أصبحت الأجهزة microfluidic المستخدمة لتقسيم الخلايا العصبية أداة قياسية في علم الأعصاب، مما مكن الباحثين من التلاعب جسدياً وكيميائياً بالمناطق دون الخلية من الخلايا العصبية بما في ذلك سوماتا، ومحور عصبي، والتشعبات، والتشابك العصبي. يمكن أن تساعد هذه الأجهزة الثقافة المجزأة في الإجابة على العديد من الأسئلة في مجال علم الأعصاب ، مثل ، كيف تمتد المحاور أثناء التطوير لتشكيل نقاط الاشتباك العصبي ، وكيف يمكن إعادة تشكيل نقاط الاشتباك العصبي وإصلاحها بعد تلف محور عصبي وكيف يمكن للظروف المرضية أن تنتشر عبر متشابك في أمراض مثل الزهايمر. يصف هذا البروتوكول استخدام رقاقة متعددة الأجزاء البلاستيكية المُكَدَسة مسبقًا لخلايا الفئران الأساسية الخاصة بالثقافة.
الميزة الرئيسية لاستخدام هذه الرقائق هي أنها توفر طريقة سهلة الاستخدام وقابلة للاستنساخ للغاية لتقسيم الخلايا العصبية. ميزة أخرى هي أن هذه الرقائق تسفر عن نمو أكثر صحة وطويلة الأجل من الخلايا العصبية والمحا المحاور المعزولة من الأجهزة المجزأة القائمة على السيليكون السابقة ومتوافقة على قدم المساواة مع المجهر عالية الدقة. كما أن النظم النموذجية الأخرى بما في ذلك الخلايا الجذعية البشرية قادرة على أن تكون مُثقَلة داخل الرقاقة المجزأة المُكَسَمَة مسبقاً.
للبدء، ضع شريحة معقمة متعددة الأجزاء في طبق بيتري. إضافة 100 ميكرولترات من محلول ما قبل التكويد إلى بئر أعلى اليسار من رقاقة والسماح لها بالتدفق من خلال القناة الرئيسية في البئر المجاورة. بعد ذلك، قم بتعبئة البئر السفلية اليسرى من الشريحة بـ 100 ميكرولترات من محلول التكويد المسبق.
هذه المرة، انتظر خمس دقائق للسماح للحل بالتدفق عبر الأخادق الصغيرة. الآن، إضافة 100 ميكرولترات من حل precoding إلى أعلى اليمين جيدا والسماح لها بالتدفق من خلال القناة الرئيسية في البئر المجاورة. بعد 90 ثانية، املأ البئر السفلي الأيمن بـ 100 ميكرولترات من محلول التكويد المسبق واحتضان الشريحة لمدة 10 دقائق.
بعناية زاوية تلميح ماصة، بعيدا عن القناة الرئيسية وpirate الحل من كل بئر. ثم، على الفور إضافة 150 ميكرولترers من برنامج تلفزيوني إلى أعلى اليسار جيدا وانتظر دقيقة ونصف. بعد ذلك، أضف 150 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني إلى البئر السفلي الأيسر وانتظر خمس دقائق للسماح للسائل بالتدفق عبر الأخادق الصغيرة.
ثم، إضافة 150 ميكرولترس من برنامج تلفزيوني إلى الآبار العلوية اليمنى والسفلى اليمنى، في هذا الترتيب. بعد 10 دقائق، مرة أخرى التعرق برنامج تلفزيوني وتكرار خطوات الغسيل للمرة الثانية. بعد الغسيل الثاني ، يُفطّن برنامج تلفزيوني من الآبار كما كان من قبل عن طريق صيد طرف الماصات ، بعيدًا عن افتتاح القناة.
ثم، إضافة 100 ميكرولترات من 0.5 مزيج لكل ميل بولي-D-ليسين الحل، إلى بئر أعلى اليسار من رقاقة. انتظر دقيقة ونصف ثم املأ البئر السفلي الأيسر بـ 100 ميكرولترات من حل Poly-D-Lysine. كرر هذه العملية على النصف الأيمن من الشريحة.
