هذه الطريقة مفيدة من أجل تحليل دور بعض الجزيئات في التوجيه المحوري والهجرة العصبية خلال تطوير النظام العصبي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن تحليل النتائج سريع وبسيط ولا يتطلب برامج معقدة مما يعني الكثير من التدريب للباحثين. وسوف يكون إثبات الإجراء ميريان سيغورا فيليو، وهو فني من مختبرنا.
لبدء لوحة 200، 000 COS-1 الخلايا في 35 ملليمتر أطباق بيتري واحتضان مع ثقافة كاملة المتوسطة في حاضنة ثقافة الخلية من أجل قراءة 70 إلى 80٪ التقاء بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، إلى transfect COS-1 الخلايا مع الحمض النووي ترميز جزيء المرشح باستخدام طريقة تحويل الدهون القائمة على. خلط أول 250 ميكرولترات من مصل المتوسطة الحرة واحد إلى 2 ميكروغرام الحمض النووي في أنبوب جهاز طرد مركزي 1.5 ملليلتر واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.
لإعداد أنبوب الدهنية، إضافة 240 ميكرولترات من المتوسطة المصل الحرة و 10 ميكرولترات من كاشف الحملات الدهنية، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد الحضانة، إضافة محتوى أنبوب الحمض النووي إلى أنبوب lipsomal. اخلطي المزيج ويندمجي في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
استبدال المتوسطة على الخلايا المستزرعة مع 1.5 ملليلتر من المتوسطة المصل الحرة. إضافة خليط الدهون الحمض النووي ببطء وإسقاط الحكمة إلى الخلايا. احتضان في حاضنة ثقافة ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاث ساعات.
بعد الانتهاء من الحضانة، استبدال الوسط مع الوسط ثقافة كاملة واحتضان بين عشية وضحاها في الحاضنة. في اليوم التالي، شطف الخلايا مع 0.1 مولر Dulbecco في برنامج تلفزيوني. أضف 800 ميكرولترات التربسين EDTA لكل طبق وحضن لمدة خمس إلى 15 دقيقة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون.
جمع الخلايا المنفصلة مع ملليلترين من المتوسط ثقافة كاملة في أنبوب جهاز طرد مركزي 15 ملليلتر وإضافة 10 ملليلتر من نفس المتوسطة. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في أربع درجات مئوية في 130 مرات ز لمدة خمس دقائق. إزالة فائقة والحفاظ على بيليه التي تحتوي على COS-1 الخلايا على الجليد.
بعد إعداد خليط عمل الكولاجين، إضافة 100 إلى 150 ميكرولترات من خليط الكولاجين إلى بيليه من الخلايا المصابة ومزيج بلطف عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. انتشار 45 إلى 50 ميكرولترات من خلية الكولاجين بيليه خليط على طبق بيتري 35 ملليمتر لتشكيل الفرقة موحدة من خلايا الكولاجين، ما يقرب من واحد إلى 1.5 سنتيمتر. ضع الطبق في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى يتم ملاحظة الجلة.
إعداد شريط ثان يحتوي على خلايا تحكم في طبق ثقافة ثانٍ وضعه في الحاضنة. عند الانتهاء من الجيل، إضافة ثلاثة إلى أربعة ملليلتر من 37 درجة مئوية درجة حرارة COS-1 ثقافة كاملة متوسطة لكل طبق يحتوي على شرائط خلية الكولاجين هلام ووضعها في الحاضنة. استخدام مشرط غرامة أو مروحية الأنسجة لقطع شرائط خلية الكولاجين لتوليد قطع مربعة صغيرة، 400 إلى 500 ميكرومتر في الطول.
نقل جميع المقاطع من نفس حالة transfection إلى طبق بيتري تحتوي على ثلاثة إلى 3.5 ملليلتر من وسائل الإعلام ثقافة الخلايا العصبية. تحقق تحت مجهر تشريح نوعية القطع ووضع الأطباق في الحاضنة. استخدام مقص لقطع قرون الجنين في يوم الجنين 16.5 من تجويف البطن من الفئران الإناث الحوامل التضحية ووضعها في طبق بيتري كبير يحتوي على عازلة HBSg الباردة.
ضع الطبق في غطاء تدفق الفارني واستخدم ملقطًا مستقيمًا لاستخراج الأجنة ووضعها في طبق جديد يحتوي على HBBSg بارد. مع ملقط صغيرة، وإزالة الجلد، ومن ثم مع ملقط منحنية ومستقيمة، تشريح بعناية الدماغ ومكان في طبق يحتوي على HBSSg الباردة. تحت مجهر تشريح، وذلك باستخدام مشرط أو مقص غرامة، وقطع الدماغ في النصف على طول خط الوسط لفصل كلا نصفي الكرة الأرضية.
