ونشكر أعضاء مختبرات كوبيتو ولو بيرس للعديد من المناقشات مفيدة أثناء تطوير هذه الأساليب. ونشكر أيضا تيمسامريت ريان لقراءة نقدية لهذه المخطوطة. الأموال من جامعة العلوم وصناديق خيرية سميث قد أيد هذا العمل.

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

كما أن عدد المرضى الذين يعانون من أمراض الأعصاب تواصل الازدياد، هناك حاجة ملحة زيادة فهم الآلية المرضية الجزيئية لهذه الأمراض بحيث يمكن تطوير علاجات أفضل. هنا، نحن تصف الأساليب التي تسمح لرصد انتقال بريون مثل المجاميع البروتين المسببة للمرض بين أنواع الخلايا المختلفة في نموذج الكائن الح...

بريون فرضية تنص على أن الوكيل المعدية مسؤولة عن الاعتلال الاسفنجي (مثلاً، كروتزفيلد-جاكوب لدى البشر، والرعاش في الخراف ومرض الهزال المزمن في الأيائل والغزلان "مرض جنون البقر" في الماشية ) تتألف فقط من البروتين وخالية من الأحماض النووية1. في أمراض بريون، يفترض بروتين بريون الخلوية (PrPج) حظيرة غير أصلية، ومستقرة (PrPSc) هو درجة عالية من بيتا الغنية بورقة، ويمكن نشر الذاتي بتحويل وتوظيف أحادي الحزب الثوريج الجزيئات في اميلويد مستقرة المجاميع. PrPاتفاقية استكهولم تجميعات استخدام هذه الآلية ذاتية لتنتشر بين خلايا مختلفة في الكائن حي، وحتى بين الكائنات الفردية2.
بروتين ميسفولدينج والتجميع أيضا سمة أساسية لمعظم أمراض الأعصاب (مرض الزهايمر (AD) ومرض باركنسون (PD)، ومرض هنتنغتون (HD)، والتصلب العضلي الجانبي (المرض))3. تشكيل جمعيات البروتين مجمعة داخل أو خارج الخلايا في هذه الأمراض يرتبط ارتباطاً وثيقا سيتوتوكسيسيتي4 ، وتقدم على طول مسارات استنساخه للغاية وخاصة بالمرض عن طريق الدماغ على مر الزمن5، 6-أنماط انتشار هذه توحي بأن المجاميع المسببة للأمراض المرتبطة بهذه الاضطرابات خصائص مثل بريون. الآن يوجد دعم قوية لانتقال بريون مثل المجاميع المرتبطة بالإعلان، PD، عالية الدقة، والمرض--أنها تنتشر من خلية إلى خلية وقالب تغيير أحادي أشكال البروتين نفسه في خلايا تتأثر سابقا7، كونفورماشونال 8.
وقد أجريت معظم الدراسات التحقيق في انتشار بريون مثل المجاميع البروتين إلى تاريخ استخدام نماذج الثقافة خلية الثدييات، حيث نقل المجاميع في السيتوبلازم للخلايا ساذجة من الفضاء خارج الخلية أو من خلية أخرى السيتوبلازم9،10،11،،من1213،،من1415، أو عن طريق حقن المواد المحتوية على التجميع في أدمغة الفأر والرصد تجميع مظهر خارج حقن الموقع16،17،،من1819،20،21،22، 23. في الآونة الأخيرة، وقد استخدمت الحيوانات المحورة وراثيا لإثبات أن تنتشر مجاميع داخل الخلايا إلى خلايا أخرى ضمن العقول سليمة24،25،،من2627، 28،،من2930. هنا، نحن تصف طريقة للتصور مباشرة لنقل الكلي بين خلايا فردية في الدماغ سليمة من melanogaster المورفولوجية. أولاً وضعت نماذج المورفولوجية للأمراض عالية الدقة/بوليجلوتاميني (polyQ) منذ ما يقرب من عقدين من الزمان32 من31،، وقد قدم العديد من الأفكار لا تقدر بثمن في الآليات المسببة للمرض التي تكمن وراء هذه الاضطرابات 33-عالية الدقة هو اضطراب الأعصاب موروثة الناجمة عن طفرة مهيمنة جسمية في الجينات التي رموز ل البروتين هونتينجتين (Htt)34. نتائج هذه الطفرة في التوسع في امتداد polyQ قرب ن-تيرمينوس ل Htt تتجاوز عتبة المسببة للأمراض من ~ جلوتامينيس 37، يسبب البروتين ميسفولد و إجمالي35،36. البرية من نوع Htt البروتينات التي تحتوي على < جلوتامينيس 37 في هذا الامتداد تحقيق على إضعاف الأصلي، ولكن يمكن أن يتسبب للتجميع عند الاتصال الجسدي المباشر مع Htt تجميعية "البذور"12،،من2737. يمكننا استغلال هذه هوموتيبيك، تجميع Htt البرية من نوع الأنوية كقراءات لنقل مثل بريون ودخول هيولى متحولة Htt المجاميع الصادرة في الخلايا الأخرى.
تحديد الآليات بالمجاميع التي تشبه بريون السفر بين الخلايا يمكن أن يؤدي إلى تحديد أهداف علاجية جديدة للأمراض المستعصية الأعصاب. ونحن اتخاذ استفادة دورة حياة سريعة، وسهولة الاستخدام، والمقاييس الوراثية من melanogaster المورفولوجية لتحديد الآليات الجزيئية لخلية إلى انتشار متحولة Htt المجاميع. لدينا استراتيجية تجريبية توظف التعبير ثنائي نظامين متاحة المورفولوجيةوالراسخة الخاصة Gal4 المنبع تفعيل تسلسل (Gal4-UAS) نظام38 ووضعت مؤخرا QF-QUAS نظام39. اقتران هذين النظامين مستقلة يسمح تقييد التعبير عن المتسلسلات Htt متحولة والبرية من نوع للسكان خلية متميزة داخل يطير نفسه40. باستخدام هذا النهج، علينا أن ندرس بريون مثل نشر متحولة Htt برصد إعادة توزيع هيولى Htt البرية من نوع من حالته عادة منتشر، والقابلة للذوبان إلى حالة مجمعة، كنتيجة مباشرة للاتصال الجسدي مع متحولة سابق تشكيل Htt تجميع "البذور". يمكن تأكيد تحويل Htt البرية من نوع من المسخ Htt باستخدام الكيمياء الحيوية أو نقل التقنيات الفيزيائية الحيوية التي تقرير تفاعلات البروتين البروتين، مثل الطاقة صدى الأسفار (الحنق)9،،من2741 .
الأهم من ذلك، يمكننا أيضا الوصول إلى عدد كبير من الأدوات الجينية في المورفولوجية لتحديد الجينات و/أو المسارات التي تتوسط بريون مثل انتشار المجاميع البروتين. وقد استخدمنا مؤخرا هذا النهج لكشف النقاب عن دور رئيسي لمستقبلات الكاسح سطح الخلية، دريبر42،43، في نقل متحولة Htt المجاميع من محاور عصبية العصبية لإطلاق متجولة القريبة في المورفولوجية المركزية الجهاز العصبي (CNS)27. وهكذا، يمكن أن تكشف عن النهج الوراثية التصوير القائم والذي يصف لنا هنا المعلومات البيولوجية الأساسية الهامة حول ظاهرة ذات صلة بمرض في البسيطة الاستخدام لكنها قوية طراز الكائن الحي، و المورفولوجية.

