ونشكر برنامج الدكتوراه في العلوم البيولوجية الجزيئية (موبي) وقسم الأحياء في جامعة الدولة تينيسي الأوسط (متسو) لتوفير التمويل اللازم لهذه الدراسة. كان أيضا تمويل المشروع جزئيا بمنحه "مشاريع خاصة" تمنحها "مؤسسة متسو" إلى D.E.N..

ملاحظة: المرسلة جيم- ممرض 2 مستوى السلامة الأحيائية (BSL-2) والباحثون العاملون معها يجب اتخاذ الاحتياطات المناسبة. إجراءات مفصلة على كيف أن بأمان العمل مع الكائنات الممرضة BSL-2 يمكن الاطلاع على المركز مكافحة الأمراض (CDC) موقع على شبكة الإنترنت، لكن من المهم أن نلاحظ أن جميع الأشخاص ملامسة المرسلة جيم- ينبغي تدريب بشكل صحيح في التعامل مع العوامل المسببة للأمراض، وينبغي دائماً ارتداء المناسب معدات الوقاية الشخصية (معدات الوقاية الشخصية)، مطاط عموما أو قفازات النتريل. علاوة على ذلك، ينبغي أن مختومة الدوارات في أجهزة الطرد المركزي لمنع هباء العينات وأي انسكابات تنظيف فورا باستخدام حل التبييض 10%28.
1-كبسولة التعريفي
ملاحظة: ينبغي إجراء جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة إلا إذا ذكر خلاف ذلك.
<ol><li>الثقافة المرسلة جيم في الخميرة ببتون سكر العنب (YPD) مرق (درجة الحموضة 6.5 +/--0.2) واحتضان في 37 درجة مئوية مع الهز حتى وهم في مرحلة تسجيل (حوالي 18-36 ح).</li>
	<li>خلايا أجهزة الطرد المركزي في 870 x ز لمدة 5 دقائق في 21 درجة مئوية ويغسل ثلاث مرات مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).</li>
	<li>استخدام هيموسيتوميتير (أو عداد الآلي خلية) لحساب عدد الخلايا وريسوسبيند في 2 × 105 خلايا/2 مل في وسائل الإعلام الأساسية الحد الأدنى في دولبيكو (دميم).</li>
	<li>للحث على الكبسولة، احتضان في 37 درجة مئوية و 5% CO2 لح 18. ملاحظة: المزيج من غياب العناصر المغذية في وسائل الإعلام، ووجود CO2 يحفز نمو كبسولة المرسلة جيم .</li>
	<li>بعد انتهاء الحضانة، حصاد الخلايا عن طريق سينتريفوجينج (كما هو مذكور أعلاه) وإزالة جميع ولكن 5-10 ميليلتر طافية. في الوقت نفسه، حصاد عينة خلايا المستحثة الأمم المتحدة مقابلة لكل سلالة يمكن قياسها. استخدام هذه كعناصر سلبية. ملاحظة: الكريات الخلية سوف تكون صغيرة جداً وقد يكون من الصعب أن نرى. كن حذراً عند يسفط المادة طافية.</li>
	<li>وصمة عار مع الهند الحبر (قسم 2.1) أو الأصباغ الفلورية (القسم 2-2).</li>
</ol>2-تلوين
<ol><li>
التلوين باستخدام الحبر الهند فقط
	<ol>
<li>لوصمة عار الخميرة بالحبر الهند، ريسوسبيند بيليه في المادة طافية المتبقية وإضافة 4μL (حوالي النصف) من تعليق خلية و 4μL من الحبر الهند على شريحة الميكروسكوب زجاجية. بلطف المزيج وتجنب الإرغاء.</li>
		<li>تطبيق ساترة زجاج 13 مم (سمك #1.5) وختم الحواف مع غير سامة لتسرب (طلاء الأظافر واضحة) لمنع جفاف العينة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
التلوين بالأصباغ الفلورية فقط
	<ol>
<li>لوصمة عار الخميرة مع صبغة فلورسنت، ريسوسبيند بيليه الخلية في برنامج تلفزيوني ميليلتر 50 مع ألبومين المصل البقري 1% (BSA).</li>
		<li>احتضان الثقافة مع حجم متساوية من كالكوفلور الأبيض (CFW) (1 ميكروغرام/مل) و (انظر الجدول للمواد) مترافق ماب كبسولة 18B7 إلى AlexaFluor488 (AF488) (10 ميكروغرام/مل) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.</li>
		<li>الطرد المركزي خلايا في 870 x ز لمدة 5 دقائق في الحضانة بعد 21 درجة مئوية ونضح المادة طافية.</li>
		<li>ريسوسبيند بيليه الخلية في برنامج تلفزيوني ميليلتر 10 مع ألبومين المصل البقري 1% (BSA).</li>
		<li>"الماصة؛" ميليلتر 8 من تعليق خلية إلى شريحة الميكروسكوب زجاجية.</li>
		<li>تطبيق ساترة زجاج 13 مم (سمك #1.5) وختم الحواف مع غير سامة لتسرب (طلاء الأظافر واضحة) لمنع جفاف العينة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
تلطيخ مع الهند الحبر والأصباغ الفلورية
	<ol>
<li>لمقارنة فعالية الحبر الهند تلطيخ بالأصباغ الفلورية أكثر مباشرة، شارك وصمة عار السكان الخلية نفسها مع كلا النوعين من وصمة عار. للقيام بذلك، أولاً احتضان الخلايا مع كبسولة الفلورسنت ووصمة عار جدار الخلية، وفقا للخطوات 2.2.1-2.2.3 على السواء.</li>
		<li>وبعد ذلك، "الماصة؛" كميات متساوية (4 ميليلتر) تعليق خلية فلوريسسينتلي الملون والحبر الهند على شريحة زجاجية. المزيج بلطف.</li>
		<li>تنطبق ساترة زجاج 13 مم (سمك #1.5) وختم الحواف مع غير سامة لتسرب (طلاء الأظافر واضحة) لمنع جفاف العينة.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3-صورة اقتناء/الفحص المجهري
<ol><li>
تصوير الخلايا ملطخة بالحبر الهند.
	<ol>
<li>الحصول على الصور باستخدام مجهر خفيفة قياسية (100 X التكبير).</li>
		<li>صورة الحد ني خلايا 50 في كل حالة. ملاحظة: سوف تختلف عدد الخلايا في كل حقل، وهذا أمر مقبول. ومن المهم، مع ذلك، أن تداخل الخلايا يوضع كحد أدنى، أن هذه صعوبة قياس (سواء يدوياً أو مع البرامج الآلية). لهذه التجارب، الصور تم الحصول عليها على عمق 16 بت مع أوقات التعرض الأمثل لزيادة تباين الصورة مع تقليل التمويه الناجم عن الحركات الصغيرة من الخلايا.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
تصوير الخلايا ملطخة بالأصباغ الفلورية
	<ol>
<li>صورة الخلايا بالميكروسكوب الأسفار، فتح المجهر برامج التصوير وحدد أطوال موجية الإثارة والانبعاثات المناسبة ل fluorophores المستخدمة (CFW و AF488 هي متحمس باستخدام 405nm و 488 نانومتر الأضواء، على التوالي). الحصول على الصور باستخدام مجهر الأسفار.</li>
		<li>صورة الحد ني خلايا 50 في كل حالة. ملاحظة: سوف تختلف عدد الخلايا في كل حقل، وهذا أمر مقبول. ومن المهم، مع ذلك، أن تداخل الخلايا أن تبقى على الأقل هذه هي صعوبة قياس (سواء يدوياً أو مع البرامج الآلية).</li>
		<li>الحصول على سلسلة صورة z-كومة من الخلايا لضمان الحصول على أقصى قطر كبسولة لكل خلية داخل حقل معين.<ol>
