يسمح هذا الأسلوب لتحديد كمي دقيق من الهستونات الأساسية H3 و H4 و تعديلاتها بعد الترجمة من مستخلصات الخلايا والأنسجة مما يؤدي بالتالي إلى توليد نتائج عالية الجودة وقابلة للاستنساخ. تقنية المعروضة لها ثلاث مزايا رئيسية. أولاً، فإنه يحافظ على التعديلات الأصلية اللاحقة الترجمة من النغمات.
ثانياً، يتجاوز أساليب منخفضة الإنتاجية باهظة الثمن. وأخيراً، وهو متوافق تماماً مع التطبيقات متوسطة الإنتاجية المتلقية للمعلومات. وسوف يكون إثبات الإجراء كارولينا Janczura طالبة الدراسات العليا الموهوبين من مختبري الذين الأمثل تماما هذا البروتوكول، واستخدام هذه التقنية للإجابة على الأسئلة الهامة المتعلقة بتنظيم اللاجينية في مرض الزهايمر.
لبدء لوحة الخلايا في 10 سنتيمترات الأنسجة الأطباق المعالجة مع وسائل الإعلام المناسبة ثقافة الخلية وفقا لبروتوكول النص. السماح للخلايا أن تنمو حتى تصل إلى حوالي 90٪ التقاء. بعد الخلايا قد وصلت إلى التقاء المطلوب بلطف وسائل الإعلام الثقافة وغسل الخلايا مرتين مع وسائل الإعلام المصل مجانا مسبقا.
بعد ذلك، قم بإزالة الوسائط الخالية من المصل من الخلايا ووضع أطباق 10 سنتيمترات على الجليد. إضافة ملليلتر واحد من الجليد الباردة استخراج العازلة إلى كل طبق. باستخدام مكشطة الخلايا البلاستيكية جمع الخلايا في المخزن المؤقت استخراج ونقلها إلى أنبوب 1.5 ملليلتر المسمى.
ثم ضع الأنابيب على الجليد. إذا تم استخدام الأنسجة المجمدة، ضع الأنسجة في أنبوب 1.5 ملليلتر المبردة قبل ذلك واذابها لفترة وجيزة على الجليد. التالي التجانس أنسجة المخ مع التجانس المحمولة باستخدام الكمية الموصى بها من العازلة استخراج وعدد من السكتات الدماغية.
التجانس هو كامل عندما لا تكون هناك شظايا الأنسجة مرئية والحل يأخذ على مظهر حليبي. بعد ذلك، استخدم ماصة أحادية القناة 1، 000 ميكرولتر لنقل المتجانسة إلى أنبوب 1.5 ملليلتر المبردة ووضع الأنابيب على الجليد. ضع الأنبوب الذي يحتوي على الخلايا والأنسجة الدماغية المتجانسة على منصة دوارة تدور عند 15 RPMs عند أربع درجات مئوية.
بعد ذلك، الطرد المركزي الأنبوب في السرعة القصوى لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. المقبل نقل المناط إلى أنبوب جديد قبل المبردة 1.5 ملليلتر والتخلص من بيليه. بعد ذلك تحييد histones مع حجم 1 /4 من عازلة تحييد، ومزيج عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا.
استخدام شرائط درجة اله PH للتحقق من درجة اله من الخليط، وتعديل مزيد من درجة اله PH مع عازلة تحييد إذا لزم الأمر. إذا لم يتم تحييد الهستونات الحمضية خلال هذه الخطوة، فإنها لن ترتبط غشاء العمود بشكل صحيح، وسوف تمر من خلال ذلك، وسيتم الكشف عنها في تدفق من خلال. إضافة 37.5 ميكرولترات من العينة إلى 12.5 ميكرولترات من المخزن المؤقت العينة.
بعد إزالة الطرد المركزي وجيزة الخليط في 99 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، ضع الأنابيب على الجليد وتدور عليها لفترة وجيزة لجمع المكثفات. قم بتحميل العينة على هلام SDS-PAGE وتشغيل الجل بسرعة 100 فولت لمدة ساعة واحدة.
ثم وصمة عار هلام بين عشية وضحاها. و destain ذلك خلال ثلاث يغسل متتالية. أولا إضافة 500 ميكرولترات من المخزن المؤقت لتكواد كل عمود تدور.
الطرد المركزي العمود لمدة ثلاث دقائق. تجاهل تدفق من خلال وتكرار الطرد المركزي مرة أخرى. بعد هذا إضافة 500 ميكرولترات من العينة إلى العمود.
الطرد المركزي العمود لمدة ثلاث دقائق وجمع تدفق من خلال. ثم قم بتحليل تدفق العمود كما هو موضح مسبقًا. إضافة 500 ميكرولترات من المخزن المؤقت الغسيل إلى العمود.
الطرد المركزي العمود لمدة ثلاث دقائق وجمع تدفق من خلال. نقل العمود إلى أنبوب جديد يسمى 1.5 ملليلتر. إضافة 50 ميكرولترات من العازلة elution histone إلى العمود.
