هذا البروتوكول يتيح للمستخدم دراسة أثر العمليات الجراحية الغازية المستخدمة في العيادة على سلوكيات الخلايا السرطانية، مثل الهجرة والغزو والانتشار. هذه الطريقة تسمح بشكل فريد التصور من نفس الورم قبل وبعد إجراء الغازية, توفير البصيرة التي يمكن أن تفوت في نهج غير طولي. بعد التأكد من عدم وجود استجابة لقرصة إصبع في فأرة بالغة تخدير، قم بتركيب الفأرة على إطار مجسم وآمن الرأس بمشبك أنف وقضبان أذنين.
استخدام مصباح التدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم، وتطبيق مرهم على عيون الحيوان. باستخدام مقص حاد، حلق الفراء على الجمجمة من العينين إلى قاعدة الجمجمة، واستخدام 70٪ الإيثانول لتعقيم الجلد المكشوف. قطع الجلد بطريقة دائرية، واستخدام مسحة القطن لكشط بعيدا periosteum المكشوفة.
علاج منطقة جراحية مع قطرة 1٪ الليدوكائين، وتركيز 1:100، 000 من الادرينالين لمدة خمس دقائق قبل إزالة الحل الزائد مع مسحة القطن. استخدام الصمغ سيانوكريلات للتمسك حواف الجلد إلى الجمجمة، ووضع إطار stereotactic تحت مجهر ستيريو تشريح مع التكبير 4x. بعد ذلك، حفر بعناية سطحية، قطرها خمسة ملليمترات، الأخدود الدائري على العظام الجدارية اليمنى.
وطبق قطرة من عازلة القشرة على الأخدود. استخدام ملقط رقيقة لرفع رفرف العظام لتصور سطح الدماغ، واستخدام المنحني، مدبب، ملقط نقطة دقيقة جدا لإزالة ماطر دورا. إذا حدث نزيف، استخدم إسفنجة الجيلاتين القابلة للامتصاص لتحقيق الهباس.
لحقن الخلايا السرطانية، قم بتحميل حوالي ثلاثة ميكرولترات من الخلايا في حقنة الغازات الدقيقة الخمسة الضيقة المجهزة بنمط نقطة إبرة اثنين. إصلاح الإبرة على ذراع المتلاعب stereotaxic، وإزالة العازلة القشرة من الأنسجة المكشوفة. ضع طرف الحقنة في منتصف عملية استئصال القحف وأدخل الإبرة على عمق 0.5 ملليمتر من سطح الجمجمة.
ثم، إضافة قطرة من العازلة القشرة إلى استئصال القحف، واستخدام مضخة microsyringe حاقن لتسليم الخلايا في 250 إلى 400 نانولتر في الدقيقة معدل. لتحضير نافذة التصوير القحفية، استبدل عازل القشرة بنقطه من زيت السيليكون إلى موقع استئصال القحف لتجنب فقاعات الهواء تحت النافذة. ختم الدماغ المكشوفة مع غطاء ستة ملليمتر، وتطبيق الغراء سياناكريلا بين غطاء والجمجمة.
ثم استخدام ملاقط غرامة للضغط بلطف على غطاء ضد الجمجمة. عند نقطة الوقت التجريبية المناسبة، ضع وجه الماوس في صندوق تصوير، ثم قم بتعيين هدف الماء 25x إلى الموضع الـ z الأدنى. إضافة قطرة كبيرة من الماء إلى الهدف، ونقل مربع التصوير في غرفة المناخ المظلم 37 درجة مئوية من المجهر.
جلب الهدف إلى غطاء نافذة التصوير القحفية حتى تلامس قطرة الماء غطاء. وباستخدام وضع epifluorescence ، ومراقبة الورم من خلال العدسة لجعل الخلايا في التركيز. ضبط الليزر إلى الطول الموجي الصحيح وحدد الوضع المباشر.
بعد اختيار عدة مواقع ذات أهمية للتصوير ، سجل إحداثياتها في البرنامج. حدد رزمة z لكل موضع للحصول على أقصى حجم للخلايا السرطانية دون المساس بدقة الخلايا السرطانية، مع تعيين حجم الخطوة بين الصور إلى ثلاثة ميكرومترات. ثم، الحصول على صور لحجم الورم في مواقع مختلفة كل 20 دقيقة لمدة ساعتين، إضافة الماء إلى الهدف قبل كل الحصول على صورة.
