يمكن استخدام هذا البروتوكول لإنشاء نموذج ماوس غير عشوائي لاختبار وتحديد إعادة تنشيط كروموسوم Mecp2 غير النشط المرتبط بـ X في دماغ الماوس الحي. يمكن تعديل هذا النموذج بسهولة لدراسة إعادة تنشيط Xi في نماذج أمراض أخرى مرتبطة بـ X مثل متلازمة DDX3X. أنا آخر وثيقة في مختبر سانشيتا بهاتناغار وسوف يكون إظهار الإجراء مع زيمينغ تشنغ.
تبدأ عن طريق وضع الماوس تخدير في منصة stereotactic مع القواطع مدمن مخدرات في شريط لدغة من المقيد خطم. تشديد المشبك الأنف مع الحفاظ على رأس الماوس على مستوى الطائرة. ضبط ارتفاع قضبان الأذن للوصول إلى الجزء السدومي من قناة الأذن للحفاظ على الرأس غير مُشل.
ثم تطهير الرأس مع مناديل بالتناوب من مطهر الموضعية والإيثانول 70٪. عندما يكون الماوس جاهزًا، استخدم مشرطًا معقمة لإجراء شق أفقي 0.75 سنتيمتر في منتصف فروة الرأس. استخدام 0.45 ملليمتر دبر لحفر اثنين من الثقوب متناظرة فوق نصفي الكرة القشرية اليمنى واليسرى ملليمترين من خياطة القوس وخياطة لامدويد في منتصف تقريبي من العظام الجدارية.
نعلق بحزم حقنة 10 ميكرولتر إلى منصة stereotactic وتحميل 10 ميكرولترات من مثبطات كيميائية أعدت حديثا في الحقنة. تقدم الإبرة في حفرة البور الأولى مع الحفاظ على إبرة عمودي على الجمجمة. عندما تجتاز الإبرة الجمجمة، صفر الإحداثيات على الشاشة الرقمية المجسمة وتقدم طرف الإبرة حتى يصل إلى عمق 2.5 ملليمتر.
سحب إبرة 0.5 ملليمتر إلى عمق مليمترين وحقن ببطء كامل 10 ميكرولتر حجم المحل على مدى فترة دقيقة واحدة. بعد تسليم كل من مثبط، وترك الإبرة في الدماغ لمدة دقيقة أخرى قبل سحب الإبرة. كرر الحقن في ثقب البور الثاني باستخدام السيارة فقط كتحكم وإغلاق الجلد على الشق.
ثم نقل الماوس من جهاز stereotactic على وسادة التدفئة درجة مئوية 37 مع مراقبة حتى الشفاء الكامل. في نهاية نظام الجرعة، وتأمين الماوس على لوحة تشريح. استخدام مقص والملقط لجعل شق الجانبي من خلال integument وجدار البطن فقط تحت القفص الصدري.
فصل الكبد بعناية من الحجاب الحاجز وقطع من خلال الحجاب الحاجز على طول طول القفص الصدري لفضح تجويف الجنبي. استخدم المقص لإجراء شق إلى الطرف الخلفي للبطين الأيسر وحقن على الفور غرفة القلب اليمنى مع حوالي 15 ملليلتر من برنامج تلفزيوني على مدى فترة دقيقتين. وسوف يؤدي الضخ الناجح في تغيير لون الكبد من الأحمر إلى الوردي الشاحب.
عندما تم تسليم كل من برنامج تلفزيوني، ضخ القلب مع ما يقرب من 10 ملليلتر من 4٪ شبهformaldehyde في برنامج تلفزيوني على مدى دقيقتين. بعد حصاد الرأس، استخدم المقص لإجراء شق في منتصف الرأس لفضح الجمجمة. ضع طرفًا واحدًا من المقص في ماغنوم الهضان لتسهيل إنشاء شقّ شقّي في الجمجمة نحو العين.
