أظهر هذا البروتوكول طريقة بسيطة وقابلة للنتاج لتقييم قدرة البلعمة من الضامة باستخدام الإشريكية القولونية المعبر عنها EGFP. مرحباً، اسمي جون يو من المستشفى الثاني في جامعة داليان الطبية. اليوم نحن نذهب لتظهر لك سهلة وتصور طريقة لتقييم البلعم البلعم الضامة التي يمكن القيام به بسهولة في غضون ساعتين.
وقد استخدمت هذه الطريقة على نطاق واسع في دراسة وظيفة المناعة الفطرية. ويعتقد أن وظيفة المناعة الفطرية ظلت سليمة في كبار السن. لذا اليوم سنقوم بعزل الضامة البريتونية عن الفئران القديمة والصغار ونرى القدرة البلمائية لهاتين المجموعتين.
حسناً، لنبدأ أولا، توليف جزء الجينات EGFP واستنساخ جزء باستخدام عالية الدقة طق DNA البوليميراز. ثم ligate المنتج PCR في متجه PET سومو.
ثالثا، تحويل منتجات الربط إلى سلالة الإشريكية القولونية والحث EGFP التعبير مع اللاكتوز. هذه EGFP التعبير عن الإشريكية القولونية بمثابة علامة لمقايسة البلعميات. بعد ذلك ، تم عزل الضامة الصفاقية الماوس و مثقف.
ثم، تم احتضان الإشريكية القولونية المعبر عنها من EGFP مع الضامة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. بعد خطوة التبريد ، كانت الضامة جاهزة للتقييم من قبل كل من مجهر الفلوريسنس ومقياس التدفق. توليف جزء الجين EGFP وتضخيم جزء مع التمهيديات إلى الأمام وعكس باستخدام عالية الدقة طق الحمض النووي البوليمرات.
لضمان أن منتجات PCR كان واحد من ثلاثة نهاية الأدينين تتراكم لاستنساخ TA في الخطوة التالية، ويوصى تمديد 30 دقيقة في 72 درجة مئوية بعد الدورة الأخيرة. تحقق من المنتج PCR بواسطة agarose هلام الكهرباء. إذا تم تضخيم الجزء بشكل صحيح ، يمكن ملاحظة نطاق 717 BP على الجل.
استنساخ المنتج PCR في متجه PET سومو باستخدام طريقة استنساخ TA مع T4 الحمض النووي ligase. احتضان رد الفعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. إضافة خمسة ميكرولتر من المنتج PCR إلى 100 ميكرولتر من الخلايا المختصة BL21.
سخني الخلايا عند 42 درجة مئوية لمدة 90 ثانية، ثم حافظ على الخليط على الجليد لمدة ثلاث دقائق. إضافة 400 ميكرولتر من LB المتوسطة، محمّاة في 37 درجة مئوية. تهتز ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية و120 دورة في الدقيقة.
تلقيح البكتيريا على سطح لوحة LB مع 100 ميكروغرام لكل ملليلتر كاناميسين لفحص الإشريكية القولونية المتحولة ناقلات. احتضان لوحة في فرن 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، تلقيح مستعمرة إيجابية في خمسة ملليلتر من وسائل الإعلام LB مع 100 ميكروغرام لكل ملليلتر kanamycin.
احتضان في 37 درجة مئوية تهتز الحاضنة في 120 دورة في الدقيقة لمدة ساعتين. ثم إضافة اللاكتوز المحرض إلى تركيز نهائي من 0.5 ملليمول للتر الواحد والاستمرار في الاهتزاز ست ساعات, مما يؤدي إلى التعبير EGFP. تجريبيا، عندما تهتز ست ساعات، قد تصل إلى 0.7 OD600 أو أعلى.
وأخيرا ، باستخدام المجهر fluorescence للتحقق من مدى التعبير EGFP. إضافة 10 ميكرولتر من ثقافة البكتيريا المتوسطة إلى شريحة. ثم تغطية مع زلة الغطاء.
