قمنا بتطوير مقايسة عالية الإنتاجية لقياس الفخاخ العدلية خارج الخلية ، أو NETs. إنّ النُسخ العصبية المُحسّنة هي هياكل الحمض النووي المناعي التي تتعرض لها العدلات. يمكن أن تقوم NETs بصيد وقتل الكائنات الدقيقة وبالتالي فهي آلية مهمة لمكافحة العدوى ، ولكنها تلعب أيضًا دورًا مسببًا للأمراض في أمراض المناعة الذاتية.
مع هذه التقنية، يتم تحديد كمية NETs بواسطة المجهر المناعي ثلاثي الأبعاد الناتج عن طريقة حساسة وعالية الإنتاجية لدراسة تكوين الشبكة وتدهورها. هذه التقنية تمكننا من تحديد كمية تشكيل صافي المرضى الذين يعانون من أمراض المناعة الذاتية. يمكن رصد تكوين السابق vivo NET من المرضى الذين يعانون من التهاب الأوعية الدموية المرتبط بـ ANCA أو مرض الذئبة الحمامي النظامي مع هذا الفحص.
وبالإضافة إلى ذلك، يمكن اختبار العلاجات المحتملة التي تستهدف تشكيل الشبكة مع هذا الفحص في المختبر. يمكن أن تكون عزلة العدلات صراعًا للأشخاص الذين لم يقوموا بهذه التقنية من قبل. لبدء هذا الإجراء، الحصول على 20 ملليلتر من الدم المحيطي من متبرع سليم في اثنين من أنابيب EDTA 10 ملليلتر.
نقل 10 ملليلتر من الدم في أنبوب 50 ملليلتر معقمة وبرنامج تلفزيوني إلى حجم إجمالي نهائي 32.5 ملليلتر. باستخدام ماص 10 ملليلتر والماصات تحكم، يستغرق 14 ملليلتر من التدرج الكثافة. ضع الماصة على الجزء السفلي من أنبوب 50 ملليلتر.
ثم، واتخاذ وحدة تحكم ماصة قبالة ماص، والسماح للتدرج كثافة لتدفق بها الجاذبية حتى يتم التوصل إلى الحد الأقصى عن طريق تأثير الشعرية. ضع إبهامًا فوق الماصات لمنع تدرج الكثافة المتبقي من التسرب ، ثم قم بإزالة الماصات من الأنبوب. جهاز طرد مركزي الأنبوب في 912 مرات ز في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة دون تسارع أو الفرامل.
إزالة بعناية حلقة بيضاء تحتوي على خلايا أحادية النوى الدم الطرفية أولا، تليها البلازما PBS المخففة. وأخيرا، إزالة طبقة التدرج الكثافة قدر الإمكان. بعد ذلك ، استرداد زجاجة من الماء المقطر المعقم والقارورة من 10x PBS المركزة من الثلاجة.
العمل بسرعة، إضافة 36 ملليلتر من الماء مباشرة على رأس بيليه ومزيج بعناية مرة واحدة. بعد 20 ثانية عد من البداية، إضافة أربعة ملليلتر من برنامج تلفزيوني 10x لجعل حل متساوي التوتر. ومرة أخرى، مزيج مرة واحدة بعناية.
جهاز طرد مركزي الأنبوب في 739 مرات ز و4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق. تجاهل supernatant، والتأكد من أن تكون حذرا للغاية كما بيليه ليست صلبة، وتكرار عملية بسرعة من إضافة الماء المقطر العقيمة الباردة وSBBS المركزة كما هو موضح سابقا. أجهزة الطرد المركزي في 328 مرة ز وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق.
إزالة بعناية عظمى وإعادة تعليق بيليه في خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني. عد العدلات والاحتفاظ بها على الجليد. أولاً، قم بعمل تعليق العدلات الذي يحتوي على ما يقرب من 10 إلى 20 مليون العدلات في مليلترين من PBS في أنبوب 15 ملليلتر.
في أنبوب مختلف 15 ملليلتر، مزيج اثنين من ملليلتر برنامج تلفزيوني مع أربعة ميكرولترات من اثنين من micromolar ربط الخلايا الفلورية الحمراء. أضف بلطف محلول رابط الخلايا الفلورية الحمراء إلى تعليق العدلات واخلطه بعناية. التفاف الأنبوب في رقائق الألومنيوم لحماية الخليط من الضوء، واحتضان لمدة 25 دقيقة بالضبط في 37 درجة مئوية لتسمية العدلات مع رابط الخلية الفلورية الحمراء.
إلغاء تنشيط وضع العلامات عن طريق إضافة 1640 1640 1640 متوسطة التي تحتوي على 10٪ FCS تنشيط الحرارة في درجة حرارة الغرفة إلى حجم النهائي من 15 ملليلتر ومزيج مرة واحدة بعناية. إذا بعد هذا قد شكلت بيليه، بعناية إعادة تعليق الخليط. جهاز طرد مركزي الأنبوب في 328 مرات ز في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.
