يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علم الأحياء الميكانيكية، مثل كيفية استجابة العينات البيولوجية للقوى الميكانيكية الناتجة عن التحفيز بالموجات فوق الصوتية منخفضة الكثافة. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح لأخصائي التجارب بتطبيق القوى الميكانيكية على عينة وقياس المحيط البيولوجي المتنوع في الوقت الحقيقي. للبدء، ببطء حفر حفرة 12 ملليمتر في الجزء السفلي من طبق ثقافة معيار 35 ملليمتر باستخدام مثقاب الصحافة العمودي.
مرة واحدة حفر، وإزالة قطعة من البلاستيك تعلق على الجزء السفلي من الطبق باستخدام شفرة، لخلق سطح أملس على الجانب الخارجي. بعد ذلك، تطبيق طبقة رقيقة من الايبوكسي البحرية الصف أو الغراء في السطح السفلي الخارجي للطبق. على رأس لاصقة، وضع اثنين من نقطة-خمسة ميكرون فيلم سميكة من البوليستر، والضغط بحزم للتأكد من ينتشر لاصقة بالتساوي بين الفيلم وسطح البلاستيك السميك.
سحب الفيلم بلطف بطريقة الطرد المركزي مع الأصابع، لخلق سطح مستو. مرة واحدة وقد جفت لاصق، شطف لفترة وجيزة طبق أسفل البوليستر مع 95٪الإيثانول. ثم، الأشعة فوق البنفسجية تعقيم الطبق عن طريق وضعه تحت مصدر قوي 254 نانومتر الأشعة فوق البنفسجية الإثارة.
ضبط المدة والكثافة لتقديم جرعة من الأشعة فوق البنفسجية من حوالي 330 ملليجول لكل سنتيمتر مربع. بعد ذلك، تمييع خليط بروتين مصفوفة خارج الخلية المتاحة تجاريا مع المتوسطة الثقافة المطلوبة بنسبة واحد إلى 100. العمل على الجليد لمنع البلمرة مصفوفة، وتطبيق بسرعة 100 ميكرولترات من الخليط المتوسط على فيلم البوليستر.
ضع الغطاء مرة أخرى على الطبق للحفاظ على العقم. مرة واحدة مغطاة، احتضان الاطباق أسفل المصفوفة المغلفة، البوليستر في ثقافة الخلية، وحاضنة ثاني أكسيد الكربون المخزنة في 37 درجة مئوية لمدة ست إلى 12 ساعة. بعد الحضانة ، تعرق المتوسطة الزائدة وبذرس السطح مباشرة مع الخلايا في الكثافة المطلوبة.
ضع خزان مياه تحت هدف المجهر المستقيم. ثم، باستخدام المكونات البصرية المتاحة تجاريا، ضع حامل العينة بين الهدف والمحول. تأكد من أن الأجزاء المتحركة والمحركات في مراحل الترجمة إما خارج الخزان أو فوق خط المياه لتجنب تلف المياه.
ثم، ملء خزان مع المياه degassized degased تصل إلى المستوى الأفقي لحامل العينة، قبل الاستفادة من محول الغمر. باستخدام المكونات البصرية غير المركّبة والمتاحة تجارياً، تأكد من أن المحول في وضع مائل فيما يتعلق بالمسار البصري. وهذا سيضمن توجيه أي موجات تنعكس بعيدا عن العينة.
ضبط تردد مولد الدالة إلى تردد الذروة الاسمية من محول. ثم، إنشاء نبض الجهد الجيوب الأنفية من المدة المطلوبة وتكرار التكرار، وذلك باستخدام وضع انفجار من مولد الدالة. بعد ذلك، ضبط الجهد من الذروة إلى الذروة إلى القيمة المطلوبة.
تأكد من أن مدة النبض أقصر من الوقت المنقضي بين نبضتين متتاليتين. توصيل إخراج مولد الدالة إلى إدخال منظار. استخدم منظار التناضح للتأكد من أن الشكل الموجي يتوافق مع الإشارة المطلوبة.