فحص التعبير عن EGFP تحت المجهر المفلور. إضافة 3.5 غرام من ثيوغليكولات في 100 ملليلتر من الماء المقطر. تعقيم في الأوتوكلاف قبل الاستخدام.
التعرق الوسيط thioglycollate في حقنة معقمة ملليلتر واحد في غطاء محرك السيارة. فأر واحد لكل حقنة لتجنب العدوى. حقن ملليلتر واحد من 3.5٪ thioglycollate المتوسطة في تجويف الماوس البريتوني باستخدام إبرة 23 قياس والحفاظ على الماوس مع الماء والمواد الغذائية الإعلانية libitum لمدة ثلاثة أيام.
بعد ثلاثة أيام ، euthanize الماوس عن طريق خلع عنق الرحم بعد تحريض التخدير بسرعة عن طريق sevoflurane في مربع مغلق. ثم، وضع الماوس في طبق مع 75٪ الإيثانول إلى العقيمة ونقلها إلى غطاء محرك السيارة بسرعة. وضع الماوس على لوحة ودبابيس مخلب الجبهة على متنها لإصلاح موقف الماوس.
باستخدام حقنة من خمسة ملليلتر مع إبرة 20 قياس، حقن خمسة ملليلتر من PBS الباردة في أسفل البطن في تجويف الصفاق الماوس، وتجنب ثقب الأمعاء. قم بإجراء تدليك لطيف على جانبين من بطن الماوس. ثم pirate السائل البطن بلطف وببطء.
الاستغناء عن السائل البريتوني في أنبوب جهاز طرد مركزي 50 ملليلتر. كرر هذه الخطوات مرتين أو ثلاث مرات. أجهزة الطرد المركزي الخلايا المعلقة لمدة 10 دقائق في 400 غرام في أربعة إلى ثمانية مئوية.
تجاهل السوبر و resuspend بيليه الخلية في 1640 1640 متوسطة مع مصل الأبقار الجنينية 10٪. إضافة خمسة ملايين خلية في كل بئر من لوحة ستة جيدا لمقايسة قياس الخلايا تدفق و 500، 000 خلية في بئر في لوحة 24-well للمجهر المفلور. زراعة الخلايا في 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪ بين عشية وضحاها.
يمكن تحديث الوسيطة الثقافية بعد ثلاث ساعات لإزالة الخلايا غير المُخلّصة لأن معظم هذه الخلايا كانت من الخلايا اللمفاوية. مراقبة الخلايا تحت المجهر الميداني مشرق لتقييم صلاحية الخلية وكثافة الخلية. الصورة المعروضة هنا كانت في حالة عادية للخلية الأساسية.
عادة، لم تكن كثافة خلايا الضامة عالية، لأن الجزء الرئيسي من الخلايا الصفاقية كان الخلايا اللمفاوية. إزالة المتوسطة الثقافة من لوحة 24-well. إضافة 100 ميكرولتر من ثقافة جديدة المتوسطة و 10 ميكرولتر من المتوسطة البكتيرية.
ثم احتضان لوحة في 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪ لمدة ساعة واحدة. غسل بلطف مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الباردة في بئر ثلاث إلى خمس مرات لغسل البكتيريا غير مستوعب. احتضان الخلايا مع 4٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
اغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات. إضافة phalloidin 633 حل العمل conjugate لطخة F-actin. يُحفظ في مكان مظلم ورطب في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة.
إضافة DAPI حل العمل لطخة النووية وخلية احتضان لمدة خمس دقائق في مكان مظلم في درجة حرارة الغرفة. شطف مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني ومرة واحدة مع نفس الحجم في الماء المقطر. E.coli التعبير عن EGFP المعروضة باللون الأخضر بمثابة علامة البلعوم.