إجراء شق مماثل على الجانب الآخر من الجمجمة مع الحفاظ على نهاية المقص سطحية قدر الإمكان وقطع منطقة الجمجمة بين العينين وفوق أنف الماوس. استخدم ملقطًا لتقشير عظام الجمجمة من نصفي الدماغ واستخدام ملعقة لرفع الدماغ. تشريح بعناية الألياف العصبية القحفية التي إصلاح الدماغ إلى الجمجمة ووضع الدماغ في طبق من البلاستيك.
ثم اكوس المصابيح المخيخة والشمية. للحصول على أجزاء من أنسجة الدماغ، أولاً إصلاح الدماغ في أنبوب 15 ملليلتر مليئة 4٪ شبهformaldehyde في برنامج تلفزيوني في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، شطف أنسجة الدماغ ثلاث مرات على الأقل لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية في برنامج تلفزيوني جديد في الغسيل.
بعد الغسيل الأخير، إزالة الجزء الأمامي من كل نصف الكرة الأرضية مع مقص ملقط ووضع العينات في تسمية قوالب التبريد الجانب الأمامي إلى أسفل. غمر كل نسيج في متوسط درجة حرارة القطع المثلى قبل المفاجئة تجميد العينات في النيتروجين السائل في طبق بيتري البلاستيك 10 ملليمتر للتخزين ناقص 80 درجة مئوية. لتحديد إعادة تنشيط شي، غمر خمسة إلى ستة أقسام أنسجة الدماغ ميكرومتر في محلول استرجاع المستضد لمدة خمس دقائق على كتلة حرارة 100 درجة مئوية.
في نهاية الحضانة، وغسل الشرائح مع أربعة يغسل لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة مع برنامج تلفزيوني الطازجة في غسل قبل غمر الشرائح في حل حجب. بعد 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، اغسل الشرائح ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في مخزن غسيل طازج لكل غسيل. وصمة العينات الأنسجة مع الأجسام المضادة الأولية المناسبة في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.
صورة الشرائح على المجهر الفلوريسين ضبط التباين والسطوع للسماح quantence من عدد الخلايا الإيجابية GFP لكل من المخدرات والمركبات معالجة نصفي الدماغ الماوس. لإثبات جدوى غير عشوائية X كروموسوم تعطيل نموذج الماوس غير نشط العاشر دراسات إعادة تنشيط كروموسوم، تم تأكيد الأنماط الجينية من الألياف الجنينية الماوس المعدلة وراثيا من قبل genotyping PCR وتدفق الخلايا. كما تم تقييمها من قبل PCR، تم تنشيط التعبير عن GFP الموسومة الميثيلين CPG بروتين ملزم جينين أو MECP2 عن طريق المخدرات ولكن ليس العلاج من السيارة.
غير عشوائية X كروموسوم تعطيل الماوس نموذج الليفية الجنينية أعرب أيضا GFP النووية بعد المخدرات ولكن ليس علاج السيارة مما يدل على مثبطات عامل تعطيل كروموسوم X إعادة تنشيط كروموسوم X المعطلة مرتبطة MECP2 في الليفية الجنينية الماوس. العلاج من المخدرات ينشط المعطل X كروموسوم MECP2-GFP في حوالي 30٪ من الخلايا في نصفي الدماغ المخدرات غرست في حين لم يتم الكشف عن إعادة تنشيط في نصف الكرة الأرضية السيارة غرست. البروتين المرتبطة Microtubule اثنين من الخلايا العصبية الإيجابية هي أيضا GFP إيجابية في نصفي الكرة الأرضية المعالجة المخدرات تشير إلى تعطيل X كروموسوم MECP2-GFP التعبير.
سوف يكون نظام المخدرات تعتمد على الهدف وفعالية مثبطات جزيء صغير حتى تحسين الجرعة والعلاج في المختبر قبل الاختبار في الجسم الحي. ويمكن استخدام نموذج الماوس غير العشوائي لاختبار المخدرات المختلفة إما بشكل فردي أو في تركيبة. في الواقع، ونحن وآخرون قد حددت عدة عوامل تعطيل الكروموسوم X قابلة للأدوية.
