وGTPase Rho الصغيرة هو بروتين من عظمى مع وظيفة الخلوية المتنوعة. على سبيل المثال، تشارك هذه البروتينات في تنظيم مصير الخلية، والاستجابة الخلوية للإجهاد، والحركة الخلوية، ودورة الخلية. يتم تنظيم نشاط بروتين Rho GTPase صغير من خلال تعديل ما بعد الترجمة.
وهذه التعديلات تدخل في تنظيم صارم لنشاطها. على سبيل المثال، يعد الارتجاج البروتيني ورابطة GTP أهم تعديل بعد الترجمة لهذه البروتينات. مختبري قد عدلت مؤخرا وتطوير طريقة بسيطة للتحقيق في التعديل بعد الترجمة من هذه البروتينات فائقة الوالدين.
لهذا الغرض، استخدمنا 251 خط خلايا الورم الأرومي الدبقي، واستهدافها مع simvastatin، وقياس التعديل بعد الترجمة لهذه البروتينات. الطريقة ينطوي على تجزئة دون الخلوية وGP البروتين ملزمة لهذا البروتين superfamily. لهذا الغرض، استخدمنا توطين RhoA، وGGP ملزمة إلى RhoA لقياس التعديل بعد الترجمة لهذا البروتين.
إزالة الخلايا من الحاضنة 37 درجة. انظر إلى الخلايا تحت المجهر لتأكيد الالتقاء. يجب أن تكون الخلايا في 70 إلى 80 في المئة التقاء.
غسل الخلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني الباردة. إضافة خمسة ملليلتر من EDTA، ووضع الخلايا مرة أخرى في الحاضنة 37 درجة لمدة خمس دقائق. بعد خمس دقائق من الحضانة، وجمع EDTA مع الخلايا في أنبوب 15 مل.
ضع الأنبوب في صندوق ثلج، ثم انتقل إلى جهاز الطرد المركزي. إعداد جهاز الطرد المركزي إلى 1500g في أربع درجات، وتدور الخلايا لمدة خمس دقائق. بعد الدوران، وإزالة عظمى، وإضافة ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني الباردة.
اِثُل الخلايا جيداً. نقل خليط الخلية إلى أنبوب جديد يسمى 1.5 ملليلتر. وبعد النقل، انتقل إلى جهاز الطرد المركزي.
تعيين الطرد المركزي إلى 1500g في أربع درجات، وتدور الخلايا لمدة خمس دقائق. تحقق من حجم بيليه. ضع العينات على الجليد.
تجاهل supernate تماما ، دون إزعاج بيليه. إضافة المخزن المؤقت واحد. مزيج جيد عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا.
انتقل إلى سونيكيشن. تعيين sonicator لمدة خمس دورات، خمس ثوان لكل منهما، وكرر ثلاث مرات. سونيكيشن يجب أن تمضي قدما على الجليد، ولكن لا يظهر في الفيديو، لأغراض توضيحية.
انتقل إلى الريف فائقة التركيز. استخدام كسور فائقة التركيز لفصل تجانس الخلية إلى كسور السيتوبلازم والغشاء. تعيين جهاز الطرد المركزي إلى 100، 000g لمدة 35 دقيقة، في أربع درجات.
تحقق من حجم بيليه. فصل السوبر. جمع supernate تماما، مع الحرص على عدم إزعاج بيليه.
الكسر الخارق هو الكسر السيتوسوليك. وضع السوبر في أنبوب المسمى حديثا. إضافة العازلة الثانية إلى بيليه.
هذا هو كسر الغشاء. مزيج جيد عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. المضي قدما في تحديد البروتين وإعداد عينة لطخة الغربية.
قم بتحميل العينات على صفحة SDS باستخدام هلام 15٪. تأكيد نقل البروتين عن طريق تصور علامة الوزن الجزيئية، أو باستخدام وصمة بونساو. إضافة الأجسام المضادة الأولية لتحليل المناعة.
نستخدم Rac1/2/3، CDC42، وRhoA. جلب لوحات الثقافة من الحاضنة. انظر إلى الخلايا تحت المجهر لتأكيد الالتقاء.
يجب أن تكون الخلايا 70 إلى 80٪ التقاء. ضع لوحة الثقافة على الجليد. التعرق وسائل الإعلام وغسل الخلايا مع الجليد البارد PBS pH'd إلى 7.2.
الطامح برنامج تلفزيوني. إمالة لوحات على الجليد لمدة دقيقة إضافية لإزالة جميع بقايا برنامج تلفزيوني. برنامج تلفزيوني المتبقية يؤثر سلبا على هذا الفحص.
Lyse الخلايا في حجم مناسب من الجليد الباردة العازلة التي تحتوي على مثبطات البروتياز والفوسفاتاز. حصاد الخلية lysate مع مكشطة الخلية. المنحدر لوحة الثقافة لهذه التقنية.
نقل lysate في أنبوب التبريد المسمى، والجليد الباردة، والحفاظ على الجليد. اخلطي جيدا باستخدام دوامة. الحفاظ على 10 ميكرولترات من lysate لمقايسة البروتين.
