يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية، مثل كيفية تخفيف نشاط الجين بشكل إيجابي، من خلال الاستفادة من الـ mRNAs الموجودة في الخلايا والأنسجة. كيفية التعويض عن أوجه القصور في النشاط، وكيفية تحقيق ترجمة عالية من mRNAs في المختبر وفي الجسم الحي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكننا على مستوى العالم فحص الجينات المستهدفة SINEUP في الخلايا الحية ، عن طريق التصوير دون تثبيت وجمع.
وبالتالي فإن الآثار المترتبة على هذه التقنية تمتد إلى العلاج لدينا من حالات haploinsufficient، لأن SINEUPs يمكن أن تحفز زيادة ضعفي في البروتين الناقص، مثل frataxin في حالات ترنح فريدريش. للبدء، افتح متصفح Zenbu، وانقر على قاعدة بيانات مشروع فانتوم ذات الاهتمام. البحث في الجين الهدف، والتحقق من موقع بدء النسخ، أو TSS، ومستوى التعبير في الخلايا والأنسجة المطلوبة.
لتحديد TSS، راجع مثال تحليل بروتين مرض باركنسون سبعة، أو PARK7 مرنا. تحقق TSS حسب منطقة ذروة القفص. لتحديد مستويات التعبير النسخية الخاصة بالخلايا والأنسجة، حدد منطقة ذروة القفص وانقر على تكبير منطقة الجينوم للتحديد.
تحقق من التعبير PARK7 في نوع الخلية والأنسجة من الفائدة، من خلال استكشاف قائمة التعبير النص في الجزء السفلي من الصفحة. ثم، تصميم تسلسل المجال ملزمة من عدة أطوال مختلفة المقابلة 40 قواعد المنبع، و 32 قواعد المصب من الميثيونين الأول أو أغسطس. قبل نقل الدم مع SINEUPs، خلايا البذور ذات الأهمية على اثنين من بولي دي ليسين المغلفة 24 لوحات جيدا، كما هو موضح في المخطوطة.
احتضان لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 خمسة في المئة لتحقيق التقاء 70 في المئة. من المهم جدا لتوزيع الخلايا بالتساوي في الآبار، لهذا الغرض يهز بلطف لوحة 10 مرات ذهابا وإيابا بعد بذر الخلايا داخل مقعد نظيفة، وتكرار في حاضنة CO2 خمسة في المئة. بعد الحضانة، تغيير المتوسطة إلى 0.4mL من المتوسطة الطازجة.
لتحليل SINEUP-GFP جعل عدة أنابيب 1.5mL مع 0.1mL من حل مختلط، مع pEGFP-C2، SINEUP-GFP، الكواشف transfection و OptiMEM في كل أنبوب، ومن ثم احتضان الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. إضافة 0.1mL من هذا الحل المختلط من كل أنبوب إلى بئر منفصلة من 24 لوحة بئر، وتسمية هذه الآبار مع SINEUP-GFP واحد، اثنين، ثلاثة، أربعة، وخمسة. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 خمسة في المئة لمدة 24 ساعة.
بعد 24 ساعة، وغسل الخلايا مع 0.5mL من برنامج تلفزيوني. إضافة 25uL من 0.05 في المئة الوزن لكل حجم التربسين، واحتضان في حاضنة CO2 خمسة في المئة لمدة خمس دقائق. إضافة 275uL من خلية المتوسطة في البئر.
لاستخراج البروتين، واتخاذ واحدة من اثنين من لوحات، وحصاد 225uL أو ثلاثة أرباع الخلايا من بئر واحد، و 75uL أو ربع الخلايا لاستخراج الحمض النووي الريبي، كل في أنبوب 1.5 مل منفصلة. جهاز طرد مركزي عند 6000xg لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد الطرد المركزي، قم بإزالة المابير من الأنبوب المسمى عزل البروتين.
إضافة 60uL من محلول التحلل إلى الخلايا ومزيج عن طريق المزج الأنابيب بدقة عن طريق تدوير بسرعة بطيئة لمدة ساعة واحدة في أربع درجات مئوية. الطرد المركزي الأنبوب في 14، 000xg لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية لجمع البروتين الفائق. لتحديد تركيز البروتين، قم أولاً بإعداد خمس إلى ست مرات من تخفيف بروتين مصل البقر الطازجة في الماء النقي جداً، مع تركيزات تتراوح بين 0.2 إلى 1.5 ملغ/مل بروتين.
لإعداد عامل الكاشف مزيج داش إضافة 20uL من الكاشف S إلى مل واحد من الكاشف A في أنبوب مل اثنين. إضافة خمسة uL من الماء كتحكم سلبي. وبعد ذلك، BSA معيار أو عينة البروتين في كل بئر.
إضافة 25uL من الكاشف A داش، ثم قم بإضافة بعناية 200uL من الكاشف B في بئر، وتجنب أي تشكيل فقاعة. غطي الطبق برقائق الألومنيوم لاحتضانه في درجة حرارة الغرفة، لمدة خمس إلى ثماني دقائق. قياس امتصاص البروتين في 750nm مع مطياف.
