يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على السؤال الرئيسي في مجال المركزية، مثل توطين البروتين إلى منطقة معينة من الناحية المركزية. الميزة الرئيسية لهذه التقنيات التي نقدمها وسيلة لتركيز المركزية للحصول عليها في اتجاهات متعددة. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى في علم الأحياء السنتية الكلاميومودوناس، فإنه يمكن أيضا أن تطبق على نظام آخر، مثل الإنسان المعزول وcparmecium centrioles.
ومن خلال هذا الإجراء، سيكون طالب الدكتوراه نيكولاي كلينا، وطالبة دكتوراه أخرى هي مايفا لو غيينك، وطالبة ما بعد الدكتوراه في المختبر دافيدي غامباروتو. لبدء هذا الإجراء أولاً تحضير كافة الوسائط و الثقافة الخلايا C.Reinhardtii كما هو موضح في بروتوكول النص. نقل الخلايا المعدة إلى أنابيب مخروطية 50 ملليلتر والطرد المركزي لهم في 600 مرة ز لمدة 10 دقائق.
غسل بيليه مرة واحدة مع 50 ملليلتر من 1X PBS وتدور الخلايا مرة أخرى في 600 مرات ز لمدة 10 دقيقة. استخدام ماصة لإعادة تعليق بيليه في 100 ملليلتر من درجة حرارة الغرفة العازلة الجزال. ضع الكأس على مُحرك مغناطيسي، وأضيف ببطء 0.5 حمض الخليك المولي إلى الأسي فير النهائي من 4.5 إلى 4.7.
اسمحوا هذا الخليط احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين. بعد هذا ببطء إضافة قطرات من هيدروكسيد البوتاسيوم العادي لاستعادة السيد الهز إلى 7.0، ونقل الخلايا إلى أنابيب 50 ملليلتر، والطرد المركزي لهم في 600 مرة ز لمدة 10 دقائق، لإزالة أي flagella منفصلة. تجاهل المابير وتخزين بيليه على الجليد حتى جاهزة للاغتسال.
عندما تكون جاهزة، وغسل بيليه مرتين باستخدام 50 ملليلتر من 1X PBS في أربع درجات مئوية لكل غسل. تدور بيليه غسلها في 600 مرات ز وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. Resuspend بيليه في 30 ملليلتر من 1X PBS.
ثم, ببطء تحميل التعليق على وسادة 20 ملليلتر من 25٪ السكروز, دون خلط. تدور في 600 مرة ز وأربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة لإزالة أي flagella المتبقية ونشر الخلايا في السكروز. باستخدام الطامح، وpirpirate بعناية عظمى حفظ فقط أسفل معظم 20 ملليلتر.
غسل السكروز المتبقية بإضافة 20 ملليلتر من برنامج تلفزيوني 1x الباردة. أجهزة الطرد المركزي في 600 مرة ز و 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. إعادة تعليق بيليه في 10 ملليلتر من 1x PBS في أربع درجات مئوية، والتأكد من أنه لا توجد كتل في الحل.
نقل بيليه resuspended إلى زجاجة جديدة 250 ملليلتر، إضافة العازلة تحلل، تستكمل مع 5، 000 وحدة من DNase، إلى زجاجة تحتوي على الخلايا. احتضان في أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة، في حين خلط كل 15 دقيقة عن طريق قلب بعناية الزجاجة. نقل الخلايا الميسوسة إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر وطاردة مركزية في 600 مرة ز وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
باستخدام ماصة، وجمع نابيربيرت وتحميله في أنبوب 30 ملليلتر جولة القاع على الجليد تحتوي على اثنين من ملليلتر من 60٪ وسادة السكروز. الطرد المركزي هذا في 10،000 مرة ز لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية. بعد هذا، الطامح فوق مليلتر واحد فوق وسادة السكروز.
لاحظ الواجهة الصفراء بين ملليلتر واحد من عظمى المتبقية، ومليلتر اثنين من وسادة السكروز. باستخدام قطع P1000 تلميح، بلطف خلط عظمى المتبقية مع السكروز. تجمع كل من وسائد السكروز وتخزينها على الجليد.
المقبل, إعداد 40٪ إلى 70٪ sucrose التدرج في رقيقة الجدران 38.5 ملليلتر أنابيب البولي بروبلين كما هو مبين في بروتوكول النص. قم بتحميل الواجهات المجمّعة ببطء في التدرج. موازنة الأنابيب مع 10 ميليمولار K-PIPES العازلة، والطرد المركزي في 68، 320 مرات ز وأربع درجات مئوية لمدة 75 دقيقة.
بعد ذلك، استخدم إبرة 0.8 ملليمتر لجعل ثقب في الجزء السفلي من الأنبوب، والتأكد من عدم إزعاج طبقات السكروز المختلفة. استخدام هذه الحفرة لجمع 12 500 كسور ميكرولتر في أربع درجات مئوية. باستخدام قطع P200 تلميح، وإعداد إضافية 10 ميكرولتر aliquot من كل كسر لاستخدامها أثناء immunofluorescence.
ثم، المفاجئة تجميد الكسور في النيتروجين السائل. للبدء، ضع غطاء 12 ملليمتر معقمة على الطرف السفلي المُعطل من المُركز، مع التأكد من إبقاء الجانب المغلف بـ PDL أسفلًا. وضع محول مباشرة على القمة، لسقف الغطاء.