بعد الطرد المركزي العمود حفظ تدفق من خلال تحتوي على بروتينات هيستون. تحت غطاء محرك السيارة الكيميائية إضافة حمض perchloric إلى histones تنقية لتحقيق تركيز نهائي من حمض perchloric 4٪. الماصات صعودا وهبوطا ست مرات لخلط.
إذا كانت الهستونات في العينة مركزة جدا، وسوف تصبح حل غائم بعد إضافة حمض بيركلوريك. بعد ذلك، احتضان الأنبوب في أربع درجات مئوية لمدة 24 ساعة. إذا كان هطول الأمطار بين عشية وضحاها هيستون ناجحة، سوف بيليه بيضاء صغيرة تكون مرئية على الجزء السفلي من القارورة بعد خطوة الطرد المركزي.
عند غسل بيليه في الخطوات المتتالية أؤكد لا يزعج بيليه كما يمكن بسهولة فصل من قاع القارورة. في اليوم التالي الطرد المركزي العينات لمدة 75 دقيقة في أنابيب الطرد المجهري المبردة مسبقا. pirate بعناية عظمى وإضافة 500 ميكرولترات حمض بيركلوريك الجليد الباردة إلى العينة بيليه.
بعد الطرد المركزي للعينة لمدة 10 دقائق في السرعة القصوى، pirnatate فائقة. إضافة 500 ميكرولترات من الأسيتون الجليد الباردة إلى العينة مع الحرص على عدم إزعاج بيليه. بعد ذلك إزالة ناظر والسماح للأنابيب لتجف غير المغطاة على الجليد لمدة 30 دقيقة.
ثم إزالة الأنابيب من الجليد والسماح للعينة لتجف في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد بيليه هو resuspend الجافة في 30 ميكرولترات من الماء المعقم. اِكِلَ الأنابيب واسمح للهستونات بإعادة تشكيلها على الجليد لمدة 30 إلى 50 دقيقة.
بعد التحقق من أن بيليه هو resuspended، خلاصة الأنابيب وإزالتها من الجليد. في هذا البروتوكول تم تنقية الهستونات من خلايا BV-2 الدقيقة البشرية وتم تحليل تكوين الاستخراج. يُظهر الجل الملون أن أوقات الاستخراج بين 15 دقيقة و 24 ساعة لم تؤثر على التكوين العام لمقتطفات حجر الهستون الخام.
تم تحليل كفاءة ربط هيستون لمصفوفة العمود عن طريق تلطيخ الجل. وكان كفاءة العمود ما يقرب من 100٪ كما يتضح من عدم وجود بروتينات هيستون يمكن الكشف عنها في تدفق العمود من خلال. بغض النظر عن مدة استخراج الوقت، أي.
15 دقيقة أو ساعتين أو 24 ساعة غسل العمود الأول يلغي أكبر كمية من البروتينات غير هيستون من استخراج. تحتوي كسور بروتين الحجر الهستون المنقى من مجموعة الاستخراج على مدار 24 ساعة على المزيد من الهستون H3 و H4 بالمقارنة مع أوقات الاستخراج لمدة 15 دقيقة وساعتين.
وكان elution العمود الأول ما يقرب من 100٪ كفاءة كما يتضح من نقص البروتينات هيستون في eluate الثاني. ثم تم استخراج الهستونات الخام من دماغ الماوس كله وتم قياس التعديلات اللاحقة للترجمة. استجابة لمثبط HADC على نطاق واسع، tributyrin، H4K12 أستيل زيادة في استخراج.
ومع ذلك ، فإن خصوصية الجسم المضاد انخفضت بسبب وجود الشوائب في استخراج الخام. تم الانتهاء من بروتوكول تنقية الحجر الهيستون مع قشرة الجبهية من الفئران ثلاثية محورة وراثيا A / D تعامل مع مثبطات HAC من الدرجة الأولى وIB HDAC، M344، وتم تقييم جزء حجر الستون الأساسية النقية واحدة للتغيرات في أسيتيل H4K12. تم الكشف عن مجموع الهستونات ولوحظت زيادة كبيرة في أسيتيل H4K12 استجابة ل M344.
أثناء محاولة هذا الإجراء من المهم أن نتذكر أن تقوم بإجراء نقاط التفتيش المتعددة الموصوفة في البروتوكول للتحقق من صحة تنقية حجر الهى الناجحة طوال العملية. وبعد هذا الإجراء، يمكن معالجة أسئلة إضافية تتعلق بالفوسفورة الهيستون وحالة الميثيل. وقد مهد تطوير هذه التقنية الطريق للباحثين في مختبرنا لتحليل الآليات الوراثية المشاركة في مرض الزهايمر.
ومع ذلك يمكن استخدامه في مجموعة متنوعة من نماذج الأمراض حيث يتم افتراض تعديل الكروماتين للعب دور مهم.
