نقدم طريقة لتحليل الصور الحية من امتصاص الكوليسترول LDL في أنواع الخلايا البشرية المختلفة. هذا يسمح للفحص للمركبات, أن تعديل نقل الكولسترول LDL. والميزة الرئيسية لاستخدام التصوير الخلية الحية لLDL تدفق الكم، هو أنه يسمح رصد مورفولوجيا الخلية طوال مدة الفحص، لذلك يحتمل أن المركبات السامة يمكن الكشف عنها.
لتبدأ, التبخر وسائل الإعلام قبالة الخلايا المعدة سابقا, وغسل الخلايا مع 5 ملليلتر من الفوسفات Dulbecco في المخزنة مؤقتا المالحة. استلهمي DPDS. بجانب فصل الخلايا من طبق 100 ملليمتر، إضافة 1.5 ملليلتر من 0.25٪ تريبسين-EDTA لخلايا HepG2، وإضافة 1.5 ملليلتر من 0.05٪ تريبسين-EDTA حل لخلايا HK2، أو HCAECs.
احتضان لوحات في 37 درجة مئوية لمدة أربع دقائق. ثم تحييد التربسين بإضافة 3 ملليلتر من وسائل الإعلام كاملة للخلايا HepG2 وHCAEC. استخدم 3 ملليلترات من محلول تحييد التربسين، وضروب DPDS مع مصل الأبقار الجنينية 5٪ أو FBS لخلايا HK2.
نقل الخلايا إلى أنابيب مخروطية 15 ملليلتر، ثم الطرد المركزي الأنابيب في 250g لمدة خمس دقائق. بعد تدور، وpirate وسائل الإعلام، و resuspend بيليه الخلية في وسائل الإعلام كاملة. قم بتصفية تعليق الخلايا بلطف من خلال مصفاة شبكة 40 ميكرون لتفريق كتل الخلايا.
عد الخلايا وطبقها في كثافة محسنة في لوحة 24-well. احتضان لوحة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية للسماح للخلايا لإرفاق. في اليوم التالي، تغيير وسائط الخلية إلى الوسائط الأساسية دون FBS لخط الخلية، بالإضافة إلى المصل نقص البروتين الدهني 5٪، أو 2٪ وسائط FBS.
استخدام 500 ميكرولترات من مجموع وسائل الإعلام في بئر في لوحة 24-جيدا. ثم مواصلة حضانة لمدة 24 ساعة لتجويع الخلايا. جنبا إلى جنب مع خطوة تجويع أو في اليوم التالي، يمكن أن تعامل الخلايا مع المركبات المطلوبة والضوابط المناسبة.
بعد 24 ساعة من المجاعة، أضف 5 ميكرولترات من pHrodo red المسمى LDL إلى كل بئر يحتوي على 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام للحصول على تركيز نهائي من 10 ميكروغرام لكل ملليلتر. إزالة بعناية أي فقاعات من الآبار. مباشرة بعد إضافة LDL المسمى، وضع لوحة في حاضنة نظام تحليل الخلايا الحية والسماح لوحة لتكدال لمدة 15 دقيقة للحد من التكثيف في لوحة.
في حين أن الخلايا هي احتضان، وفتح البرنامج وجدولة المسح الضوئي عن طريق إضافة السفينة عقد لوحة. صورة 16 صورة في البئر، إضافة فاصلات ساعة واحدة في التكبير 10x لمدة أربع ساعات باستخدام قنوات الأحمر والمرحلة. ثم قم بإنشاء خريطة لوحة لاستخدامها لمعالجة البيانات، وحدد علامة التبويب الخصائص واختر خريطة اللوحة.
إدخال نوع الخلية في علامة التبويب الخلايا والعلاجات في الصنبور المركب. ثم انقر فوق علامة التبويب المناطق، حدد كل مجموعة من النسخ المتماثل، وتعيين المناطق. بمجرد اكتمال تشغيل تجريبي، إنشاء مجموعة صور في البرنامج لتدريب الكمبيوتر لتحديد كل معلمة المدرجة في مجموعة العد.
في البرنامج، افتح عرض اللوحة، ثم في مربع الأدوات المساعدة المهمة للتحليل، اختر إنشاء أو إضافة إلى مجموعة الصور. حدد مجموعة صور جديدة، واكتب اسمًا لمجموعة الصور، واختر قنوات الأحمر والمرحلة عن طريق تحديد المربعات المجاورة للقنوات. حدد خمس صور أخرى من آبار ونقاط زمنية مختلفة وقم بإضافتها إلى مجموعة الصور عن طريق إضافة إلى مجموعة الصور الحالية.