<li>في مجهر البرمجيات التحكم، وانقر فوق على شريط "z-مكدس" لفتح لوحة تحكم "z-المكدس"، ثم حدد الخيار "الأولى/الأخيرة" في الزاوية اليسرى العليا للوحة.</li>
			<li>استخدام عنصر تحكم التركيز غرامة على المجهر إلى التركيز على مستوى أقل من نقطة أوسع من خلية واحدة من خميرة وكبسولات للجميع داخل مجال الرؤية الحالية، وانقر فوق "تعيين أول".</li>
			<li>استخدام عنصر تحكم التركيز الجميلة بتركيز أعلى من النقطة أوسع من الجسم الخلية للخلية نفسها والكبسولة لكافة الخلايا الموجودة داخل مجال الرؤية الحالية، ثم انقر فوق "تعيين آخر".</li>
			<li>ثم انقر فوق "بدء التجربة" في علامة التبويب "حيازة" اكتساب z-المكدس للموضع الحالي. كرر العملية في مواقف متعددة حتى تم الحصول عليها من صور z-كومة من الخلايا 50 كحد أدنى. ملاحظة: لهذه التجارب، والثقب [كنفوكل] تم تعيين إلى 1.0 تم الحصول عليها الاتحاد الأفريقي وسلسلة z متداخلة من شرائح 10-20 تغطي كل 0.7 ميكرومتر في مواقع مختارة. الاتحاد الأفريقي = وحدة متجددة الهواء.</li>
		</ol>
</li>
		<li>بعد ذلك، تحويل كل سلسلة z-المكدس في أقصى شدتها الإسقاطات (MIP) استخدام برنامج تحليل الصور المناسبة. ملاحظة: المشروع MIPs كثافة أكبر في كل طائرة من صورة مكدسة29. إنشاء MIPs يسمح أحد لإنتاج تمثيل ثنائي الأبعاد للصور التي تتوافق مع الخلية كحد أقصى وقطرها كبسولة داخل المكدس ثلاثي الأبعاد الملتقطة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
تصوير الخلايا ملطخة بالحبر الهند والأصباغ الفلورية
	<ol>
<li>الحصول على الصور باستخدام ويديفيلد (40 X التكبير) أو مجهر [كنفوكل] (63 X أو التكبير X 100). للخلايا ملطخة بالحبر الهند والأصباغ الفلورية، التقاط الصور باستخدام مجهر ويديفيلد مجهزة بالمرحلة التي تسيطر عليها الكمبيوتر والنفط الغمر الهدف. ملاحظة: يجب أن تسيطر المجهر في الاستخدام باستخدام برامج تصوير CFW. ينبغي أن يتم الكشف عن الأسفار التي هو متحمس من خلال عامل تصفية إثارة 340-380 نانومتر، وينبعث الضوء من خلال مرشح حاجز شمال البحر الأبيض المتوسط 435-485 تنعكس من مرآة مزدوج اللون 400 نانومتر. يمكن متحمس AF488 الأسفار من خلال عامل تصفية إثارة 465-495 نيوتن متر، ويمكن الكشف عن الضوء المنبعثة من خلال مرشح حاجز شمال البحر الأبيض المتوسط 515-555 تنعكس من مرآة مزدوج اللون 505-شمال البحر الأبيض المتوسط.</li>
		<li>صورة الحد ني خلايا 50 كل شرط لكل أسلوب المصبوغة.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4-دليل قياس كبسولة
<ol><li>للخلايا ملطخة بالحبر الهند أو البقع الفلورسنت، استخدام برمجيات خلية قياس إلى يدوياً قياس القطر الكبسولة والخلية (انظر الجدول للمواد). للقيام بهذا، انتقل إلى "ملف" > "فتح الصورة" > "التدبير" واستخدام المؤشر لرسم خط مستقيم من خلال أوسع نقطة خلية كاملة (مجموع القطر).</li>
	<li>بعد ذلك، انقر فوق "إجراء" مرة أخرى، ورسم خط مستقيم من خلال خلايا الجسم (قطر جسم الخلية). ملاحظة: القياسات يتم حفظها تلقائياً على الخلايا.</li>
	<li>كرر هذه العملية لكافة الخلايا (الحد أدنى مجموعة/50).</li>
	<li>لحفظ الصور بمجرد أنها تقاس، انقر فوق "ملف" > "حفظ باسم" واسم الصور مناسب.</li>
	<li>حدد الملفات حديثا المقاسة وتصدير البيانات إلى برنامج جدول بيانات.</li>
	<li>حساب متوسط القطر كبسولة باستخدام المعادلة: ([مجموع القطر]-[قطر جسم الخلية]).</li>
</ol>5-الآلي قياس كبسولة
ملاحظة: لقياس النجاح الآلي، استخدام الصور 16-بت مع درجة عالية من التباين والتي تتركز بشكل صحيح جنبا إلى جنب مع برنامج تحليل صورة مناسبة (انظر الجدول للمواد). عند التصوير جيم-المرسلة لقياس كبسولة، من المهم التركيز على الحلبة مظلمة في الحدود بين جدار الخلية بالكبسولة. يسمح هذا البرنامج بشكل صحيح تحديد الخلية والكبسولة.
<ol><li>عكس وإنشاء نسخة من كل الهند الحبر الملون صور الخلية باستخدام برامج تحرير الصور مناسبة (انظر الجدول للمواد). للقيام بذلك، انقر فوق "ملف" > "فتح" لفتح الهند الحبر الملون الصور وثم "التحكم" + "الأول" لعكس الصورة. انقر فوق "ملف" > "حفظ باسم" لحفظ الصورة مقلوبة.</li>
	<li>لاستيراد الأصلي ومقلوب الصور إلى البرنامج انقر فوق "ملف" > "استيراد تسلسل" > "تحميل الصورة" > "تعريف تسلسل (يدوياً)" > "أبعاد (قناة)" > "استيراد" > "تطبيق". ملاحظة: الخلية المرسلة جيم- الهيئات وكبسولات يمكن تحديدها وملثمين باستخدام خوارزميات محددة-يشار إلى 'وصفات'-المدرجة في البرنامج.</li>
	<li>استخدام وصفه '"محلل مستعمرة"(الأسفار)' على الصورة المعكوسة لاكتشاف وقناع الجسم الخلية، ثم انقر فوق "تطبيق". في صورة مقلوبة، الحلبة مظلمة تعريف حد الخلية المرسلة جيم- يصبح أكثر إشراقا من الكبسولة المحيطة بها.</li>
	<li>استخدم الوصفة '"محلل مستعمرة"(الأسفار)' على الصورة المعكوسة للجزء الهيئات الخلية المرسلة جيم من كبسولات بها، ثم انقر فوق "تطبيق". وهذا يخلق قناع عد. إعادة تسمية هذا القناع العد "خلية الجسم" بزر الماوس الأيمن فوق علامة التبويب المسمى "قناع حساب". ملاحظة: الوصفة تتكون من خطوات معالجة صورة متعددة: الخلفية، إزالة، والكشف عن الكائن، فصل الكائن، وتصفية مجموعة فرعية.</li>
	<li>بعد ذلك، استخدم وصفه '"انتشار الخلايا"' على الصورة الأصلية لكشف وقناع الكبسولة، وانقر فوق "تطبيق". وهذا يخلق قناع عد. إعادة تسمية هذا القناع العد "كبسولة" بزر الماوس الأيمن فوق علامة التبويب المسمى "قناع حساب".</li>