ثم، قم بتوصيل إخراج مولد الدالة بمدخلات قوة مكبر للصوت RF الحجم بشكل صحيح. باستخدام مسبار هيدروفون يعمل مع نطاق تردد وكثافة صوتية متوافقة مع تلك التي من محول الموجات فوق الصوتية، بعناية جلب تلميح المسبار في التركيز داخل مجال رؤية الهدف في موقف العينة. تأكد من أن كل من المسبار والمحول مغمورة في حمام الماء وأداء إجمالي قبل المحاذاة من محول عن طريق وضع بصريا محورها الصوتية نحو مسبار هيدروفون.
تأكد من أن المسافة بين الاثنين تتوافق مع طول محور محول. لا عثرة غيض من هيدروفون مع أي كائن المادية غير الماء، وهذا سوف يغير من الطلاء وتؤثر على القياس. بعد ذلك، قم بتوصيل خرج الهيدروفون بأحد مدخلات إشارة المنظار.
ثم، قم بتوصيل مشغل المزامنة من مولد الدالة إلى إدخال آخر أوسيلسكوب. تصور كل من الإشارات في وقت واحد على منظار. المقبل, محرك محول مع دورات الموجات فوق الصوتية قليلة في دورة منخفضة العمل والسعة المنخفضة لتجنب إتلاف المسبار.
تحقق مع ظروف التشغيل الآمن لمصنع الهيدرو فون لتجنب إتلاف طرف الهيدروفون. ضبط مقبض الباب S-القسمة وفقا لوقت السفر من الموجات فوق الصوتية من سطح محول إلى الهيدروفون. ابحث عن إشارة هيدروفون على منظار بعد مشغل المزامنة.
بعد ذلك ، يتم تفعيل المحول ببطء باستخدام مرحلة XYZ مزودة بمحركات أو يدوية. ضع المحول في الموضع الذي يرتبط بإشارة الهيدروفون القصوى. مع شعاع الانحياز الآن، وقياس السعة من الذروة إلى الذروة من إخراج الهيدروفون في منظار لمختلف الفولتية القيادة محول.
تأكد من عدم تجاوز حد الضغط من الهيدروفون. استبدل متوسط ثقافة الخلية بمخزن التصوير المطلوب الذي يحتوي على خمسة ميكرومولار من صبغة مُحسّنة للكالسيوم، مثل Fluo-4 AM. ثم، احتضان طبق الثقافة في حاضنة لديها ثاني أكسيد الكربون في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد الحضانة، وغسل الخلايا بعناية مع نفس العازلة خالية من الصبغة.
ثم، ضع الطبق في حامل العينة. تثير الخلايا باستخدام الضوء الأزرق الإضاءة في 490 نانومتر. ضبط شدة الإثارة والتعرض للكاميرا لتجنب التبييض المفرط أو التشبع بكسل.
قم بإجراء تصوير لفاصل الوقت باستخدام هدف الانغماس مع مسافة عمل طويلة لتحسين جودة الصورة، وتقليل الانعكاسات غير المرغوب فيها. هنا، تظهر خلايا الورم الأرومي الدبقي على فيلم البوليستر المغلف بالمصفوفة خارج الخلية في وسط الثقافة القياسية. وقد تم احتضان هذه الخلايا مع مراسل الفلورسنت الحساسة للكالسيوم.
في هذه الصورة، تمثل النقاط الحمراء خلايا فلورية فردية، يتم تحديدها باستخدام برنامج معالجة الصور. على التحفيز لمدة 10 ثانية مع الموجات فوق الصوتية، تم تصور ارتفاعات الكالسيوم قوية في العديد من المناطق ذات الاهتمام. يتم عرض عدد المناطق التي تم تنشيطها من الاهتمام هنا مع مرور الوقت.
بعد التنشيط 10 ثانية مع الموجات فوق الصوتية، تم العثور على ما يقرب من 70٪ من المناطق لتكون فوق القيم الحدية المحددة من قبل المستخدم. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن تتذكر أن تحاذي شعاع الموجات فوق الصوتية قبل إجراء قياس الفلوريسنس.
