C.elegans السمية المقايسة قيمة. يصف هذا البروتوكول كيفية علاج C.elegans بالمواد الكيميائية في لوحة 384 بئرًا ، والتقاط مقاطع الفيديو ، وقياس الأنماط الظاهرية ذات الصلة بالسمية. ويمكن أن تساعد هذه الطريقة في تحديد السمية الحادة المحتملة للمواد الكيميائية والتنبؤ بها.
وقد تم تطوير هذه التقنية الكمية لتحليل تلقائيا المعلمات 33 من C.elegans بعد 12 إلى 24 ساعة من العلاج الكيميائي في لوحة 384-well مع المتوسطة السائلة. C.elegans قيمة كنموذج جيد للتقييم السريع للسمية للمواد الكيميائية الجديدة. كما الفئران، ويمكن تطبيقه على فحص السمية واختبار المواد الكيميائية الجديدة، أو المركب كما التلوث عامل المضافة الغذائية، مركب الصيدلانية، البيئة المركب الخارجي، وهلم جرا.
قراءة البروتوكول بعناية واتبع دائما مع خطوة بخطوة، ثم سوف تكون واحدة جيدة. العرض التوضيحي المرئي أسهل للمستخدم لمشاهدة عملية كل خطوة، و نتيجة العملية. وسوف يكون من بين الاجراءات ون جينغ تشانغ وقاوتشاو هان .
إنهم طلاب دراسات عليا من مختبري. للبدء، إجراء اختبار فتاك دودة أولية لمايائية جديدة، لتحديد أعلى جرعة، وأقل جرعة، والتي هي الحد الأدنى للتركيز من 100٪ فتاك، والحد الأقصى للتركيز من 100٪ غير فتك. لهذه التجربة، إعداد سبعة تركيزات متدرجة من كلوريد الكادميوم.
لإعداد مرتين أعلى محلول مائي مركز ، قم بحل 92.8 ملليغرام من مسحوق كلوريد الكادميوم الصلب في أنبوب طرد مركزي مملوء بثمانية ملليلترات من K المتوسطة. دوامة لخلط. بعد أن يذوب المسحوق بالكامل ، استخدم ماصة لملء ما يصل إلى 10 ملليلتر.
إعداد مستويات التركيز الأخرى عن طريق التخفيف مع K المتوسطة. في مقعد فائقة نظيفة، واستخدام طرف عقيمة لاختيار مستعمرة واحدة من OP50 E.coli من لوحة خط، ووضعها في قارورة مع 100 ملليلتر من مرق LB لتطعيم المستعمرة. تنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في شاكر الحاضنة.
صب NGM في 90 ملليلتر لوحة بيتري البلاستيك. بذور كل لوحة مع 300 ميكرولترات من محلول E.coli OP50. تحتضن ديدان N2 على لوحات NGM مع OP50 عند 20 درجة مئوية لحوالي 2 إلى 3 أيام، حتى وصلت معظم الديدان إلى مرحلة البلوغ.
مع الماء العقيم، وغسل أسفل الديدان جرافيد في أنبوب مخروطي معقم 15 ملليلتر لحصاد. دع الديدان تستقر لمدة دقيقتين على الأقل. استلهم الماء وأضيف خمسة ملليلترات من عازلة التبييض.
دوامة الأنبوب لمدة خمس دقائق، ومن ثم وضع الأنبوب في جهاز طرد مركزي لتدور في قوة طرد مركزي النسبية من 1300 لمدة 30 ثانية لبيد البيض. استخدام ماصة لpirate ابراء. إضافة خمسة ملليلتر من المياه المعقمة في أنبوب لغسل البيض، ودوامة الأنبوب لمدة خمس ثوان.
جهاز طرد مركزي الأنبوب لمدة 30 ثانية، في قوة طرد مركزي النسبية من 1300. إزالة ناظرة وإضافة خمسة ملليلتر من المياه المعقمة لغسل مرة أخرى. مازيت البيض على لوحة NGM جديدة مع OP50.
احتضانهم في 20 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، الديدان المفقوسة تصل إلى مرحلة L1. بعد حوالي 40 ساعة، تصل الديدان إلى مرحلة L4.
مع K المتوسطة، وغسل الديدان المرحلة L4 قبالة لوحات بيتري في أنبوب مخروطي معقم 50 ملليلتر. ماصة 50 ميكرولترات من السائل دودة من أنبوب إلى شريحة زجاجية. تحت مجهر ستيريو، واستخدام ماصة لضبط تركيز الديدان إلى ما يقرب من 40 الحيوانات لكل 100 ميكرولترات من K المتوسطة.