	<li>استخدام الوصفة، '"كبسولة القسم"'، إنشاء قناع جديد على الصورة الأصلية لتقسيم كبسولات متجاورة من بعضها البعض. للقيام بذلك، انقر فوق "القسم كبسولة" من القائمة المنسدلة الوصفة. في "مربع التقسيم كبسولة"، اختر القناع العد أعيدت تسميته الآن "كبسولة" (5.5) "المنطقة كبسولة". اختر القناع العد أعيدت تسميته الآن "خلية الجسم" "تشفير خلايا" (5.4). اختر "الأصلي" لقناة الإدخال، و "إنشاء قناع لكبسولة المقسمة. انقر فوق "تطبيق ملاحظة: الوصفة يولد الخلية وقطرها كبسولة، يعرف بأنه متوسط المحاور الأطول والأقصر عبور مركز الخلية والكبسولة، وقياسات المجال من الكشف عن الأقنعة. العثور على الإخراج الموجود تحت علامة التبويب جدول بيانات في هذا البرنامج. كرر هذه العملية لجميع الصور (على الأقل 50/المجموعة خلايا). معلمات الوصفة يمكن ضبطها لتحسين الكشف عن الصور الفردية أو الأمثل للكشف عن مجموعة من صور متعددة. ويمكن حساب قياسات إضافية بوصفه لتوصيف شامل للخلية والمورفولوجيا في كبسولة.</li>
	<li>تصدير البيانات إلى برنامج جدول بيانات الاختيار لمزيد من التحليل.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Park, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+the+current+global+burden+of+cryptococcal+meningitis+among+persons+living+with+HIV/AIDS.">Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS.</a> AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).</li><li>Coelho, C., Bocca, A. L., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intracellular+life+of+Cryptococcus+neoformans.">The intracellular life of Cryptococcus neoformans.</a> Annu Rev Pathol. 9, 219-238 (2014).</li><li>Rajasingham, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+burden+of+disease+of+HIV-associated+cryptococcal+meningitis:+an+updated+analysis.">Global burden of disease of HIV-associated cryptococcal meningitis: an updated analysis.</a> Lancet Infect Dis. 17 (8), 873-881 (2017).</li><li>Limper, A. H., Adenis, A., Le, T., Harrison, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+infections+in+HIV/AIDS.">Fungal infections in HIV/AIDS.</a> Lancet Infect Dis. 17 (11), e334-e343 (2017).</li><li>Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crisis+in+Infectious+Diseases:+2+Decades+Later.">Crisis in Infectious Diseases: 2 Decades Later.</a> Clin Infect Dis. 64 (7), 823-828 (2017).</li><li>McClelland, E. E. C., Eisenmann, A., H, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch+6.">Ch 6.</a> New Insights in Medical Mycology. , 131-157 (2007).</li><li>Leopold Wager, C. M., Wormley, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+versus+alternative+macrophage+activation:+the+Ying+and+the+Yang+in+host+defense+against+pulmonary+fungal+infections.">Classical versus alternative macrophage activation: the Ying and the Yang in host defense against pulmonary fungal infections.</a> Mucosal Immunol. 7 (5), 1023-1035 (2014).</li><li>Kwon-Chung, K. J., Rhodes, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+and+melanin+formation+as+indicators+of+virulence+in+Cryptococcus+neoformans.">Encapsulation and melanin formation as indicators of virulence in Cryptococcus neoformans.</a> Infect Immun. 51 (1), 218-223 (1986).</li><li>Vecchiarelli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+the+immunological+function+of+the+Cryptococcus+neoformans+capsule.">Elucidating the immunological function of the Cryptococcus neoformans capsule.</a> Future Microbiol. 8 (9), 1107-1116 (2013).</li><li>Murphy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+cryptococcal+antigens+on+cell-mediated+immunity.">Influence of cryptococcal antigens on cell-mediated immunity.</a> Rev Infect Dis. 10 Suppl 2, S432-S435 (1988).</li><li>Cherniak, R., Morris, L. C., Belay, T., Spitzer, E. D., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+the+structure+of+glucuronoxylomannan+in+isolates+from+patients+with+recurrent+cryptococcal+meningitis.">Variation in the structure of glucuronoxylomannan in isolates from patients with recurrent cryptococcal meningitis.</a> Infect Immun. 63 (5), 1899-1905 (1995).</li><li>Collins, H. L., Bancroft, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+Cryptococcus+neoformans+impairs+antigen-specific+T-cell+responses.">Encapsulation of Cryptococcus neoformans impairs antigen-specific T-cell responses.</a> Infect Immun. 59 (11), 3883-3888 (1991).</li><li>Yasuoka, A., Kohno, S., Yamada, H., Kaku, M., Koga, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+molecular+sizes+of+Cryptococcus+neoformans+capsular+polysaccharide+on+phagocytosis.">Influence of molecular sizes of Cryptococcus neoformans capsular polysaccharide on phagocytosis.</a> Microbiol Immunol. 38 (11), 851-856 (1994).</li><li>Robertson, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+ex+vivo+capsule+size+is+associated+with+intracranial+pressure+and+host+immune+response+in+HIV-associated+cryptococcal+meningitis.">Cryptococcus neoformans ex vivo capsule size is associated with intracranial pressure and host immune response in HIV-associated cryptococcal meningitis.</a> J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).</li><li>Cordero, R. J., Bergman, A., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+behavior+of+capsule+enlargement+by+Cryptococcus+neoformans.">Temporal behavior of capsule enlargement by Cryptococcus neoformans.</a> Eukaryot Cell. 12 (10), 1383-1388 (2013).</li><li>O'Meara, T. R., Alspaugh, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cryptococcus+neoformans+capsule:+a+sword+and+a+shield.">The Cryptococcus neoformans capsule: a sword and a shield.