ثم، إزالة diencephalon ومع ملقط غرامة، وإزالة السحايات والأوعية الدموية من قطع الدماغ. استخدام 100٪ الإيثانول لتنظيف جميع أجزاء من المروحية الأنسجة، وخاصة PTFE لوحة قطع وشفرة الحلاقة والحفاظ على المروحية الأنسجة في غطاء تدفق لامين تحت الإضاءة الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة. نقل كل قطعة الأنسجة إلى لوحة قطع من المروحية الأنسجة.
بعد أن تم تقطيع الأنسجة ، نقل القطع من 35 ملليمتر الأطباق بيتري مليئة ثلاثة إلى أربعة ملليلتر من NCM كاملة. باستخدام الإبر التنغستن غرامة، والانتهاء من تشريح الأنسجة في NCM كاملة. تحقق من جودة الشرائح التي تم الحصول عليها تحت المجهر التشريح، والتأكد من أن الطبقات يمكن التعرف عليها بوضوح في البصريات الحقل المظلم وتشريح المنطقة ذات الاهتمام مع الإبر التنغستن.
الحفاظ على نوعية جيدة القطع في متوسطة NCM كاملة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون. إن المظاهرات البصرية أمر حاسم في الخطوات المتعلقة بإعداد الثقافات المشتركة التي تسهل الكلمات لفهم العملية. وضع عدة صحن استزراع الأربعة المعقمة في غطاء تدفق الفارني وإعداد خليط عمل الكولاجين كما كان سابقاً.
إضافة 15 إلى 20 ميكرولترات من خليط هيدروجيل في الجزء السفلي من كل بئر لإنتاج قاعدة الكولاجين دائرية. ضع الأطباق في الحاضنة حتى يتم ملاحظة الهلام الكامل. وتحقق من نوعية الكولاجين هلام.
مع ماصة، نقل قطعة صغيرة من COS-1 خلية تجميع على قاعدة هيدروجيل، ثم استخدام ماصة لوضع قطعة من الأنسجة على نفس القاعدة، على مقربة من قطعة من الخلايا المجمعة على مسافة واحدة حجم explant. بعد إعداد خليط الكولاجين العمل الجديد على الجليد، ماصة بلطف 15 إلى 20 ميكرولترات من هذا الخليط الجديد لتغطية explant وتجميع الخلايا، مما يجعل شطيرة مثل ثقافة الهيدروجيل. استخدام إبرة التنغستن غرامة لإعادة توجيه explant بحيث يواجه خلية الكلي في 500 إلى 600 ميكرومتر.
العودة لوحة إلى الحاضنة حتى يتم ملاحظة هلام ومن ثم إضافة 0.5 ملليلتر من NCM كاملة تستكمل مع 2٪ B27 تكملة والحفاظ على الثقافات لمدة 36 إلى 48 ساعة في الحاضنة. عندما واجهت محاور فرس النهر مع نيترين-1، نمت بشكل تفضيلي نحو مصدر نيترين-1، مما يشير إلى أن نيترين-1 يعمل كجزيء جذاب كيميائي لهذه المحاور. في حالة التحكم ، أو transfection وهمية ، نمت جميع المحاور عصبيا ، دون أي تفضيل الاتجاه.
عندما واجهت محاور فرس النهر مع خلايا إفراز Sema3E، نمت معظمها عكس الخلية الكلية، مشيرا إلى أن Sema3E بمثابة جزيء مثير للاشمئزاز العلاج الكيميائي لهذه المحاور. ويبين هذا التمثيل التخطيطي لاستجابة محور عصبي وطريقة القياس الكمي أنه في ظروف التحكم، كانت المحاور المحورية موزعة بالتساوي في كل من الأرباع القريبة والعرجية، وتظهر مع نمو إشعاعي. وهذا يشير إلى نسبة قريبة أو نسبة PD واحدة.
عندما أظهرت explants زيادة عدد المحاور في الربع القريب بالمقارنة مع القعدة ، مما يدل على جاذبية العلاج الكيميائي ، كانت نسبة PD أكبر من واحد. عندما كان عدد محاور عصبية أعلى في الربع القعد منه في واحد القريبة، مما يدل على التنافر الكيميائي، كانت نسبة PD أقل من واحد. بعد هذه الطريقة، يمكن للباحثين الحصول على معلومات أساسية حول دور بعض الجزيئات أثناء تطور الخلايا العصبية، مما يسمح لنا بإنشاء نقطة انطلاق لمزيد من استكشاف الوظائف.
على الرغم من أن هذه التقنية مفيدة في تطوير الخلايا العصبية كما هو، فإنه يمكن أيضا أن تطبق في الفحص الدوائية، الأوعية الدموية، وهندسة الأنسجة والاستراتيجيات.