إضافة 50 ميكرولترات من المتوسط المعدة في كل بئر من لوحة 384-well. هذه متزامنة L4 مرحلة الديدان جاهزة للمعالجة التالية بواسطة المواد الكيميائية. قبل إضافة المواد الكيميائية، ضع لوحة 384-well، مع الديدان المتزامنة على المسرح التلقائي، وإعداد كاميرا فيديو مع إجراء الاستحواذ المبرمج.
في لوحة 384-جيدا، يتم التعامل مع الديدان مع ست إلى سبع جرعات من كل مادة كيميائية على حدة، مع ثمانية آبار موازية تحتوي على 50 ميكرولترات من محلول كيميائي مرتين لكل جرعة. إعداد ما لا يقل عن ثلاث مجموعات من ثمانية آبار موازية من K المتوسطة كتحكم. إضافة 50 ميكرولترات من محلول الكيميائية مرتين لكل بئر.
تعيين الوقت كنقطة ساعة الصفر. ثم، وضع لوحة 384 جيدا في حاضنة شاكر تعيين في 20 درجة مئوية، و 80 الثورات في الدقيقة الواحدة. بعد الوقت المطلوب، وإزالة لوحة من الحاضنة، ونقلها إلى المرحلة التلقائية.
خذ مقاطع فيديو لكل بئر من الصحن، في الساعة 12، وفي الساعة 24 للتحقق من الأنماط الظاهرية للدودة. لبدء معالجة الفيديو التجريبي، قم بنقل ملفات الفيديو إلى الكمبيوتر. عبر واجهة المستخدم الرسومية ، انقر على زر تحديد ، لاختيار دليل الصور المصدر.
إضافة دليل النتائج الوسطى. وتشمل النتائج الوسطى الصور المجزأة، التي تعتبر مفيدة للمراقبة البصرية للصور المعالجة. إضافة الدليل النتيجة النهائية في الواجهة.
تعيين متوسط المعلمة حجم الفيروس المتنقل في 2, 000, في مربع النص حجم الفيروس المتنقل في الواجهة. تعيين عتبة نسبة نقل في 0.93 في الواجهة. انقر على الزر تحليل لبدء معالجة الصورة.
يمكن للبرنامج المطور التعرف على الديدان وقياس الأنماط الظاهرية تلقائيًا. في هذه التجربة، تم تحديد 33 ملامح مميزة لمعالجة كلوريد الكادميوم في ثلاث نقاط زمنية، صفر ساعة، 12 ساعة، و 24 ساعة. وتظهر الصور التجريبية أن الديدان ماتت بسرعة أكبر مع زيادة التركيز الكيميائي.
في البداية ، لم يكن هناك فرق كبير بين التحكم والعلاجات الكيميائية. بعد 12 ساعة من العلاج، أصبحت الديدان المعالجة بتركيزات عالية أكثر استقامة وأقل منحنيًا من التركيزات الأقل أو في مجموعات التحكم. زاد طول المحور الرئيسي للجسم الدودة المنطقة المغطاة مع زيادة الوقت.
وهناك أيضاً اتجاه متدرج من التركيزات الكيميائية المنخفضة إلى التركيزات الأعلى في كل من المحور الرئيسي وفي طول المحور الثانوي. وأظهرت حركة الديدان، استنادا إلى المنطقة والنسبة، أنماطا مماثلة. ولم يلاحظ أي فرق كبير في البداية.
مع مرور الوقت، أظهرت الديدان في مجموعة التحكم انخفاضًا مستقرًا في الحركة. وبعد 12 و24 ساعة، أظهرت الديدان التي تم علاجها بكلورايد الكادميوم اختلافات كبيرة في الحركة، مقارنة بمجموعات التحكم. وبالإضافة إلى ذلك، أظهرت الديدان تحت علاجات التركيز العالي حركة أضعف، مقارنة بالدود تحت معالجات التركيز المنخفضة.
وباختصار، تمهد هذه التقنية طريقة لتقييم السمية السريع في مناطق متعددة. الباحثون التي يمكن تطبيق هذه الطريقة على تحليل الطوارئ للسمية في سمية تحملها الأغذية، وتقييم سلامة المركبات الصيدلانية، فضلا عن فحص السمية الحادة، والكشف عن المواد الكيميائية الجديدة، والمركبات الخارجية البيئية. كلوريد الكادميوم هو مادة منخفضة السمية.
يرجى ارتداء القفازات وقناع أثناء التعامل مع الخاص بك، واتبع تعليمات التشغيل.