قبل إزالة المابير، تأكد من أن بيليه قد شكلت. بعد ذلك، إعادة تعليق بيليه في خمسة ملليلتر من الحمراء الخالية من 1640 1640 المتوسطة التي تحتوي على 2٪ FCS في درجة حرارة الغرفة. ثم، عد العدلات.
جعل تعليق الخلية في كثافة 420، 000 خلية لكل ملليلتر في الفينول الأحمر خالية من 1640 1640 متوسطة تحتوي على 2٪ FCS. إضافة 37،500 العدلات في 90 ميكرولترات إلى كل بئر من 96-جيدا، لوحة مسطحة القاع. بعد ذلك، أضف 10 ميكرولترات من التحفيز المختار في ثلاث ية للوصول إلى تركيز 10٪ في كل بئر.
احرص دائماً على التحكم السلبي في ثلاثية الليكات. احتضان في الظلام في 37 درجة مئوية للوقت المطلوب، تتراوح بين 30 دقيقة إلى اثنين، أربع، أو ست ساعات. ثم، وإعداد حجم صبغة الحمض النووي غير قابل للانهاء اللازمة لإضافة 25 ميكرولترات من صبغة الحمض النووي غير القابلة للاستنشاق من خمسة ميكرومولار للوصول إلى تركيز نهائي من ميكرومولار واحد في كل بئر.
قبل 15 دقيقة من نهاية وقت الحضانة، إضافة 25 ميكرولترات من صبغة الحمض النووي الخمسة ميكروموللار غير قابلة للحماقة لكل بئر. مواصلة حضانة للدقائق 15 الأخيرة في 37 درجة مئوية في الظلام. بعد ذلك، إزالة فائقة بعناية فائقة وتخزينها إذا لزم الأمر.
إضافة 100 ميكروليتر من 4٪ شبهformaldehyde. إبقاء لوحة في الظلام، والمضي قدما على الفور إلى القسم التالي. بعد تكوين الإعدادات، حدد Z Series.
حدد 10 كرقم من الخطوات. حدد ثلاثة ميكرومترات كحجم الخطوة. قم بتحميل اللوحة في المجهر المنافر.
انقر فوق علامة التبويب تشغيل. املأ اسم اللوحة ووصفها، واختر موقع التخزين. حدد الآبار التي تحتاج إلى الحصول عليها.
اختر وقت التعرض لـ تكساس ريد و FITC. ثم، انقر على الحصول على لوحة والبدء في عملية الاستحواذ، والتي سوف تستغرق ما يقرب من ساعة واحدة لكل لوحة. بعد ذلك، حدد ماكرو التحليل.
ثم حدد w1، واختر قيمة الحد. بعد ذلك، حدد قيمة البيكسل المطلوبة. وأخيرا، في نافذة صورة J الثانية، حدد w2، واختيار قيمة عتبة مع قيمة بكسل المطلوب.
حدد وجهة لملف جدول البيانات، وقم بتشغيل التحليل، ثم احفظ ملف السجل بعد ذلك. المعروض هنا هو حساسة للغاية اختبار قابلة للتطبيق على نطاق واسع لتكميم شبه الآلي من تكوين فخ العدلات خارج الخلية لتقييم السابقين الحية التعريفي من الفخاخ العدلات خارج الخلية على محفزات مختلفة. يتم تحديد كمية تكوين صافي بطريقة ثلاثية الأبعاد عن طريق قياس الحمض النووي الملطخ خارج الخلية أكثر من 10 Z-اكدس مع مسافة ثلاثة ميكرومتر بدءا من الطائرة المحورية في كل بئر.
من خلال قياس المساحة التراكمية ، تزداد حساسية الفحص. يتم تحديد المساحة الكلية من العدلات الملطخة التي تم تصويرها كمياً فقط في المستوى البؤري في كل بئر والذي يرتبط بشكل كبير مع إجمالي عدد العدلات في كل بئر مع معامل ارتباط Pearson 0.99. يتم التعبير عن النتيجة التمثيلية للتكبير الكمي لتكوين NET في العدلات كمنطقة الحمض النووي الملطخة خارج الخلية المتراكمة على مدى 10 مكدسات Z لكل العدلات المصورة.
ثم تؤخذ لقطات من صافي مقايسة الكم. تظهر هنا صور تمثيلية من العدلات غير المُحفزة والنيبات NETs في العدلات المحفزة لـ AAV مع العدلات ذات المسمى الفلوري باللون الأحمر والحمض النووي الملطخ خارج الخلية باللون الأخضر. يجب معالجة العدلات بعناية، وينبغي أن يتم تنفيذ وضع العلامات PKH بالضبط وفقا للبروتوكول.
يمكن استخدام هذا الفحص لدراسة المورفولوجيا والحركية وتكوين NETs. هذه التقنية هي طريقة أخرى توفر إمكانية دراسة NETs في الصحة والمرض. يجب التعامل مع Trypan الأزرق، PKH، و PFA مع قفازات وينبغي ألا يكون تنفس في مباشرة.
