الشاي هو واحد من المشروبات الأكثر شعبية في جميع أنحاء العالم. وتستخدم المبيدات الحشرية في بعض الأحيان لحماية نباتات الشاي من الآفات. قد تكون مصنوعة بعض المبيدات النظامية لهذا عن طريق الإنزيمات في شجرة الشاي.
ثم متكاملة من خلال الأكسدة، التحلل المائي، أو الحد من ردود الفعل. يمكن استخدام ثقافات تعليق الخلايا النباتية باعتبارها ، بسهولة لدراسة سلوك التمثيل الغذائي للنباتات من المبيدات الحشرية. هذا الأسلوب له العديد من المزايا.
أولاً، يمكن تشغيلها بشروط الكائنات الحية الدقيقة الحرة، وبالتالي تجنب تداخل تحلل المبيدات الحشرية الناجم عن الميكروبات. ثانيا، يمكن أن توفر المواد الثابتة بالنسبة لنا في أي وقت. وأخيراً، يمكن استخدامه بسهولة لمقارنة نظريات سلوك المبيدات الحشرية في تجربة واحدة.
في هذه الدراسة، ونحن ننشئ الشاي خلية تعليق الثقافات من الألوان المتغيرة من أوراق الشاي. ثم استُخدمت حالة الثقافات المثلى لتعليق الخلايا لمقارنة سلوك تبديد ستة مبيدات. وسيجرى هذه التجربة جياو واتينغ وجى قوه تشين .
هذا هو لدينا النباتات الشاي العقيمة التي تعمل كمصدر explant. قطع على طول الجناح الأوسط من ورقة عقيمة باستخدام مقص. ثم، تقسيم كل نصف إلى قطع صغيرة من حوالي 0.3 مرات 0.3 سنتيمتر في طبق بيتري.
ضع الاكزات العقيمة على الوسيط البصري للتصلب المتعدد الذي يحتوي على 2 و4-D و KT. ويمكن وضع ستة explants في قارورة 300 ملليلتر. ثقافة الورقة explants في درجة حرارة ثابتة من 25 درجة مئوية في الظلام. بعد 28 يوما، حدد الجيل الأول من الهاس المستحث ومن ثم نقل إلى قارورة جديدة.
الحصول على كالوس فضفاضة ومتغيرة بعد ثلاث إلى أربع ثقافات فرعية. قطع الكبيرة منها، و النسيج متغير وفضفاضة من المتوسطة الصلبة إلى قطع صغيرة باستخدام شفرة الجراحية العقيمة في ظل ظروف معقمة. نحن حوالي 3 غرامات من قطع صغيرة من الـ"كالوس".
ضع الـ callus في B5 الذي يحتوي على 2 و4-D و KT. ثقافة تعليق الخلية السائلة في درجة حرارة ثابتة في حاضنة تهتز في الظلام. بعد سبعة إلى عشرة أيام من الزرع، قم بإزالة قارورة الثقافة، واتركها للوقوف لبضع دقائق. خذ الماوسة كما الرواسب هنا سوف تجبر الثقافة إلى المتوسطة الطازجة.
إزالة المكالمات الكبيرة المتعجلة. الحصول على الثقافة النهائية تعليق الخلية مهندم بعد أربع إلى ثلاث دورات الثقافة الفرعية من 28 يوما لكل منهما. الاحتفاظ بعينة من الخلايا الحية في مائة درجة مئوية لمدة عشر دقائق كخلية التحكم قبل تلطيخ القدرة على البقاء.
أجهزة الطرد المركزي جميع ثقافة تعليق الخلية لمدة ثماني دقائق في 6، 000 G.إزالة supernatant قبل تعليق الخلايا إلى 5 ملليلتر من العازلة PBS وهزته لمدة دقيقة واحدة باليد. إضافة 2.5 ملليلتر من الحل TTC ومصافحة باليد مرة أخرى. احتضان الخليط لمدة ساعة واحدة في حاضنة دائمة عند درجة حرارة 13 درجة مئوية.
إضافة aliquot من أربعمائة microliters على عرض لتعقيم حل الأسهم من جميع neonicotinoids Thiamethoxam، Acetimoprid، إيميداكلوبريد، وImideproxase. كل إلى المرحلة الأولى العضوية. ديميثهوات و وميمات في الثقافات تعليق الخلية على التوالي.
عينات من الخلايا مع المبيدات الحشرية في درجة حرارة ثابتة، وتهتز سرعة الحاضنة. أخذ العينات في أيام مختلفة. لاختبار العينة التي تحتوي على النيونيكوتينويد، إزالة aliquot 1 ملليلتر من ثقافة الخلية متجانسة.
ضعه في أنبوب 1.5 ملليلتر من أجهزة الطرد المركزي البلاستيكية، والطرد المركزي في 4،000 G لمدة دقيقتين. تمرير عظمى من خلال 0.22 ميكرومتر مرشح غشاء قبل التحليل من قبل HPLC-الأشعة فوق البنفسجية و UPLC QTOF. لاختبار العينة، تابع في المرحلة الأولى العضوية.