</a> Clin Microbiol Rev. 25 (3), 387-408 (2012).</li><li>McClelland, E. E., Smith, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gender+specific+differences+in+the+immune+response+to+infection.">Gender specific differences in the immune response to infection.</a> Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis. 59 (3), (2011).</li><li>McClelland, E. E., Perrine, W. T., Potts, W. K., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+virulence+factor+expression+to+evolved+virulence+in+mouse-passaged+Cryptococcus+neoformans+lines.">Relationship of virulence factor expression to evolved virulence in mouse-passaged Cryptococcus neoformans lines.</a> Infect Immun. 73 (10), 7047-7050 (2005).</li><li>Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+capsule+growth+in+Cryptococcus+neoformans+by+mammalian+serum+and+CO(2).">Induction of capsule growth in Cryptococcus neoformans by mammalian serum and CO(2).</a> Infect Immun. 71 (1), 6155-6164 (2003).</li><li>Vartivarian, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cryptococcal+capsular+polysaccharide+by+iron.">Regulation of cryptococcal capsular polysaccharide by iron.</a> J Infect Dis. 167 (1), 186-190 (1993).</li><li>McFadden, D. C., Fries, B. C., Wang, F., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsule+structural+heterogeneity+and+antigenic+variation+in+Cryptococcus+neoformans.">Capsule structural heterogeneity and antigenic variation in Cryptococcus neoformans.</a> Eukaryot Cell. 6 (8), 1464-1473 (2007).</li><li>Garcia-Hermoso, D., Dromer, F., Janbon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+capsule+structure+evolution+in+vitro+and+during+murine+infection.">Cryptococcus neoformans capsule structure evolution in vitro and during murine infection.</a> Infect Immun. 72 (6), 3359-3365 (2004).</li><li>Gates, M. A., Thorkildson, P., Kozel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+Cryptococcus+neoformans+capsule.">Molecular architecture of the Cryptococcus neoformans capsule.</a> Mol Microbiol. 52 (1), 13-24 (2004).</li><li>Pontes, B., Frases, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cryptococcus+neoformans+capsule:+lessons+from+the+use+of+optical+tweezers+and+other+biophysical+tools.">The Cryptococcus neoformans capsule: lessons from the use of optical tweezers and other biophysical tools.</a> Front Microbiol. 6, 640 (2015).</li><li>Shen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+tracking+of+gene+expression+in+individual+cells+and+cell+compartments.">Automated tracking of gene expression in individual cells and cell compartments.</a> J R Soc Interface. 3 (11), 787-794 (2006).</li><li>Dorn, J. F., Danuser, G., Yang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+processing+and+analysis+of+dynamic+fluorescence+image+data.">Computational processing and analysis of dynamic fluorescence image data.</a> Methods Cell Biol. 85, 497-538 (2008).</li><li>Nketia, T. A., Sailem, H., Rohde, G., Machiraju, R., Rittscher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+live+cell+images:+Methods,+tools+and+opportunities.">Analysis of live cell images: Methods, tools and opportunities.</a> Methods. , 65-79 (2017).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , 33-38 (2015).</li><li>Kwon, O., Kang, S. T., Kim, S. H., Kim, Y. H., Shin, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximum+intensity+projection+using+bidirectional+compositing+with+block+skipping.">Maximum intensity projection using bidirectional compositing with block skipping.</a> J Xray Sci Technol. 23 (1), 33-44 (2015).</li><li>Janbon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+genome+and+transcriptome+of+Cryptococcus+neoformans+var.+grubii+reveals+complex+RNA+expression+and+microevolution+leading+to+virulence+attenuation.">Analysis of the genome and transcriptome of Cryptococcus neoformans var. grubii reveals complex RNA expression and microevolution leading to virulence attenuation.</a> PLoS Genet. 10 (4), e1004261 (2014).</li><li>Bisson, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+HAART+is+associated+with+decreased+risk+of+death+during+initial+treatment+of+cryptococcal+meningitis+in+adults+in+Botswana.">The use of HAART is associated with decreased risk of death during initial treatment of cryptococcal meningitis in adults in Botswana.</a> J Acquir Immune Defic Syndr. 49 (2), 227-229 (2008).</li><li>van Teeffelen, S., Shaevitz, J. W., Gitai, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+analysis+in+fluorescence+microscopy:+bacterial+dynamics+as+a+case+study.">Image analysis in fluorescence microscopy: bacterial dynamics as a case study.</a> Bioessays. 34 (5), 427-436 (2012).</li><li>Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+of+Cryptococcus+neoformans.+Regulation+of+capsule+synthesis+by+carbon+dioxide.">Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide.</a> J Clin Invest. 76 (2), 508-516 (1985).</li></ol>