أغلق طبق بيتري. ثم ضع الرقاقة في حاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بعد الحضانة ، شطف الشريحة مرتين مع برنامج تلفزيوني كما هو موضح سابقًا.
المقبل، الطامح في برنامج تلفزيوني من الجهاز. على الفور، إضافة 100 microliters من وسائل الإعلام ثقافة الخلية إلى بئر أعلى اليسار من رقاقة. بعد دقيقة ونصف، أضف الوسائط إلى البئر السفلي الأيسر.
انتظر خمس دقائق للسماح لوسائل الإعلام بالتدفق عبر الأخاقيقات الصغيرة ثم تكرار عملية التعبئة على الجانب الأيمن من الشريحة. إعداد تعليق خلية من الخلايا العصبية فرس النهر الفئران منفصلة وفقا للبروتوكولات المعمول بها. إزالة غالبية وسائل الإعلام في كل بئر من رقاقة ولكن ترك القنوات شغلها.
المقبل، على الفور تحميل خمسة microliters من تعليق الخلية في أعلى اليمين جيدا وآخر خمسة microliters من تعليق الخلية في بئر أسفل اليمين. عند تحميل الخلايا، أشر إلى طرف الماصات نحو القناة الرئيسية. بعد تحميل الخلايا، نقل رقاقة إلى مرحلة المجهر والتأكد من أن الخلايا العصبية في القناة الرئيسية.
بعد انتظار خمس دقائق لخلايا إرفاق، إضافة تقريبا، 150 ميكرولترات من وسائل الإعلام ثقافة الخلايا العصبية إلى كل من الآبار العلوية والسفلى اليمنى. ثم أضف 150 ميكرولترات من الوسائط إلى كل بئر من الآبار العلوية والسفلى اليسرى. غطي طبق بيتري وضع الرقاقة في صينية مرطبة في ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪، حاضنة 37 درجة مئوية.
أولاً، قم بإزالة 20 ميكرولترات من البئر السفلي الأيسر من المقصورة المحورية وضعه في البئر العلوي الأيمن من حجرة الجسم. انتظر دقيقتين للتدفق داخل كل قناة لتككيل. بعد ذلك، قم بإزالة 50 ميكرولترات من الوسائط من مقصورة محور عصبي، وأضف 0.3 ميكرولترات من ملليمتر واحد من الفلور أليكسا 488 إلى هذه الوسائط.
الماصات صعودا وهبوطا لخلط الحل ومن ثم العودة وسائل الإعلام التي تحتوي على صبغة الفلورسنت مرة أخرى إلى مقصورة محور عصبي. عند هذه النقطة، ضع الرقاقة على المجهر والصورة حسب الرغبة. لإجراء axotomy داخل الشريحة، أولا، إزالة الوسائط من مقصورة محور عصبي، والحفاظ على تلميح ماصة بعيدا عن مدخل القناة الرئيسية.
تخزين الوسائط التي تمت إزالتها في أنبوب الطرد المركزي في الوقت الراهن. بعد ذلك، ضع ماصة الطموح بالقرب، إما مدخل القناة الرئيسية للمقصورة المحورية واتّر مقصورة محور عصبي تمامًا. استمر في pirate المنطقة لمدة دقيقة إلى دقيقتين.
استبدل حجرة المحور المحوري بالوسائط المخزنة. تأكد من إزالة المحلّل من المقصورة بالكامل، كما أنّ المحاور تُقطع بالنظر إلى العينة تحت المجهر. ثم، تغطية رقاقة وإعادتها إلى الحاضنة.