المفاجئة تجميد الخلية المتبقية في النيتروجين السائل. نقل الأنابيب المبردة المجمدة المفاجئة إلى ثلاجة ناقص 80. قم بتخزين هذه العينات.
ملاحظة، يجب أن لا يتم تخزين العينات أكثر من 14 يوما. إعداد الخلايا من لوحات الثقافة الأخرى بتكرار الخطوات من واحد إلى ثمانية، واحداً تلو الآخر. العمل بسرعة، وأبدا ترك العينات على الجليد لأكثر من 10 دقائق.
لا تتعامل مع جميع لوحات الثقافة في وقت واحد. قياس تركيز البروتين. حساب حجم عازلة تحلل لتطبيع تركيز البروتين بين العينات.
ملاحظة: واحد مليغرام لكل ملليلتر هو عادة أفضل، ومع ذلك، 0.3 إلى اثنين ملليغرام لكل ملليلتر يمكن الكشف عنها. إعداد عنصر تحكم فارغ عن طريق إضافة 60 ميكرولترات من العازلة تحلل، و 60 ميكرولترات من العازلة ملزمة إلى microtube. إعداد سيطرة إيجابية عن طريق إضافة 12 ميكرولترات من البروتين Rho التحكم، 48 ميكرولترات من العازلة تحلل، و 60 ميكرولترات من العازلة ملزمة.
خذ لوحة تقارب رو من حقيبتها ومكانها على الجليد. قم بذوبان المسحوق في الآبار مع 100 ميكرولترات من الماء المقطر البارد المثلج. أبقِ الصحن على الجليد
ذوبان الخلية المجمدة المفاجئة في حمام مائي تعيين إلى 25 درجة مئوية. إضافة حجم محسوبة من الجليد الباردة تحلل العازلة إلى كل عينة لتطبيع تركيز البروتين. نقل 60 ميكرولترات من عينات الجليد الباردة تطبيع إلى الأنابيب الدقيقة، وإضافة 60 ميكرولترات من العازلة ملزمة.
اخلطي جيدا، و ابقيا على الثلج. إزالة المياه تماما من microplate عن طريق النقر قوية، تليها خمسة إلى سبعة الصنابير الصلبة على حصيرة مختبر. إضافة 50 ميكرولترات من العينات تطبيع، وتحكم فارغة، والسيطرة الإيجابية على الآبار في مكررة.
ضع اللوحة على شاكر مداري لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية. ملاحظة: يجب تعيين سرعة شاكر إلى 300 دورة في الدقيقة. مسح العينات من لوحة عن طريق الخفقان، وغسل مرتين مع 200 ميكرولترات من غرفة عازلة غسل درجة حرارة الغرفة.
قم بإزالة المخزن المؤقت للغسيل بقوة من الآبار بعد كل غسل عن طريق النقر ، يليه النقر ، والحفاظ على اللوحة على مقاعد البدلاء في درجة حرارة الغرفة. إضافة 200 ميكرولترات من درجة حرارة الغرفة مستضد تقديم العازلة في كل بئر، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين. نفض الغبار من الحل من الآبار، وغسل ثلاث مرات مع 200 ميكرولترات من غرفة عازلة غسل درجة حرارة الغرفة.
إضافة 50 ميكرولترات من واحد حديثا أعد إلى 250 المضادة المضادة للRhoA الأولية إلى كل بئر. ضع اللوحة على شاكر مداري لمدة 45 دقيقة عند 300 دورة في الدقيقة ، من المقرر أن تكون 25 درجة مئوية. نفض الغبار من الحل من الآبار، وغسل ثلاث مرات مع 200 ميكرولترات من العازلة الغسيل في درجة حرارة الغرفة.
إضافة 50 ميكرولترات من أعدت حديثا واحد إلى 250 المضادة المضادة للRhoA الثانوية لكل بئر. ضع اللوحة على قمة شاكر مداري لمدة 45 دقيقة، عند 300 دورة في الدقيقة، من المقرر أن تكون 25 درجة مئوية. إعداد كاشف الكشف HRP عن طريق خلط وحدات التخزين متساوية من الكاشف A والكاشف B.Flick خارج الحل من كل بئر، وغسل ثلاث مرات مع 200 ميكرولترات من غرفة تخزين الغسيل.
إضافة 50 ميكرولترات من كاشف الكشف HRP أعدت حديثا إلى كل بئر. اقرأ إشارة الإنارة في غضون ثلاث إلى خمس دقائق للحصول على إشارة قصوى. تحليل النتائج باستخدام حزمة برامج مناسبة.
تظهر نتائجنا أن سيمفاستاتين انخفض توطين RhoA في الغشاء الكسر. ما زاد هو تراكم في كسر السيتوسوليك. ومن المثير للاهتمام، زاد سيمفاستاتين GTP ملزمة إلى RhoA.Why؟
نتوقع سيمفاستاتين انخفاض هذا النشاط. من المهم جدا أنها تقيس كل من التعريب الخلوية الفرعية لهذا البروتين، وقياس GTP ملزمة لهذا البروتين أن يكون التقييم النهائي لنشاط GTPases Rho الصغيرة.