صاحب البلاغ، لأي هوين، هو مدير المنتج في درفيسيون التي تنشر برمجيات تحليل الصورة الآلي، أيفيا.

على مدى عقود، كانت الكبسولة محاور تركيز رئيسية للبحوث لكل من ميكولوجيستس والأطباء مهتمة المرسلة جيم- وتأتي بسبب دورها كعامل فوعة رئيسية لمسببات المرض. استخدام الفحص المجهري لقياس الاختلافات بين السلالات في الحجم الكبسولة وتحت النمو مختلف الظروف يمكن أن توفر معلومات هامة حول مسببات ...

تؤثر على ربع مليون شخص كل عام، وأسفر عن وفاة أكثر من 180,000 سنوياً، المرسلة بين هو من خميرة المسببة للأمراض، وداخل الخلايا والمسبب للفطريات1،2، 3. الأكثر تضررا هم مرضى فيروس نقص المناعة البشرية في البلدان الفقيرة الذين ليس لديهم استعداد الحصول على العلاج المضاد للفيروسات الرجعية، ويجعلها شديدة عرضه ل المرض5،،من46. وتشير البيانات من مركز السيطرة على الأمراض إلى أن في أفريقيا جنوب الصحراء، والمرسلة جيم- يقتل المزيد من الناس من السل سنوياً وشهريا أكثر من أي تفشي فيروس إيبولا في سجل1. الطريق الأكثر شيوعاً للتعرض يحدث من استنشاق الجراثيم يهتمان التي شائعة في البيئة7. عند دخول الرئتين، وهناك عدة عوامل الفوعة التي تسهم في نجاح المرسلة جيم- ضمن الأفراد المصابين. ويعتبر الكبسولة السكاريد عامل الفوعة الأساسي الميكروب، سلالات أكابسولار لا ضراوة8.
كبسولة الفطري تتألف من ثلاثة عناصر هي المبدأ: جلوكورونوكسيلومانان (جكسم)، جالاكتوكسيلومانان (جالكسم)، ومانوبروتينس (MPs)9. بينما النواب عنصرا المرتبطة بجدار الخلية طفيفة نسبيا من الكبسولة، وهي مكسبه ويمكن تعزيز استجابة برو-التهابات معظمهم9،10. وفي المقابل، جكسم وجالكسم يشكلون الجزء الأكبر الكبسولة (> 90% بالوزن)، وقد آثار كآبته11. بالإضافة إلى إثارة إيمونومودولاتوري، إنشاء التوسيع السريع لكبسولة في فيفو حاجز ميكانيكية لابتلاع المضيف الخلايا البلعمية (أي، العَدلات والضامة)12. كبسولة المرسلة جيم وملخص معقدة، ولكن قطر كبسولة عموما، زيادة يرتبط مع ازدياد ضراوة6،،من1314. نظراً لهذا، من المهم للباحثين المرسلة جيم- لتكون قادرة بسرعة ودقة قياس قياسات كبسولة.
الخلية المرسلة C. وفي كبسولة السكاريد الهياكل الحيوية وإظهار التغييرات على مر الوقت15. يمكن تغيير الكبسولة في الكثافة والحجم، والجمعية العامة استجابة للتغيرات في البيئة المضيفة16،،من1718. الحديد منخفضة أو مستويات المغذيات، التعرض لمصل الدم ودرجة الحموضة الفيزيولوجية البشرية وزيادة أول أكسيد الكربون2 معروفة لبدء النمو كبسولة16،18،،من1920. علاوة على ذلك، أظهرت الباحثون التغييرات الهيكلية التي أسفرت عن وجود اختلافات كبيرة في إيمونوريكتيفيتي خلال عدوى، الإقراض ميزة جيم-المرسلة على المضيفة21،22. وهذا يعرف بهيكل الكبسولة المرسلة جيم- قد تم تحليلها في مجموعة متنوعة من الطرق. المجهر الإلكتروني، على سبيل المثال، قد كشفت أن الكبسولة قد مصفوفة متجانسة مع طبقة كثيفة إلكترون داخلية تحت طبقة الخارجي، نفاذية أكثر23. تشتت الضوء، واستخدام الملقط الضوئية مكنت الباحثين لتوضيح خصائص الجزيئات في24. تحليل النتائج من كل القياسات تشتت الضوء والدينامية، ونحن نعلم أن الكبسولة السكاريد له هيكل تفريعات معقدة23. وقد استخدمت ملاقط بصرية لاختبار صلابة الهيكل، فضلا عن تقييم بجسم مفاعليه24. ومع ذلك، تحليل العاملين أكثر في كثير من الأحيان الكبسولة المرسلة جيم- هو قياس حجمه.
لقياس الحجم الكبسولة، استخدم الباحثون ما ينبغي أن يكون قياس بسيطة: قطر خطي الكبسولة. وتستخدم المجاهر الرقمية لالتقاط صور متعددة الخلايا المرسلة جيم (عموما مئات) ملطخة بالحبر الهند أو صبغات الفلورسنت. ويقاس حجم كل خلية الجسم والكبسولة المحيطة بها. يتم تجميع البيانات، ويتم حساب متوسط قطرها الكبسولة عن طريق طرح قطر جسم الخلية من القطر كله خلية (خلية الجسم + كبسولة). حتى هذه اللحظة، تم تنفيذ هذه القياسات يدوياً. بينما عموما دقيقة، يحتوي هذا الأسلوب عيوب للباحثين. مجموعات كبيرة من البيانات يمكن أن تأخذ أيام أو حتى أسابيع لتحليل باليد. ونظرا لأن هذه القياسات تتم يدوياً، الذاتية والأخطاء البشرية قد تؤثر على النتيجة.
تحليل الصور الحاسوبية المؤتمتة أصبحت أداة لا غنى عنها للباحثين في كثير من مجالات بيولوجيا الخلية الجزيئية، تمكين تحليل الصور البيولوجية 25،،من2627أسرع وأكثر موثوقية. تقنيات تحليل الصورة الدقيقة ضرورية للمعلومات الكمية عن ما غالباً ما تكون معقدة وهائلة من مجموعات البيانات المتعلقة بالألغام. ومع ذلك، بعض القياسات، لا سيما قياس كبسولة المرسلة جيم ، كان من الصعب على أتمتة. دقة تحديد الواجهة بين جدار الخلية وكبسولة، الذي يظهر عادة كعصابة الظلام عند تصويرها بالفحص المجهري المرحلة-على النقيض، يمكن أن تكون مزعجة لحل باستخدام عتبة بسيطة. علاوة على ذلك، الخلايا المرسلة جيم في الثقافة تميل إلى أن تتجمع معا وتقسيم دقيق للخلايا اللازمة لقياسات دقيقة.
وكان الهدف من هذا المشروع (ط) توضيح أحد البروتوكولات القياسية لتحريض كبسولة في المرسلة جيم، (ثانيا) قارن وعلى النقيض الحبر الهند وتلطيخ الأسفار كما أنها تتصل بكبسولة قياسات القطر، (ثالثا) تطوير بسيط، الطرق الحسابية لقياس القطر كبسولة استخدام الصور للهند الحبر الملون الخلايا باستخدام برنامج تحليل صورة، و (رابعا) تقييم فوائد وتقييدات لقياس القطر كبسولة يدوياً واستخدام برامج التشغيل الآلي. أننا نجد أن الأسلوبين المصبوغة، فلوري وسم جدار الخلية وكبسولة، بينما أكثر استهلاكاً للوقت، وتقدم نتائج أكثر اتساقا بين التجارب. بيد أن كلا الأسلوبين مكن لنا أن نميز بنجاح بين مختبر والسريرية المرسلة جيم- كبسولة سلالات العارضة مختلفة الأحجام. علاوة على ذلك، كنا قادرين على أتمتة قياس القطر كبسولة من الهند الحبر الملون الصور، ووجدت أن هذا بديل قابل للتطبيق للقياس اليدوي من الكبسولة.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Capsule Induction&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;C. neoformans cells&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>The clinical lab strain, H99S, was a kind gift from Dr. John Perfect (Duke University).&amp;nbsp; The clinical strains, B18 and B52, were kind gifts from Dr. Greg Bisson (University of Pennsylania).&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Yeast Peptone Dextrose Broth (YPD)</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0428-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td></td><td></td><td>This is made in the lab using standard recipe (137mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O)</td></tr><tr><td>DMEM/high-glucose with L-glutamine, without sodium pyruvate</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>6-well plates</td><td>Falcon</td><td>CL5335-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Shaking incubator</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td></td><td>MaxQ6000</td></tr><tr><td>CO2 incubator</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Isotemp</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Legend XTR</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Staining&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Legend Micro 21R</td></tr><tr><td>India ink</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-910-56</td><td></td></tr><tr><td>Calcofluor white</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18909-100ML-F</td><td></td></tr><tr><td>18B7 mouse anti-GXM antibody conjugated to Alexafluor 488</td><td></td><td></td><td>A kind gift from Dr. Arturo Casadevall (Johns Hopkins University)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PBS with 1% Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td></td><td></td><td>PBS is the same recipe listed above (line 4) with 1% BSA added and filter sterilized.</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost microscope slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-143</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips</td><td>Corning</td><td>2855-18</td><td>#1.5 thickness</td></tr><tr><td>Clear nail polish or other non-toxic sealant</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Image Acquisition&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersion oil</td><td>Cargille&amp;nbsp;</td><td>16484</td><td></td></tr><tr><td>Light microscope with immersion oil objective</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Zeiss Axio A1 with a Plan - NEOFLUAR 100x oil immersion NA 1.30 objective</td></tr><tr><td>Light microscope camera</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Zeiss Axiocam ErCD camera</td></tr><tr><td>Confocal microscope with oil immersion objective</td><td>Zeiss</td><td></td><td>LSM 700 laser scanning confocal equipped with a Plan-Apochromat 63X NA 1.4 oil immersion DIC M27 objective.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Confocal microscope software</td><td>Zen 2009</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope camera</td><td>Nikon</td><td></td><td>Nikon Ti-Eclipse with a Intensilight epifluorescence illuminator (Nikon), CoolSNAP MYO microscope camera (Photometrics), Plan Apo 60x NA 1.40 oil immersion objective (Nikon) and 1.5x magnification changer.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Widefield imaging software</td><td>Nikon Elements (Nikon)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Capsule Measurement&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image editing software</td><td>Photoshop (Adobe)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope software for manual measurement</td><td>Axiovision (Carl Zeiss)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image analysis software for automated meesurement</td><td>Aivia (DRVision Technologies)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spreadsheet software</td><td>Excel (Microsoft)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