إعداد منحنى قياسي عن طريق رسم تركيزات البروتين القياسية BSA على المحور س، وامتصاص كل منها على محور y. تطبيق معادلة منحنى قياسي لحساب تركيز البروتين العينة. لبدء فصل البروتين، إضافة حجم واحد من صبغة التحميل 2x إلى كل حجم من عينة البروتين.
سخني 90 درجة مئوية لمدة خمس دقائق، وبرد على الجليد على الفور لمدة دقيقة واحدة. تحميل 10 إلى 20 ميكروغرام من عينات البروتين إلى 10 في المئة SDS هلام polyacrylamide وفصل في 100 إلى 150V. نقل البروتين من هلام، إلى 0.5 ميكرومتر النيتروسليلوز الغشاء، عن طريق أداة نقل شبه الجافة.
تعبئة مع المخزن المؤقت نقل في 25V لمدة 30 دقيقة. بعد النقل ، ضع الغشاء في وعاء ، وأضف محلول الحجب حتى يتم نقع الغشاء تمامًا ، واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة مع الاهتزاز. إضافة الأجسام المضادة المناسبة إلى حل حجب، وصب على الغشاء.
التهجين عن طريق احتضان الغشاء لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، في حين تهتز. بعد التهجين، وغسل الغشاء بإضافة 1X TBST العازلة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، وكرر مرتين أكثر. تنفيذ التهجين المقبل مع جسم مضاد الثانوية المخفف في محلول منع على الغشاء، في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة أثناء الاهتزاز.
ثم غسل الغشاء بإضافة 1X TBST العازلة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، وكرر مرتين أكثر. نقل الغشاء إلى مربع مليئة اثنين مل من هكهى الموارد البشرية تعزيز مزيج الكاشف ECL. غطي الصندوق بورق الألومنيوم، وينضّب لمدة دقيقة إلى دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.
قم بإزالة الغشاء بعناية من مزيج كاشف ECL، وفضحه باستخدام أداة تصوير الإنارة. لتحليل تأثير SINEUP-GFP في الخلايا عن طريق التصوير، قم بغسل pEGFP-C2، وخلايا SINEUP-GFP من ثاني 24 بئراً مع 0.5 مل من PBS لكل بئر. لطخة النواة، إضافة 2 ميكروغرام من Hoechst-33342 إلى كل بئر، واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية، لمدة 20 دقيقة.
استخدام مقياس خلايا الصورة microwell microwell عالية الإنتاجية لقياس خلايا هويشست الملون، لحساب العدد الإجمالي للخلايا. قياس شدة الفلورس الأخضر لحساب عدد الخلايا الإيجابية GFP. لتحليل تأثير التراكم البروتيني للـ SINEUPs، استخدم برنامج التصوير لتحديد كثافة GFP المتكاملة حسابها كمجموع كل كثافة بكسل عرض إشارات في الكائنات المجزأة التي تم الحصول عليها لكل قناة.
بعد عملية نقل ناجحة مع SINEUP-GFP، وهو SINEUP الاصطناعية التي تحتوي على كل من مجال الربط الأمثل ومجال الأثر GFP، تم رفع ترجمة MRNA دون تغيير التعبير من الحمض النووي العام. وقد أدى بروتوكول تحليل الصور شبه الآلي إلى تحسين وقت الكشف وزيادة عدد العينات التي يتم فحصها في وقت واحد مقارنة بتحليل البقعة الغربية التقليدية. على الرغم من وجود فرق في كثافة الإشارة، من 2.6 ضعف في تحليل البقعة الغربية إلى 1.4 ضعف في تحليل التصوير، تم الكشف عن مستويات أعلى بكثير من الفلوريسينس GFP مقارنة بالسيطرة.
أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن تتذكر لتحديد التسلسل الصحيح من mRNAs الهدف لتصميم مجال الربط الصحيح. وغالبا ما يتم نسخ الجينات من المروجين، ويمكن استخدام موقع بدء الترجمة المختلفة. متصفح Zenbu هو أداة مفيدة جدا لاستكشاف هذا التباين مرنا.
نقترح أيضا تصميم SINEUPs مختلفة مع مواقع الربط المتغير. وإجمالا، نعتقد أن التكيف السريع مع أهداف سينويب مع عدد كبير من الأهداف سينشئ مجالا جديدا يتمثل في ترجمة منظمة بشكل إيجابي للرناب الرنا الحالية، وهو مجال تبادلي ومجامٍ لحقل الرنا. جزء من تلك الوظيفة ونحن نتصور أن هذه التكنولوجيا سوف تكون مفيدة لإنتاج كميات أكبر من البروتينات في المختبر، مثل المفاعلات الحيوية، وكذلك في الجسم الحي لتصحيح الجرعة الجينية بشكل طبيعي.