بعد الحصول على الصورة الأخيرة، نقل الماوس إلى وسادة التدفئة مع مراقبة حتى الانتعاش الكامل. بعد يوم واحد من جلسة التصوير الأولى، قم بتأمين الماوس المُجَدَّد في الإطار المُجسّم كما هو مُظهر، واستخدم مسحة قطنية غارقة في الأسيتون لمسح حواف الغطاء حتى يتم تخفيف الغراء. حرك إبرة قياس 25 تحت غطاء الأغطية واستخدم ملقطًا رقيقة لرفعها ، وهيدرات استئصال القحف مع عازل القشرة الطازج.
ثقب الورم إلى عمق ملليمتر واحد مع إبرة قياس 25، ووقف أي نزيف مع اسفنجة الجيلاتين العقيمة، وختم سطح الدماغ مع زيت السيليكون الطازج. ثم الغراء جديد ستة ملليمتر يغطي على الجرح. لتحليل الصورة، افتح ملف LIF الفاصل الزمني في برنامج المجهر، وحدد علامة التبويب Process وأدوات المعالجة والدمج.
حدد الصورة الأولى من التسلسل الزمني وانقر أولاً. حدد الصورة الثانية من التسلسل الزمني وانقر فوق الثانية. في دمج الأبعاد، حدد t للوقت، ثم انقر فوق تطبيق.
سيتم إنشاء ملف جديد مع اثنين من نقاط زمنية. بعد تتبع كل سلسلة وقت الفاصل عن ثلاث متتالية z - مداخن بشكل منفصل ، اسحب المجلد الذي يحتوي على الصور الفاصل الزمني إلى ImageJ. حدد علامة التبويب الإضافات والتتبع و MtrackJ.
لتعقب كل خلية على حدة، حدد إضافة وانقر على كل خلية في كل نقطة زمنية. ثم انقر على قياس، وحفظ الملف لاستخراج قياس المسارات. يمكن تحديد هجرة الخلايا السرطانية الفردية عن طريق تتبع مسار الهجرة بمرور الوقت في مستويات س ص مختلفة من المكدس z ورسمها كنسبة مئوية من الخلايا المهاجرة قبل الخزعة وما بعد.
يمكن تحديد معدل انتشار الخلايا السرطانية على أساس التكثيف Dendra2 الموسومة H2B على الانقسام الانقسامي ورسم كنسبة مئوية من الخلايا المقسمة قبل وبعد الخزعة. مقارنة توزيع سرعة الهجرة قبل وبعد خزعة في نفس الورم، ويكشف أن عدد الخلايا المهاجرة يزيد بعد التدخل، مع انخفاض المرتبطة بها في عدد الخلايا البطيئة إلى غير التاريخ. في المتوسط لكل ورم، لوحظ زيادة 1.75 ضعف في النسبة المئوية للخلايا المهاجرة عند إجراء إصابة تشبه خزعة، مقارنة بفئران غير بيولوجيوبيوبية تحكم.
على الرغم من أن النسبة المئوية للخلايا السرطانية المهاجرة تنخفض في نهاية المطاف في كل من الفئران المكافحة والفئوية ، لا تزال الفئران التي تحتوي على زعيبة لديها قدرة هجرة أعلى من قدرة الفئران على التحكم بشكل عام. كما يوضح السلوك التكاثري للخلايا السرطانية زيادة بمقدار 1.52 ضعفًا في عدد الأحداث الميتوليتية عند الخزعة بمرور الوقت ، نسبة إلى فئران التحكم غير البيولوجية بيولوجياً. ملاحظة, لا يتم ملاحظة تحريض على الهجرة أو انتشار الورم الخلية بعد استبدال نافذة التصوير القحفية دون خزعة, مشيرا إلى أن زيادة في انتشار الخلايا السرطانية ومعدلات الهجرة على وجه التحديد يتم تشغيلها من قبل إصابة تشبه خزعة.
من المهم العمل بدقة عالية ومهارة جراحية أثناء التصوير القحفي، والزرع، والخطوات البديلة. قد يكون من الضروري ممارسة واسعة النطاق.