size matters: measurement of capsule diameter in cryptococcus neoformans

كبسولة السكاريد من المرسلة بين عامل الفوعة الأساسي وعادة من أهم درس جوانب من هذه الخميرة المسببة للأمراض. الحجم الكبسولة يمكن أن تختلف على نطاق واسع بين السلالات ولديها القدرة على النمو بسرعة عند عرض الظروف المغذيات المجهدة أو منخفضة، وقد تم ارتباطاً إيجابيا بضراوة سلالة. لهذه الأسباب، الحجم الكبسولة من اهتمام كبير للباحثين المرسلة جيم . هو الناجم عن نمو الكبسولة المرسلة جيم- أثناء اختبار المظهرية للمساعدة في فهم آثار المعالجات المختلفة على الخميرة أو حجم الاختلافات بين السلالات. هنا يصف لنا أحد الأساليب القياسية كبسولة التعريفي ومقارنة الأساليب المقبولة اثنين من تلطيخ وقياس القطر كبسولة: الهند الحبر (ط)، ووصمة سلبية، المستخدمة في الاقتران مع الفحص المجهري الخفيفة التقليدية و (ثانيا) تلطيخ يشترك مع الأصباغ الفلورية جدار الخلية وكبسولة تليها مجهرية [كنفوكل] على حد سواء. أخيرا، نحن إظهار كيف يمكن قياس القطر كبسولة من عينات الملطخة بالحبر الهند الآلي باستخدام تحليل الصور الحسابية.

لتوضيح التعريفي كبسولة وتلطيخ الخلية وتصوير وقياس التقنيات، استخدمنا ثلاث سلالات من جيم-المرسلة: سلالة المختبر مشتركة، تتميز جيدا، H99S30، والسلالات المعزولة سريرياً اثنين من سابقا قطر كبسولة غير معروف، B18 و B5231.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-p...

Watch this Scientific Journal Video about Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans at JoVE.com

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

المسائل الحجم: قياس "القطر كبسولة" في المرسلة بين

كبسولة السكاريد هو عامل الفوعة الأساسي بين المرسلة، وحجمه وترتبط بضراوة السلالة. قياسات قطرها كبسولة وتستخدم في اختبار المظهرية وقياس الفعالية العلاجية. ويرد هنا أسلوب قياسي لتحريض كبسولة، والمقارنة بين طريقتين لتلوين وقياس القطر.

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic ...

size-matters-measurement-capsule-diameter-cryptococcus

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

13.4K Views.  Middle Tennessee State University. كبسولة السكاريد هو عامل الفوعة الأساسي بين المرسلة، وحجمه وترتبط بضراوة السلالة. قياسات قطرها كبسولة وتستخدم في اختبار المظهرية وقياس الفعالية العلاجية. ويرد هنا أسلوب قياسي لتحريض كبسولة، والمقارنة بين طريقتين لتلوين وقياس القطر.

Video: Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

Separating Bacteria by Capsule Amount Using a Discontinuous Density Gradient

Capsule is a key virulence factor in many bacterial species, mediating immune evasion and resistance to various physical stresses. While many methods are available to quantify and compare capsule production between different strains or mutants, there is no widely used method for sorting bacteria based on how much capsule they produce. We have developed a method to separate bacteria by capsule amount, using a discontinuous density gradient. This method is used to compare capsule amounts semi-quantitatively between cultures, to isolate mutants with altered capsule production, and to purify capsulated bacteria from complex samples. This method can also be coupled with transposon-insertion sequencing to identify genes involved in capsule regulation. Here, the method is demonstrated in detail, including how to optimize the gradient conditions for a new bacterial species or strain, and how to construct and run the density gradient.