<table><tbody><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS), 10X, pH 7.4</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9625</td><td>Dilute to 1X</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284-1L</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Thomas Scientific</td><td>2904F24</td><td></td></tr><tr><td>20% paraformaldehyde (PFA)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15713-S</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum (NGS), filtered</td><td>Lampire Biological Laboratories</td><td>7332500</td><td>Aliquot and freeze upon receipt</td></tr><tr><td>Chicken anti-GFP</td><td>Aves Labs</td><td>GFP-1020</td><td>Use at 1:500 dilution</td></tr><tr><td>Rabbit anti-DsRed</td><td>Clontech</td><td>632496</td><td>Use at 1:2000 dilution; can recognize DsRed-based fluorescent proteins (e.g. mCherry, mStrawberry, tdTomato, etc.)</td></tr><tr><td>Mouse anti-Bruchpilot</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>nc82</td><td>Use at 1:100 dilution; will label active pre-synaptic structures thoughout the fly brain</td></tr><tr><td>FITC anti-chicken</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>SA1-7200</td><td>Use at 1:250 dilution</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 anti-rabbit</td><td>Life Technologies</td><td>A11011</td><td>Use at 1:250 dilution</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-mouse antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A21235</td><td>Use at 1:250 dilution</td></tr><tr><td>Slowfade Gold Antifade Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>S36936</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides (25 x 75 x 1.0 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-143</td><td></td></tr><tr><td>Cover Glass (22 x 22 mm)</td><td>Globe Scientific</td><td>1404-15</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Biology Grade Forceps, Style 3</td><td>Ted Pella</td><td>503</td><td>use in non-dominant hand</td></tr><tr><td>Dumont Biology Grade Forceps, Style 5</td><td>Ted Pella</td><td>505</td><td>use in dominant hand</td></tr><tr><td>LAS X image analysis software</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris image analysis software</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

monitoring cell-to-cell transmission of prion-like protein aggregates in drosophila melanogaster