للبدء في الخضوع للمناعة المفلورة، قم بإزالة معظم الوسائط من الشريحة، مع الحفاظ على رطوبة المقصورات الداخلية. على الفور، إضافة 100 ميكرولترات من حل التثبيت إلى الآبار العليا من مقصورات محور عصبي و الجسم. بعد دقيقة واحدة، إضافة 100 ميكرولترات من حل التثبيت إلى الآبار السفلية وإصلاح الخلايا لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
إزالة معظم الحل من الآبار وعلى الفور، إضافة 150 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني إلى كل من الآبار العليا من مقصورات محور عصبي و الجسمية. انتظر دقيقتين لبرنامج تلفزيوني لتدفق في الآبار السفلية، ثم، وإزالة برنامج تلفزيوني وشطف الآبار مرتين أكثر باستخدام هذه العملية نفسها. بعد الشطف الأخير، وإزالة معظم برنامج تلفزيوني من آبار رقاقة وعلى الفور، إضافة 150 ميكرولترس من برنامج تلفزيوني مع 0.25٪ تريتون x-100 إلى كل من الآبار العليا من مقصورات محور عصبي و الجسمية.
انتظر لمدة 15 دقيقة ثم، وإزالة معظم السائل من الآبار. على الفور، إضافة 150 ميكرولترات من حل حجب إلى كل من الآبار العليا من المقصورات محور عصبي و الجسمية. بعد 15 دقيقة، وإزالة معظم السائل من الآبار وعلى الفور، إضافة 100 ميكرولترات من الحل الأجسام المضادة الأولية، إلى كل من الآبار العليا من مقصورات محور عصبي و الجسمية.
قم بتغطية الرقاقة لتقليل التبخر واحتضان الخلايا في الجسم المضاد الأساسي لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، شطف الشريحة عن طريق إزالة معظم الحل وإضافة 150 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني إلى كل بئر من الآبار العليا من المقصورات المحورية وsalmatic. بعد خمس دقائق، وإزالة برنامج تلفزيوني من كل من الآبار وتكرار شطف مرتين أكثر.
الآن، إزالة معظم السائل من الآبار وعلى الفور، إضافة 100 ميكرولترات من الأجسام المضادة الثانوية في برنامج تلفزيوني، إلى كل من الآبار العليا من مقصورات محور عصبي وماماتيكة جدا. قم بتغطية الرقاقة لتقليل التبخر واحتضان الرقاقة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. كما هو مبين سابقا ، شطف رقاقة ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني ثم ، جبل وصورة رقائق كما هو موضح في بروتوكول النص المرافق.
يظهر هنا، هو مقارنة جنبا إلى جنب من الخلايا العصبية التي تزرع على رقائق بلاستيكية وأجهزة PDMS. نمو الخلايا العصبية قابلة للمقارنة داخل المنصتين تصل إلى 15 يوما في الثقافة، ولكن في العصور ثقافة أطول، محاور عصبية معزولة داخل رقاقة بلاستيكية، تبدو أكثر صحة مع أقل الضرب. وللمزيد من تصور محاور الحساسية داخل مقصورات محور عصبي، كانت هذه العينات مُلَهَسة أيضاً مناعية بالنسبة لبيتا توبولين الثالث، مما يُظهر نمواً صحياً في محور عصبي داخل الرقائق البلاستيكية في 22 يوماً في الثقافة.
مزيد من تلطيخ مع عينات لمدة 24 يوما يظهر الخلايا العصبية التي تزرع في رقائق بلاستيكية للتعبير عن كل من علامات متشابك مثير ومثبطة، vGlut1 وvGat. وهنا اثنين من علامات متشابك جنبا إلى جنب مع الخلايا العصبية mCherry المسمى الرجعية. لإثبات ملاءمة هذه الشريحة لإصابات محور عصبي ودراسات التجديد ، تم تصوير الخلايا العصبية الرجعية المسماة قبل وبعد 24 ساعة من axotomy.
لمبة التراجع ومحور عصبي تجديد كلاهما واضح بعد axotomy. هذه النتائج هي معادلة للبيانات المنشورة باستخدام أجهزة تستند PDMS. رقائق متعددة المكونات الكلاسيكية توفر خيارا سهل الاستخدام للخلايا العصبية المجزأة التي توفر ثقافات الخلايا العصبية على المدى الطويل، والتي لا تزال قابلة للحياة لفترة أطول من ثلاثة أسابيع.
أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن البذور العدد المناسب من الخلايا العصبية والتأكد من حاضنة الخاص بك هو جيدا ترطيب أثناء الثقافة.