We demonstrate the use of discontinuous density gradients to separate bacterial populations based on capsule production. This method is used to compare capsule amount between cultures, isolate mutants with a specific capsule phenotype, or to identify capsule regulators. Described here is the optimization and running of the assay.

فصل البكتيريا بمقدار كبسولة استخدام تدرج كثافة متقطع

Capsule is a key virulence factor in many bacterial species, mediating immune evasion and resistance to various physical stresses. While many methods are ...

Genetics

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans commonly employ infection of mammalian hosts or host cells (i.e. macrophages) followed by yeast quantification using colony forming unit analysis or flow cytometry. While colony forming unit enumeration has been the most commonly used method in the field, this technique has disadvantages and limitations, including slow growth of some fungal species on solid media and low and/or variable plating efficiencies, which is of particular concern when comparing growth of wild-type and mutant strains. Flow cytometry can provide rapid quantitative information regarding yeast viability, however, adoption of flow cytometric detection for pathogenic yeasts has been limited for a number of practical reasons including its high cost and biosafety considerations. Here, we demonstrate an image-based cytometric methodology using the Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience, LLC) for the quantification of viable pathogenic yeasts in co-culture with macrophages. Our studies focus on detection of two human fungal pathogens: Histoplasma capsulatum and Candida albicans. H. capsulatum colonizes alveolar macrophages by replicating within the macrophage phagosome, and here, we quantitatively assess the growth of H. capsulatum yeasts in RAW 264.7 macrophages using acridine orange/propidium iodide staining in combination with image cytometry. Our method faithfully recapitulates growth trends as measured by traditional colony forming unit enumeration, but with significantly increased sensitivity. Additionally, we directly assess infection of live macrophages with a GFP-expressing strain of C. albicans. Our methodology offers a rapid, accurate, and economical means for detection and quantification of important human fungal pathogens in association with host cells.

Here, we demonstrate how image cytometry can be used for quantification of pathogenic fungi in association with host cells in culture. This technique can be used as an alternative to CFU enumeration.

استخدام الخلوي على الصورة لعرض الكمي من الفطريات الممرضة في جمعية مع الخلايا المضيفة

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular interaction that is not clearly understood is non-lytic exocytosis. In this process, yeast cells are released into the extracellular space by a poorly understood mechanism that leaves both the macrophage and Cn viable. Here, we describe how to follow a large number of individually infected macrophages for a 24 hr infection period by time-lapsed microscopy. Infected macrophages are housed in a heating chamber with a CO2 atmosphere attached to a microscope that provides the same conditions as a cell-culture incubator. Live digital microscopy can provide information about the dynamic interactions between a host and pathogen that is not available from static images. Being able to visualize each infected cell can provide clues as to how macrophages handle fungal infections, and vice versa. This technique is a powerful tool in studying the dynamics that are behind a complex phenomenon.

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

We describe how to visualize macrophage-C. neoformans (Cn) interactions in real time, with specific emphasis on the process of non-lytic exocytosis using digital light microscopy. Using this technique individually infected macrophages can be studied to ascertain various aspects of this phenomenon.

تصور الإيماس غير التحللي من<em&gt; الأدعومية المستخفية</em&gt; من الضامة الرقمية الخفيفة عن طريق الميكروسكوب

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are able to replicate in the deep lung. Phagocytosis of Cryptococcus by macrophages is one of the ways that the disease is able to spread into the central nervous system to cause lethal meningoencephalitis. Therefore, study of the association between Cryptococcus and macrophages is important to understanding the progression of the infection. The present study describes a step-by-step protocol to study macrophage infectivity by C. neoformansin vitro. Using this protocol, the role of host sterols on host-pathogen interactions is studied. Different concentrations of methyl--cyclodextrin (MCD) were used to deplete cholesterol from murine reticulum sarcoma macrophage-like cell line J774A.1. Cholesterol depletion was confirmed and quantified using both a commercially available cholesterol quantification kit and thin layer chromatography. Cholesterol depleted cells were activated using Lipopolysacharide (LPS) and Interferon gamma (IFN&#947;) and infected with antibody-opsonized Cryptococcus neoformans wild-type H99 cells at an effector-to-target ratio of 1:1. Infected cells were monitored after 2 hr of incubation with C. neoformans and their phagocytic index was calculated. Cholesterol depletion resulted in a significant reduction in the phagocytic index. The presented protocols offer a convenient method to mimic the initiation of the infection process in a laboratory environment and study the role of host lipid composition on infectivity.

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

بلعم الكولسترول استنفاد وتأثيره على البلعمة من<em&gt; المستخفية المورمة</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

The purpose of this technique is to provide a consistent, accurate, and manageable process for large numbers of polysaccharide capsule measurements.
First, a threshold image is generated based on intensity values uniquely calculated for each image. Then, circles are detected based on contrast between the object and background using the well-established Circle Hough Transformation (CHT) algorithm. Finally, the detected cell capsules and bodies are matched according to center coordinates and radius size, and data is exported to the user in a manageable spreadsheet.
The advantages of this technique are simple but significant. First, because these calculations are performed by an algorithm rather than a human both accuracy and reliability are increased. There is no decline in accuracy or reliability regardless of how many samples are analyzed. Second, this approach establishes a potential standard operating procedure for the Cryptococcus field instead of the current situation where capsule measurement varies by lab. Third, given that manual capsule measurements are slow and monotonous, automation allows rapid measurements on large numbers of yeast cells that in turn facilitates high throughput data analysis and increasingly powerful statistics.
The major limitations of this technique come from how the algorithm functions. First, the algorithm will only generate circles. While Cryptococcus cells and their capsules take on a circular morphology, it would be difficult to apply this technique to non-circular object detection. Second, due to how circles are detected the CHT algorithm can detect enormous pseudo-circles based on the outer edges of several clustered circles. However, any misrepresented cell bodies caught within the pseudo-circle can be easily detected and removed from the resulting data sets.
This technique is meant for measuring the circular polysaccharide capsules of Cryptococcus species based on India Ink bright field microscopy; though it could be applied to other contrast based circular object measurements.

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

This technique describes an automated batch image processor designed to measure polysaccharide capsule and body radii. While initially designed for Cryptococcus neoformans capsule measurements the automated image processor can also be applied to other contrast based detection of circular objects.