تجميع البروتين سمة أساسية لمعظم أمراض الأعصاب، بما في ذلك مرض الزهايمر (AD) ومرض باركنسون (PD)، ومرض هنتنغتون (HD)، والتصلب العضلي الجانبي (المرض). البروتين المجاميع ترتبط ارتباطاً وثيقا بأمراض الأعصاب في هذه الأمراض، وعلى الرغم من أن الآلية الدقيقة الذي يعطل تجميع البروتين الشاذة التوازن الخلوية العادية غير معروف. تظهر البيانات تقديم دعم قوي للفرضية القائلة بأن المجاميع المسببة للأمراض في الإعلان، PD، هد، والمرض لديها الكثير من أوجه التشابه إلى البريونات، وعوامل معدية البروتين فقط مسؤولة عن الاعتلال الاسفنجي. الذاتي تكرار البريونات بقولبة تحويل الإصدارات مطوية أصلاً من البروتين نفسه، مما تسبب في انتشار النمط الظاهري التجميع. كيف البريونات وبروتينات بريون الشبيهة في الإعلان، تحرك PD، عالية الدقة، والمرض من خلية واحدة إلى آخر في الوقت الراهن مجالاً لتحقيقات مكثفة. ويرد هنا، نموذج melanogaster المورفولوجية التي تسمح برصد انتقال بريون--مثل، خلية إلى خلية هونتينجتين المسخ (Htt) المجاميع المرتبطة بهد. هذا النموذج يأخذ استفادة أدوات قوية لمعالجة التعبير التحوير في العديد من الأنسجة المورفولوجية المختلفة ويستخدم بروتين هيولى معلم فلوريسسينتلي مباشرة التقرير بريون مثل نقل متحولة Htt المجاميع. الأهم من ذلك، يمكن استخدام النهج الذي يصف لنا هنا لتحديد الجينات الجديدة والمسارات التي تتوسط نشر المجاميع البروتين بين أنواع الخلايا المتنوعة في فيفو. المعلومات المكتسبة من هذه الدراسات سيتم توسيع الفهم المحدود للآليات المسببة للمرض التي تكمن وراء أمراض الأعصاب، وتكشف عن فرص جديدة للتدخل العلاجي.

الأساليب الموصوفة هنا إنتاج بيانات قوية تثبت بريون مثل نقل المجاميع البروتين Htt من السكان خلية واحدة إلى آخر في الطاير سليمة الجهاز العصبي المركزي. ولوحظ تحويل Htt البرية من نوع من التشتيت إلى الشروريه بالأسفار مباشرة من هذا البروتين الانصهار يفب في إطلاق المستفيدة نتيجة ...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster at JoVE.com

Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster

تتراكم الأدلة تؤيد فكرة أن المجاميع البروتين المسببة للأمراض المرتبطة بأمراض الأعصاب تنتشر بين الخلايا التي تحتوي على خصائص مثل بريون. هنا، يمكننا وصف أسلوب يتيح للتصور من خلية إلى خلية انتشار بريون مثل المجاميع في نموذج الكائن الحي، melanogaster المورفولوجية.

رصد خلية إلى انتقال بروتين بريون مثل المجاميع في Melanogaster المورفولوجية

Protein aggregation is a central feature of most neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#39;s disease (AD), Parkinson&#39;s disease (PD), ...

monitoring-cell-to-cell-transmission-prion-like-protein-aggregates

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster

7.9K Views.  University of the Sciences. تتراكم الأدلة تؤيد فكرة أن المجاميع البروتين المسببة للأمراض المرتبطة بأمراض الأعصاب تنتشر بين الخلايا التي تحتوي على خصائص مثل بريون. هنا، يمكننا وصف أسلوب يتيح للتصور من خلية إلى خلية انتشار بريون مثل المجاميع في نموذج الكائن الحي، melanogaster المورفولوجية.

Video: Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster

Monitoring Immune Cells Trafficking Fluorescent Prion Rods Hours after Intraperitoneal Infection