لتقليل الأخطاء التجريبية و إجراء تفسير مناسب للنتائج، تعيين مجموعات وتحكم أنابيب للتجربة كما هو موضح في الجدول 2. بالنسبة لمجموعة التحكم التي سيتم وضعها على الجليد، قم بإزالة الوسط من لوحة الستة جيداً واغسلها مع برنامج تلفزيوني مرة واحدة. ثم إضافة 70 ملليمول لكل لتر EDTA الباردة ملليلتر واحد في البئر لفصل الخلايا ونقلها إلى أنبوب تدفق الخلايا.
إضافة 50 ميكرولتر من التعليق البكتيري في الأنبوب ووضعها على الجليد لمدة ساعة واحدة. بالنسبة للمجموعات الأخرى، قم بإزالة الوسط الثقافي، أضف متوسط طازج واحد في كل بئر. إضافة 50 ميكرولتر من تعليق البكتيريا في الآبار وفقا لوضع المجموعة كما هو موضح في الجدول الثاني.
ثم ضع لوحة الستة بئر في 37 درجة مئوية 5٪ حاضنة ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة. لإخماد الفلوريس من الإشريكية القولونية غير الداخلية، إضافة 200 ميكرولتر من 0.8٪ محلول المياه البنفسجية الكريستال في البئر وتتمايل قريبا. تهدف هذه الخطوة إلى تجنب نتيجة إيجابية كاذبة من قبل EGFP E.coli ملزمة إلى سطح الضامة ولكن ليس داخليا.
اغسل الخلايا باستخدام PBS ثلاث مرات لإزالة أي بنفسجي بلوري متبقي. ثم إضافة 70 ملليمول لكل لتر EDTA الباردة ملليلتر واحد في البئر لفصل الخلايا ونقلها إلى أنبوب تدفق الخلايا. الطرد المركزي الأنابيب 2، 000 دورة في الدقيقة خمس دقائق والتخلص من الفائق.
إضافة 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لإعادة تعليق الخلايا. إضافة خمسة ميكرولتر من F4 ATP الأجسام المضادة مترافق في الأنابيب أو isotype وفقا لإعداد المجموعة. دوامة لفترة وجيزة واحتضان العينات على الجليد لمدة خمس إلى 10 دقائق في الظلام.
إضافة ملليلتر واحد برنامج تلفزيوني في كل أنبوب والطرد المركزي 2، 000 دورة في الدقيقة خمس دقائق. تجاهل المُندفع. Resuspend الكريات الخلية مع 200 إلى 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لتحليل تدفق الخلايا.
تشغيل كل أنبوب والحصول على بيانات عن ما لا يقل عن 10،000 الأحداث من الخلايا الإيجابية F4/80. وهنا صور الفلوريسنس من الضامة البريتونية من الفئات الشباب والمسنين. الفلورس الأحمر يمثل F-actin.
الأخضر يمثل EGFP التعبير عن E.coli، والأزرق يمثل نواة ملطخة DAPI. تشير هذه الصور إلى أن الضامة من الفأر الصغير كان لها قدرة بيتهانية أقوى من تلك التي من الفأر المسن. وأشارت الخلايا الإيجابية F4/80 و EGFP إيجابية إلى القدرة البلمائية.
هذه النتائج تتفق مع اتجاه نتائج المجهر المفلور. حسنا، كما ترى، على الرغم من أن عدد الخلايا المناعية الفطرية قد يتم الحفاظ عليها في الماوس المسنين، فإن القدرة البلعوية انخفضت بشكل كبير مقارنة بالفأر الصغير. وقد استخدمت العديد من الطرق لتقييم البلم الضامة البلعميات.
هنا نبرهن على طريقة محسنة هي مريحة وسريعة ومجدية اقتصاديا. مع الإشريكية القولونية المعبرة عن EGFP ، يمكن إجراء مقايسة البلعوم بسهولة وقياسها عن طريق كل من مقياس التدفق والمجهر الفلوري وفقًا لتفضيله الباحث. أيضا يقيس هذا أسلوب مباشرة القدرة بَعَمَع.
النتائج هي أكثر استنساخ من الأساليب غير المباشرة الأخرى.