القياس الآلي كبسولة السكاريد الأنواع الفطري وجسم الخلية

The purpose of this technique is to provide a consistent, accurate, and manageable process for large numbers of polysaccharide capsule measurements.
...

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record forces curves on 1000 cells in 4 hours automatically. To maintain a 4 hour analysis time, the number of force curves per cell is reduced to 9 or 16. The method combines a Jython based program and a strategy for assembling cells on defined patterns. The program, implemented on a commercial Bio-AFM, can center the tip on the first cell of the array and then move, automatically, from cell to cell while recording force curves on each cell. Using this methodology, it is possible to access the biophysical parameters of the cells such as their rigidity, their adhesive properties, etc. With the automation and the large number of cells analyzed, one can access the behavior of the cell population. This is a breakthrough in the Bio-AFM field where data have, so far, been recorded on only a few tens of cells.

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

This protocol aims to automate AFM measurements on hundreds of microbial cells. First, microbes are immobilized into PDMS stamp microstructures and then force spectroscopy measurements are performed automatically on hundreds of immobilized cells.

أتمتة قياسات المجهر القوة الحيوية الذرية على مئات من خلايا ألبيكانس C.

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...

Bioengineering

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for macrophages. This predatory organism, similar to macrophages, employs phagocytosis to kill internalized cells. With the aid of a confocal laser-scanning microscope, images depicting interactive moments between cryptococcal cells and amoeba are captured. The resolution power of the electron microscope also helps to reveal the ultrastructural detail of cryptococcal cells when trapped inside the amoeba food vacuole. Since phagocytosis is a continuous process, quantitative data is then integrated in the analysis to explain what happens at the timepoint when an image is captured. To be specific, relative fluorescence units are read in order to quantify the efficiency of amoeba in internalizing cryptococcal cells. For this purpose, cryptococcal cells are stained with a dye that makes them fluoresce once trapped inside the acidic environment of the food vacuole. When used together, information gathered through such techniques can provide critical information to help draw conclusions on the behavior and fate of cells when internalized by amoeba and, possibly, by other phagocytic cells.

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

This paper details a protocol for preparing a co-culture of cryptococcal cells and amoebae that is studied using still, fluorescent images and high-resolution transmission electron microscope images. Illustrated here is how quantitative data can complement such qualitative information.

الاستخدام التكميلي للتقنيات المجهرية والقراءة الفلورية في دراسة تفاعلات Cryptococcus-Amoeba

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

Fungal infections have become an important medical condition in the last decades, but the number of available antifungal drugs is limited. In this scenario, the search for new antifungal drugs is necessary. The protocol reported here details a method to screen peptides for their antifungal properties. It is based on the broth microdilution susceptibility test from the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 guidelines with modifications to suit the research of antimicrobial peptides as potential new antifungals. This protocol describes a functional assay to evaluate the activity of antifungal compounds and may be easily modified to suit any particular class of molecules under investigation. Since the assays are performed in 96-well plates using small volumes, a large-scale screening can be completed in a short amount of time, especially if carried out in an automation setting. This procedure illustrates how a standardized and adjustable clinical protocol can help the bench-work pursuit of new molecules to improve the therapy of fungal diseases.

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

An easy and adaptable broth microdilution method for screening antifungal compounds and extracts.

ميكروديلوشن مرق في المختبر الفرز: طريقة سهلة وسريعة للكشف عن المركبات المضادة للفطور جديدة

Fungal infections have become an important medical condition in the last decades, but the number of available antifungal drugs is limited. In this ...

Biology

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically estimated on solidified media by comparing colony size. However, to quantitatively measure the growth rate of genetically different fungal strains or strains under different environmental/growth conditions (pH, temperature, carbon and nitrogen sources, antibiotics, etc.) is challenging. Thus, the pursuit of complementary approaches to quantify growth kinetics becomes mandatory in order to better understand fungal cell growth. Furthermore, it is well-known that filamentous fungi, including Aspergillus spp., have distinct modes of growth and differentiation under sub-aerial conditions on solid media or submerged cultures. Here, we detail a quantitative microscopic method for analyzing growth kinetics of&#160;the model fungus Aspergillus nidulans, using live imaging in both submerged cultures and solid media. We capture images, analyze, and quantify growth rates of different fungal strains in a reproducible and reliable manner using an open source, free software for bio-images (e.g., Fiji), in a way that does not require any prior image analysis expertise from the user.

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

We present a label-free live imaging protocol using transmitted light microscopy techniques to capture images, analyze and quantify growth kinetics of the filamentous fungus A. nidulans in both submerged cultures and solid media. This protocol can be used in conjunction with fluorescence microscopy.

التحليل الكمي لمعدل نمو النيدولانات Aspergillus باستخدام المجهر الحي والبرمجيات مفتوحة المصدر

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically ...

Assessing the Putative Anticryptococcal Properties of Crude and Clarified Extracts from Mollusks

Cryptococcus neoformans is an encapsulated human fungal pathogen with a global distribution that primarily infects immunocompromised individuals. The widespread use of antifungals in clinical settings, their use in agriculture, and strain hybridization have led to increased evolution of resistance. This rising rate of resistance against antifungals is a growing concern among clinicians and scientists worldwide, and there is heightened urgency to develop novel antifungal therapies. For instance, C. neoformans produces several virulence factors, including intra- and extra-cellular enzymes (e.g., peptidases) with roles in tissue degradation, cellular regulation, and nutrient acquisition. The disruption of such peptidase activity by inhibitors perturbs fungal growth and proliferation, suggesting this may be an important strategy for combating the pathogen. Importantly, invertebrates such as mollusks produce peptidase inhibitors with biomedical applications and anti-microbial activity, but they are underexplored in terms of their usage against fungal pathogens. In this protocol, a global extraction from mollusks was performed to isolate potential peptidase inhibitors in crude and clarified extracts, and their effects against classical cryptococcal virulence factors were assessed. This method supports the prioritization of mollusks with antifungal properties and provides opportunities for the discovery of anti-virulence agents by harnessing the natural inhibitors found in mollusks.

The human fungal pathogen Cryptococcus neoformans produces a variety of virulence factors (e.g., peptidases) to promote its survival within the host. Environmental niches represent a promising source of novel natural peptidase inhibitors. This protocol outlines the preparation of extracts from mollusks and the assessment of their effect on fungal virulence factor production.

تقييم الخصائص المفترضة المضادة للخفيات للمستخلصات الخام والموضحة من الرخويات

Cryptococcus neoformans is an encapsulated human fungal pathogen with a global distribution that primarily infects immunocompromised individuals. The ...

المسائل الحجم: قياس "القطر كبسولة" في المرسلة بين

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video