وقد تم تطوير RT-PCR المتداخلة للكشف عن جميع فيروسات ليسا، بما في ذلك جميع 16 ICTV المعتمدة واثنين من أنواع فيروس ليسا رواية. وقد ثبت التحقق من صحة هذه الطريقة باستخدام أكثر من 9000 عينة الدماغ الحيوانية في 10 سنوات من تشخيص داء الكلب السريرية والمراقبة في الصين. لا يمكن للار تي ار ار ان تى ار المتداخلة فقط ان تنتج نتيجة ذات مصداقية على عينات من انسجة المخ الطازجة ولكن ايضا على عينات متدهورة.
ويمكن استخدام غمر هذه الطريقة لحصان عينات السوائل البيولوجية مثل السائل النخاعي, اللعاب, والبول, وبالتالي يمكن تطبيق هذه الطريقة في تشخيص إنذار. من أجل تقليل التلوث المنتقل من PCR ، من المهم إعداد ضوابط سلبية وإيجابية من المهم جدًا اتخاذ خطوات. على سبيل المثال، لكل إعداد احتياجات استخراج الحمض النووي الريبي، و PCR إعداد، وينبغي تشغيل جل electrophoresis في مناطق منفصلة جسديا.
ويوصى أيضا باستخدام الأشرطة الحلزونية في استخراج الحمض النووي الريبي وعكس النسخ من أجل منع التلوث داء الكلب إلى سلسلة الببتيد. التعامل السليم مثل إعداد وكلاء الخاص بك على الجليد، وتغيير القفازات بانتظام، واستخدام المواد الحرة ريبونوكريلي منع إدخال ريبونوكريلاز والقضاء على تدهور الجيش الملكي النيبالي. لبدء هذا الإجراء، استخراج RNA من الأنسجة المشتبه في داء الكلب، خزعات الجلد، اللعاب، السائل النخاعي أو ثقافة الخلايا المصابة RABV كما هو مبين في بروتوكول النص.
عندما تكون جاهزة للمضي قدما، وإزالة الكواشف اللازمة من الثلاجة والاحتفاظ بها على الجليد. تأكد من ذوبان و دوامة كل كاشف قبل الاستخدام. للنسخ العكسي للرنا الفيروسي إلى cDNA إعداد 12 لتراً من مزيج التفاعلات الدقيقة لكل عينة على الجليد وأنبوب 1.5 ملليلتر للطرد المركزي كما هو مبين في الجدول 1 من بروتوكول النص في غرفة نظيفة.
لحساب الاختلافات الأنابيب، وإعداد حجم من مزيج رئيسي على الأقل حجم رد فعل واحد أكبر من المطلوب، ومن ثم تقسيم مزيج التفاعل إلى أنابيب PCR 0.2 ملليلتر. في محطة عمل PCR في غرفة قالب، إضافة ثمانية ميكرولترات إما عينة أو واحدة من عناصر التحكم لمزيج رد فعل. السيطرة الإيجابية هي الحمض النووي الريبي المستخرجة من خلية الثقافة المصابة سلالة ثابتة-RABV CVS11، في حين أن السيطرة السلبية تحتوي على المياه المقطرة مزدوجة خالية من رناز.
خلط محتويات كل أنبوب عن طريق دوامة الأولى ثم عن طريق الطرد المركزي لفترة وجيزة. بعد ذلك، قم بتحميل أنابيب التفاعل في دراجة حرارة. إعداد وتشغيل برنامج تجميع cDNA كما هو موضح في بروتوكول النص.
أولا، استرداد الكواشف اللازمة والاحتفاظ بها على الجليد في غرفة نظيفة حتى جاهزة للاستخدام. عندما تكون جاهزة، ذوبان ودوامة الكواشف. بعد ذلك، قم بإعداد 48 ميكرولترات من المزيج الأولي من البوليسترولينات الأولية لكل عينة في أنبوب طرد مركزي 1.5 ملليلتر على النحو المبين في الجدول 2 من بروتوكول النص وتقسيم مزيج التفاعل إلى أنابيب PCR 0.2 ملليلتر.
في محطة عمل PCR في غرفة قالب، إضافة نموذجين microliter من cDNA في أول جولة PCR المزيج. وتشمل اثنين من microliters من CVS11 cDNA كتحكم إيجابي، واثنين من ميكرولترات من الماء المقطر مزدوجة كتحكم سلبي. ثم، نقل أنابيب مختومة في ثيرسيكلولر PCR ودورة باستخدام المعلمات المذكورة في الجدول 3 من بروتوكول النص.