ثم، عكس أنبوب مستدير القاع ووضعها على المكثف، coverslip، والمحول. باستخدام ملاقط، ودفع بلطف الفرقة حتى تصل إلى الجزء السفلي من الأنبوب، ومن ثم عكس الأنبوب. أضف 10 ملليمولار من المخزن المؤقت K-PIPES حتى يصل إلى أعلى المكثف.
تأكد من عدم وجود فقاعات في الاسطوانة المركزية للمكثف. إضافة بلطف 100 ميكرولترات من 10 ميليمولار K-PIPES العازلة إلى واحدة من aliquots من جزء هليولار المخصب ومزيج شامل باستخدام ماصة P200. بعد ذلك، قم بإزالة 100 ميكرولترات من المخزن المؤقت K-PIPES من مركز المُركز المجوف، وإضافة 100 ميكرولترات من خليط الكسر العازل، مع التأكد من أن المحتويات تبقى في مركز المُركز المجوف.
تدور عند 10,000 مرة ز لمدة 10 دقائق في جهاز طرد مركزي يتم تبريده مسبقاً إلى أربع درجات مئوية. بعد ذلك، استخدم ملاقط لإزالة المكثف. أدخل جهازًا يدويًا في الثقب الموجود في الحافة المشقوقة للمحول ورفعه بلطف لاستعادة الغطاء.
بمجرد أن تصل إلى أعلى الأنبوب ، استخدم إصبعًا قفازًا لمحاصرة حافة المحول واستخدام ملاقط لإزالة الغطاء ، مع الأخذ في الاعتبار أي جانب من الأغطية يحتوي على قنطار. ثم, أداء التثبيت وصبغ المناعة من تمركز. للبدء، احتضان الأغطية مع المستويات المركزية في مربع مختبر انتقال البوليسترين الكريستال المعدة مليئة 100٪ الميثانول في ناقص 20 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
باستخدام ملاقط، نقل الأغطية إلى مربع مختبر شفاف مملوءة 50 ملليلتر من 1X PBS. دع الشرائح تغسل في برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم، ماصة 60 ميكرولترات من مزيج الأجسام المضادة الأولية على قطعة من التفاف ختم المختبر في غرفة مرطبة.
ضع بعناية في الأغطية على رأس مزيج الأجسام المضادة مع الأساليب المركزية التي تواجه الانخفاض مباشرة. دع الغطاءات تحتضن لمدة 45 دقيقة. بعد ذلك، قم بإزالة الأغطية واغسلها في صندوق يحتوي على PBS لمدة خمس دقائق.
احتضان الأغطية المغسولة لمدة 45 دقيقة ، مع أجسام مضادة ثانوية في PBS 1 ٪ BSA و 0.05 ٪ Tween -20. إزالة الأغطية وغسلها لمدة خمس دقائق في مربع يحتوي على برنامج تلفزيوني. باستخدام العادي المضادة للتلاشي تصاعد المتوسطة، تحميل الغطاء على شريحة.
ثم، صورة هئية معزولة على مجهر confocal في هدف النفط 63X مع N.A.of 1.4، في حين تطبيق deconvolution. قم بإعداد الموضع العلوي والسفلي للرصة Z فوق إشارة القيادة المركزية وأسفلها، على التوالي، والحصول على مجموعة كبيرة من الصور التي تتألف من إجمالي إشارة المركزية. قم بـ Project المكدس و تنفيذ متوسط جسيمات مفردة كما هو موضح في بروتوكول النص.
ويكشف الفلور المناعية التمثيلية أن ستة كسور يتم إثراؤها من أجل الكسور المركزية المعزولة، مع ذروة للكسر رقم ثلاثة، في حين أن الكسرين الأخيرين لا يتم ذلك، مما يشير إلى أن التنقية ناجحة. فقط حوالي 30 وينظر إلى 30 centrioles لكل مجال من وجهات النظر دون المكثف، في حين ينظر 183 مع المكثف. وهذا يدل على أن خطوة المكثف ناجحة، ويسمح بإثراء ستة أضعاف من القطاعات المركزية في منطقة محددة، مما يجعل من الأسهل للكشف عنها وصورتها.
ثم يتم استخدام المجهر فائقة الدقة لتصوير سينيريوليس ملطخة لـ monoglutamylated tubulin ، ويتم استخدام البرامج لتوليد متوسط شبه مثالي لكل توجه مختار. بعد خمسة تكرارات، تم إنشاء فئتين من المتوسطات من الأساليب المركزية أحادية الولاتمة: عرض علوي من 63 كائنًا وعرض جانبي من 98 جسيمًا. طول متوسط فئة الرؤية الجانبية هو 260 نانومتر مع قطر 250 نانومتر، مقارنة بإشارة توبولين مونجلوتال التي يتم قياسها التي ينظر إليها لتوطين داخل قلب centriole.
أثناء تنفيذ هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحفاظ على العزلة المركزية على الجليد وتجميدها بعد العزل. بعد هذا الإجراء، يمكن إجراء طريقة أخرى، مثل المجهر الإلكترونات التبريد وقياس الطيف الشامل من أجل الإجابة على سؤال إضافي، مثل الهندسة المعمارية الأصلية لل centriole أو تكوين البروتين المركزية.