إزالة 500 أليكوتر ميكرولتر من ثقافة الخلية ووضعها في أنبوب جهاز طرد مركزي 35 ملليلتر أو 1.5 ملليلتر أنبوب الطرد المركزي البلاستيك. إضافة 0.1 غرام من كلوريد الصوديوم وخمسة ملليلتر استخراج المذيبات في أنبوب جهاز الطرد المركزي 35 ملليلتر من 500 عينات ميكرولتر. دوامة الخليط لمدة دقيقة واحدة.
ثم تسمح لهم للراحة لمدة 10 دقائق. تأخذ 2.5 ملليلتر من عظمى في أنبوب زجاجي 10 ملليلتر وتتبخر إلى ما يقرب من الجفاف باستخدام متبخر النيتروجين في 14 درجة مئوية. إذابة البقايا مع أسيتون ملليلتر واحد.
دوامة لمدة دقيقة واحدة، وتمريرها من خلال 0.22 ميكرومتر مرشح غشاء قبل التحليل من قبل GC-FPD. وضع خمسة مصانع في أربعة أوعية بلاستيكية لتر لمدة خمسة عشر يوما. إضافة صفر ميكروغرام لكل ملليلتر أو 100 ميكروغرام لكل ملليلتر من Thiamethoxam أو dimethoaxe في الأواني البلاستيكية، على التوالي.
إعداد عينة النبات سليمة وفقا للأسلوب السابق، باستثناء ما قبل نقع ثم تحليل بواسطة قياس الطيف الكتلة Orbitrap. استخدام HPLCUV للكشف عن محتوى والمنتجات الأيضية من Thiamethoxam و Acetimoprid في أطوال موجية من 254 نانومتر، وImidacloprid وImideproxase في 270 نانومتر. الكشف عن محتوى الدايتات و وميثهوات بواسطة GC-FPD باستخدام عمود أنبوبي.
الكشف عن الأيضات من المبيدات الحشرية في زراعة الخلايا باستخدام QTOF UPRC مع عمود الكربون 18. الكشف عن الأيضات من المبيدات الحشرية في استخراج النباتات اختبار باستخدام UPLC المدار الطيفي الشامل. و callus من بلانتليت واحد معقمة أقل تلوث براونينغ ولكن أعلى أن إدخالية أن من callus من أوراق الشاي التقطت.
كان الوسم المستمد من الأوراق العقيمة دائمًا مصفّرًا ساطعًا ، في حين أن الهالوس المشتق من الأوراق الملتقطة كان أبيضًا مع بقع بنية. عندما كان تركيز KT 0.1 مليغرام لكل لتر، كان اللكوس مصفر في اللون وفضفاضة في الملمس. وكان معدل نمو كالوس أعلى, تصل إلى 61.5٪ عندما كان تركيز 2, 4-D واحد ملليغرام لكل لتر مع تركيز KT كان 0.5 ملليغرام للتر الواحد.
وكان نمو البيانات من كالوس هو الأفضل ومعدل نمو كالوس أعلى وصلت 46.9٪ ولذلك، كان أفضل مزيج من النباتات homent واحد ملليغرام لكل لتر من 2، 4-D و 0.1 ملليغرام لكل لتر من KT لنمو الشاي callus. غطت الـ(كالوس) الأوراق بالكامل من خلال الثقافة الفرعية الرابعة، وعندما كانت دورة الثقافة الفرعية 28 يوماً. وقد نمت callus بقوة مع اللون المصفر والملمس فضفاضة وليس براونينغ.
بعد مقارنة البيانات الإجمالية من كالوس ولون تعليق الخلية، كانت الوسيطة السائلة B5 أكثر ملاءمة لثقافة تعليق الخلية. تم استخدام قيمة OD لثقافة تعليق الخلية لتمثيل مقدار نمو الخلايا. وخلال فترة الزراعة التي تبلغ 75 يوماً، كانت نسبة 15 غراماً لكل 40 ملليلتراً ذات قيمة من المواد المستنفدة للأوزون أعلى بكثير من النسبتين الأخريين.
تم اختبار قابلية البقاء الخلية داخل ثقافة تعليق خلية الشاي من قبل تلطيخ TTC. يمكن تحويل مركب TTC عديم اللون إلى فورمادين أحمر بواسطة dehydrogenase في الميتوكوندريا من الخلايا الحية ، ولكن لا يمكن تغيير اللون في الخلايا الميتة. وهذه هي العملية برمتها من إنشاء ثقافة تعليق خلية الشاي.
هذه هي أول دراسة مقارنة لعملية التمثيل الغذائي للمبيدات الحشرية المختلفة في الشاي باستخدام تقنية ثقافة تعليق الخلية. وتم تحديد العديد من نواتج الأيض الخاصة بمبيدات الآفات، وتم إجراء مزيد من البحث في بعض هذه النواتج في مصانع الشاي المحتفظ بها. ويمكن أن تكون هذه الطريقة الجديدة بمثابة نموذج للدراسات الأيضية لمبيدات الآفات في الشاي أو غيرها من النباتات.