للبدء، إعداد 48 ميكرولترات من المزيج PCR الجولة الثانية لكل عينة في أنبوب جهاز طرد مركزي 1.5 ملليلتر على النحو المبين في الجدول 4 من بروتوكول النص وتقسيم مزيج التفاعل إلى أنابيب PCR 0.2 ملليلتر. إضافة اثنين microliters من المنتج PCR الجولة الأولى في المزيج PCR الجولة الثانية. وتشمل المياه المقطرة مزدوجة كتحكم سلبي لهذه الجولة من PCR.
ثم تنفيذ الدراجات الحرارية PCR باستخدام المعلمات المذكورة في الجدول 3 من بروتوكول النص. أولاً، أضف 1.5 جرام من الأاروز إلى 100 ملليلتر من تريس-أسيتات EDTA واسخنيها في فرن ميكروويف لإذابتها تمامًا. بعد ذلك، إضافة بروميد الإثيديوم في تركيز نهائي من 0.01٪ صب الجل في القالب وترك الأمر لترسيخ في درجة الحرارة المحيطة لمدة 30 دقيقة على الأقل.
إعداد عينات التحميل عن طريق خلط خمسة ميكرولترات من كل منتج PCR مع ميكرولتر واحد من 6x تحميل العازلة. تحميل عينات بشكل منفصل وعلامة الحمض النووي مناسبة في الآبار وتشغيل هلام لمدة 30 إلى 45 دقيقة تقريبا في 120 فولت حتى خط الصبغة هو ما يقرب من 75 إلى 80٪ أسفل هلام. عند اكتمال الركض، قم بإيقاف تشغيل الطاقة وفصل الأقطاب الكهربائية عن مصدر الطاقة.
ثم، إزالة بعناية هلام من مربع هلام. استخدام جهاز توثيق هلام الأشعة فوق البنفسجية لتصور وتصوير شظايا الحمض النووي. يميّز ال متداخلة النسخ العكسي PCR كما هو موضح في بروتوكول النص.
تظهر هنا نتائج تمثيل متداخلة RT-PCR للكشف عن 18 نوعًا من أنواع فيروسات ليسا. ال [بكرّرّسبسّس]. لا ينظر إلى الفرقة للضوابط السلبية.
وينظر إلى جميع الفيروسات Lyssaes 18 لإنتاج نفس النطاقين كما السيطرة الإيجابية، مما يشير إلى أن المتداخلة RT-PCR الكشف عن جميع الفيروسات Lyssa 18. في حين أن 16 من البلازميدات لديها تضخيم فعال في جولتين من PCR ، يتم تضخيم اثنين منهم ، فيروس Aravan وفيروس إيكوما ، فقط في الجولة الأولى أو الثانية ، على التوالي. وتختلف حساسية الأسلوب في الكشف عن بلازميدات الفيروسات ليسا مختلفة، من قيم تتراوح بين 2.24 إلى 2، 240 جزيئات لكل ميكرولتر.
ويمكن أن تعزى هذه الاختلافات إلى عدم التطابق بين القوالب التمهيدية والقوالب بسبب تنوع التسلسل الفيروسي. مقارنة بين 9, 624 أنسجة الدماغ من العينات السريرية التي يتم اختبارها من قبل PCR متداخلة مقابل تلك التي تم اختبارها مع FAT يظهر أن تتداخل RT-PCR كحساسية 100٪ وخصوصية 99.97٪ وقد دعي الاتّق بين الطريقتين 99.07٪ عشرة مختبرات أخرى لداء الكلب لإجراء الاختبار للتحقق من صحة الـ RT-PCR المتداخلة. جميع المختبرات العشرة التي حصلت على نتائج RT-PCR المتداخلة التي هي 100٪ وفقا لل FAT، مع عدم وجود سلبيات كاذبة أو ايجابيات كاذبة، مما يشير إلى أن RT-PCR المتداخلة لديها خصوصية عالية وتكرار.
ويوصى الآن RT-PCR من قبل OIE لاستخدام تقنيات داء الكلب. وقد ثبت أن لدينا متداخل RT-PCR كمعيار وطني لتقنيات داء الكلب في الصين في عام 2018.