في مربع الأدوات المساعدة المهمة للتحليل، اختر تعريف معالجة جديد، حدد مجموعة الصور من القائمة المنسدلة، أدخل المعلمات لنوع الخلايا. في مربع المعاينة، استخدم القائمة المنسدلة لتحديد معاينة الكل. في مربع قناع التحليل، تحقق من قناع الالتقاء ومربعات قناع الكائن الأحمر لعرض المساحة المضمنة في التحليل لتعريف المعالجة.
قم بالتمرير خلال مجموعة الصور لضمان تضمين الخلايا و LDL في القناع. حدد الملف واحفظ تعريف المعالجة. بعد ذلك، افتح طريقة عرض اللوحة التجريبية لتحليل مجموعة الصور من المدى التجريبي.
في مربع الأدوات المساعدة مهمة التحليل، اختر بدء تشغيل مهمة تحليل جديدة، وحدد تعريف المعالجة المحفوظة. قم بتسمية وظيفة التحليل، واختر النطاق الزمني للتحليل، وتسليط الضوء على الآبار التجريبية لتحليلها. حدد زر التشغيل.
بمجرد اكتمال مهمة التحليل، قم بتصدير البيانات، وحدد التحليل المكتمل ثم اضغط على طريقة العرض. في قائمة الأدوات المساعدة، اختر تصدير الرسم البياني المتري. في قائمة المناطق، اختر جميع الآبار وفي قائمة المجموعة، للحصول على القيمة الوسطية لكل مجموعة من الآبار كمجموعة، اختر النسخ المتماثلة.
و لتصدير القيم الفردية لكل بئر، اختر لا شيء. في قائمة قياس الكائن الأحمر، اختر إجمالي كثافة الكائن الأحمر المدمجة. حدد زر تصدير البيانات.
تحقق من البيانات الفاصلة إلى صور فردية. يتم نسخ البيانات تلقائياً على الحافظة ويمكن لصقها في ملف جدول بيانات جديد. في القائمة متري كائن المرحلة، اختر الالتقاء، ثم انقر فوق زر تصدير البيانات.
في علامة التبويب موجه، تحقق من البيانات فاصل أسفل إلى الصور الفردية. يتم نسخ البيانات تلقائياً على الحافظة ويمكن لصقها على ملف جدول البيانات الذي يحتوي على إجمالي بيانات الكثافة المدمجة للكائن الأحمر. الآن يمكن تطبيع البيانات المصدرة، وفقا لل خطوتين 4.1.7 و 4.1.8 من البروتوكول، للحصول على قيم امتصاص LDL النهائية.
بعد العلاج مع Dynasore أو المؤتلف PCSK9، وأظهرت جميع خطوط الخلايا البشرية الثلاثة اختبار انخفاض كبير في تدفق LDL على مدى دورة زمنية لمدة أربع ساعات. التدفقات LDL خفضت في سرطان الكبد البشري أو خلايا HepG2، مع علاج Dynasore على مدى الوقت، بالمقارنة مع الخلايا تعامل مع DMSO كتحكم. أظهر التصوير الحي للخلايا من تدفق LDL في خلايا HepG2 في نقاط زمنية مختلفة زيادة في السوق في امتصاص LDL بعد العلاج مع Simvastatin دعم حساسية هذه الطريقة للكشف عن التعديلات الكبيرة في تدفق LDL.
صور في الوقت الحقيقي التحقيق في نقطة الوقت الأولي ونقطة النهاية النهائية, تأكيد مورفولوجيا طبيعية للخلايا بعد العلاج Dynasore, مما يدل على فعالية وسلامة هذا المركب. بعد إضافة المزيد من اللون الأحمر المسمى LDL إلى الخلايا للحفاظ على نشاط الفلورسنت ، من المهم حماية اللوحة من الضوء حتى يتم وضعها في حاضنة نظام تصوير الخلايا الحية. يمكن أن تستجيب الخلايا من مختلف الأعضاء بشكل مختلف للعلاجات ، وهذا يعني في اتجاهين متعاكسين ، أو أنها قد تستجيب في نفس الاتجاهات ولكنها تظهر معدلات مختلفة من التغيير في امتصاص الكوليسترول.
فقط مع التصوير الخلية الحية يمكن الكشف عن مثل هذه الاختلافات وقياسها بدقة.
