة على التعبير عن البروتينات في شكل عالي الإنتاجية ، والتي يمكن استخدامها لتنقية وشاشة لنشاط العديد من البروتينات المختلفة. هذه التقنية توضح استخدام كائنات جديدة ذات خصائص فريدة للتعبير الحر عن الخلايا. فيبريو natriegens هو بكتيريا الهالفيلية سريعة النمو التي قد توفر ظروف فريدة للتعبير عن البروتينات أو جزيئات صغيرة لم يتم استكشافها من قبل في الكائنات العضوية النموذجية الراسخة.
