إن الطفرات الموجهة للموقع مفيدة لدراسة التفاعلات الجزيئية، مثل الحمض النووي الريبي الريبي، وتفاعلات البروتينات الرنا. يصف هذا البروتوكول كيفية تنفيذ الطفرات الموجهة من الموقع مع نهج PCR من خطوتين أو 3 خطوات. وتتمثل المزايا الرئيسية لهذه الطريقة في تنوع الطفرات المختلفة التي يمكن إدراجها، فضلا عن السهولة النسبية والتكلفة للقيام بذلك.
للبدء، استخدم قالب الحمض النووي البرية من النوع والأزواج التمهيدية اثنين، واحد، واثنين، ثلاثة، محددة ل2-الخطوة، أو أزواج التمهيدي ثلاثة، واحد، وثلاثة، أربعة، محددة ل PCR 3-خطوة للحصول على منتج PCR واحد. للتحقق من صحة منتجات PCR بواسطة agarose هلام electrophoresis، وجعل هلام agarose 2٪عن طريق حل غرامين من agarose في 100 ملليلتر من 1X TAE العازلة، وذلك باستخدام فرن الميكروويف. يضاف بروميد الإثيديوم بتركيز نهائي 0.5 ميكروغرام لكل ملليلتر.
ثم يلقي هلام agarose. عندما تُرسّن، ضعه في وحدة الكهرباء. تحميل سلم الحمض النووي من الحجم المعروف، وعينات PCR مختلطة مع صبغة تحميل الحمض النووي في الآبار.
تشغيل العينات في 75 فولت لمدة 45 دقيقة. وتصور العصابات على transilluminator الأشعة فوق البنفسجية أو مع نظام التصوير هلام. بعد ذلك، قم بتنقية منتج PCR مع عدة استخراج هلام وفقا لبروتوكول المصنعين وقياس تركيز الحمض النووي المنقى مع مقياس الطيفي.
ثم تخزين الحمض النووي المنقى في ناقص 20 درجة مئوية في عازلة TE. لبدء الطفرات الموجهة من الموقع مع PCR من خطوتين ، استخدم أولاً قالب الحمض النووي البري ، ثم أزواج التمهيدي اثنين ، واحد واثنين ، اثنين ، لخمس طفرات التمهيدي ، أو أزواج التمهيدي اثنين ، اثنين ، واثنين ، وثلاثة لثلاث طفرات أولية للحصول على منتج PCR الثاني. التحقق من صحة المنتج PCR بواسطة جل electrophoresis، تنقية المنتج PCR، وقياس تركيزها كما هو موضح من قبل.
ثم استخدم قالب الحمض النووي من النوع البري والمنتج PCR اثنين كـ التمهيدي ، جنبا إلى جنب مع التمهيدي الثاني ، ثلاثة لخمسة طفرة أولية ، أو التمهيدي الثاني ، واحد لثلاثة طفرة أولية ، للحصول على منتج PCR الثالث. التحقق من صحة المنتج PCR بواسطة جل electrophoresis، تنقية المنتج PCR، وقياس تركيزها كما هو موضح من قبل. ثم تخزين الحمض النووي المنقى في ناقص 20 درجة مئوية في عازلة TE.
لبدء الطفرات الموقع المباشر مع PCR 3 خطوة، أولاً استخدام قالب الحمض النووي البرية من النوع والأزواج التمهيدي ثلاثة، واحد، وثلاثة، اثنين للحصول على منتج PCR اثنين. استخدام قالب الحمض النووي من النوع البرية والأزواج التمهيدي ثلاثة وثلاثة وثلاثة، أربعة، للحصول على المنتج PCR ثلاثة. استخدام قالب الحمض النووي من النوع البرية والأزواج التمهيدي ثلاثة وثلاثة وثلاثة وأربعة، للحصول على المنتج PCR ثلاثة.
التحقق من صحة المنتج PCR بواسطة جل electrophoresis، تنقية المنتج PCR، وقياس تركيزها كما هو موضح من قبل. وأخيرا استخدام اثنين إلى خمسة نانوغرام من منتجات PCR اثنين وثلاثة كقالب جنبا إلى جنب مع أزواج التمهيدي ثلاثة، واحد وثلاثة، أربعة، للحصول على المنتج PCR أربعة. التحقق من صحة المنتج PCR بواسطة جل electrophoresis، تنقية المنتج PCR، وقياس تركيزها كما هو موضح من قبل.
تخزين الحمض النووي المنقى في ناقص 20 درجة مئوية في العازلة TE. في هذه الدراسة، تم استخدام 2 خطوة و 3 خطوات من التاجنينية الموجهة للموقع للتحقيق في تفاعلات الحمض النووي الريبي فيما يتعلق بتنظيم ما بعد النسخ من CsgD. تم تضخيم CsgD من النوع البرية لـ PCR لـ IA منتج PCR ، وتم تضخيم MCAS من النوع البرية لتحقيق منتج PCR IB. وباستخدام استراتيجية PCR من 3 خطوات، تم توليف منتجات PCR IIA و IIIA في أول خطوتين، وIVA في الخطوة الثالثة لإدخال الطفرات في CsgD.
وبالمثل، تم إدخال طفرات مجانية موجهة من الموقع في MCAS لتحقيق منتجات PCR IIB و IIIB في أول خطوتين و IVB في الخطوة الثالثة. أظهر تحليل البقعة الغربية أنه في حين أن التعبير عن mcaS من النوع البري يمنع ترجمة CsgD من النوع البري ، فإن الطفرات في إما MCAS أو CsgD تخفف من القمع الملحوظ. ومع ذلك، تحول الطفرات في كل من CsgD وMCAS دون ترجمة CsgD.
باستخدام استراتيجية PCR 2 خطوة، منتجات PCR IIC، IID، IIE، IIF، و IIG، تم تصنيعها في الخطوة الأولى، ومنتجات PCR IIIC، IIID، IIIE، IIIF، و IIIG، في الخطوة الثانية لإدخال الطفرات إلى الحمض النووي CsgD بأكمله. وأظهرت نتائج EMSA من HFQ ملزمة لفي المختبر منقولة CsgD من النوع البرية وRNAs متحولة، توليفها باستخدام منتجات PCR IIIC، IIID، IIIE، IIIF، وICG، زيادة قيم KD من الأليلات متحولة. وقد أثبت ذلك أن HFQ يمكن أن يربط بشكل أقل كفاءة مع المسوخ.
وعلاوة على ذلك HFQ لديها العديد من المواقع ملزمة على CsgD، وهو ما يتضح من التحولات الثلاثة التي لوحظت للرنا من النوع البرية. ومع ذلك، يتم ملاحظة موقعين فقط ملزمة لمختلف RNAs متحولة. وهكذا فإن نهج الطفرات الموجهة من حيث الموقع يحدد الهياكل الأولية أو الثانوية لمرنا CsgD التي تعتبر مهمة للربط الكامل ل HFQ.
تعتمد طريقة الطفرات الموجهة من الموقع الموضحة هنا على PCR. الممارسات الجيدة PCR هي هناك حاسمة للأسلوب وقد تتطلب التحسين لتكون ناجحة. الموقع الموجه الطفرات هي قوية فقط مع جميع الأساليب الثلاث مثل EMSA وغرب النشاف.
وتشمل الطرق الأخرى، على سبيل المثال، مختلف الأقوال الهيكلية وبعض مقايسات النشاط، ودراسات تعديل الترجمة اللاحقة.