Presence of an abnormal form a host-encoded prion protein (PrPC) that is protease resistant, pathologic and infectious characterizes prion diseases such as Chronic Wasting Disease (CWD) of cervids and scrapie in sheep. The Prion hypothesis asserts that this abnormal conformer constitutes most or all of the infectious prion. The role of the immune system in early events in peripheral prion pathogenesis has been convincingly demonstrated for CWD and scrapie 1-3. Transgenic and pharmacologic studies in mice revealed an important role of the Complement system in retaining and replicating prions early after infection 4-6. In vitro and in vivo studies have also observed prion retention by dendritic cells 7-10, although their role in trafficking remains unclear 11-16. Macrophages have similarly been implicated in early prion pathogenesis, but these studies have focused on events occurring weeks after infection 3,11,17. These prior studies also suffer from the problem of differentiating between endogenous PrPC and infectious prions. Here we describe a semiquantitative, unbiased approach for assessing prion uptake and trafficking from the inoculation site by immune cells recruited there. Aggregated prion rods were purified from infected brain homogenate by detergent solubilization of non-aggregated proteins and ultracentrifugation through a sucrose cushion. Polyacrylamide gel electrophoresis, coomassie blue staining and western blotting confirmed recovery of highly enriched prion rods in the pelleted fraction. Prion rods were fluorochrome-labeled then injected intraperitoneally into mice. Two hours later immune cells from peritoneal lavage fluid, spleen and mediastinal and mesenteric lymph nodes were assayed for prion rod retention and cell subsets identified by multicolor flow cytometry using markers for monocytes, neutrophils, dendritic cells, macrophages and B and T cells. This assay allows for the first time direct monitoring of immune cells acquiring and trafficking prions in vivo within hours after infection. This assay also clearly differentiates infectious, aggregated prions from PrPC normally expressed on host cells, which can be difficult and lead to data interpretation problems in other assay systems. This protocol can be adapted to other inoculation routes (oral, intravenous, intranervous and subcutaneous, e.g.) and antigens (conjugated beads, bacterial, viral and parasitic pathogens and proteins, egg) as well.

Here we describe a novel assay for monitoring prion uptake and trafficking by immune cells immediately following intraperitoneal inoculation by purifying and fluorescently labeling aggregated prion rods from infected brain material then monitoring their uptake and movement from the injection site and characterizing the cells mediating these events.

رصد خلايا المناعة الاتجار نيون بريون قضبان وبعد ساعات من العدوى داخل الصفاق

Presence of an abnormal form a host-encoded prion protein (PrPC) that is protease resistant, pathologic and infectious characterizes prion diseases such ...

Immunology and Infection

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the fly as an experimental system include its genetic tractability, short life span and the possibility to observe and quantitatively analyze complex behaviors. The expression of disease-linked genes in specific neuronal populations of the Drosophila brain, can be used to model human neurodegenerative diseases such as Parkinson's and Alzheimer's 5.
Dopaminergic (DA) neurons are among the most vulnerable neuronal populations in the aging human brain. In Parkinson's disease (PD), the most common neurodegenerative movement disorder, the accelerated loss of DA neurons leads to a progressive and irreversible decline in locomotor function. In addition to age and exposure to environmental toxins, loss of DA neurons is exacerbated by specific mutations in the coding or promoter regions of several genes. The identification of such PD-associated alleles provides the experimental basis for the use of Drosophila as a model to study neurodegeneration of DA neurons in vivo. For example, the expression of the PD-linked human &alpha;-synuclein gene in Drosophila DA neurons recapitulates some features of the human disease, e.g. progressive loss of DA neurons and declining locomotor function 2. Accordingly, this model has been successfully used to identify potential therapeutic targets in PD 8.
Here we describe two assays that have commonly been used to study age-dependent neurodegeneration of DA neurons in Drosophila: a climbing assay based on the startle-induced negative geotaxis response and tyrosine hydroxylase immunostaining of whole adult brain mounts to monitor the number of DA neurons at different ages. In both cases, in vivo expression of UAS transgenes specifically in DA neurons can be achieved by using a tyrosine hydroxylase (TH) promoter-Gal4 driver line 3, 10.

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Here we describe two assays that have been established to study age-dependent neurodegeneration of dopaminergic (DA) neurons in Drosophila: the climbing/startle-induced negative geotaxis assay which allows to study the functional effects of DA neurons degeneration and the tyrosine hydroxylase immunostaining which is used to identify and count DA neurons in whole brain mounts.

تقييم الظواهر الاعصاب في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الخلايا العصبية الدوبامين عن طريق تسلق فحوصات والجامعة المناعية الدماغ

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila

Drosophila melanogaster is an ideal model organism for studying various diseases due to its abundance of advanced genetic manipulation techniques and diverse behavioral features. Identifying behavioral deficiency in animal models is a crucial measure of disease severity, for example, in neurodegenerative diseases where patients often experience impairments in motor function. However, with the availability of various systems to track and assess motor deficits in fly models, such as drug-treated or transgenic individuals, an economical and user-friendly system for precise evaluation from multiple angles is still lacking. A method based on the AnimalTracker application programming interface (API) is developed here, which is compatible with the Fiji image processing program, to systematically evaluate the movement activities of both adult and larval individuals from recorded video, thus allowing for the analysis of their tracking behavior. This method requires only a high-definition camera and a computer peripheral hardware integration to record and analyze behavior, making it an affordable and effective approach for screening fly models with transgenic or environmental behavioral deficiencies. Examples of behavioral tests using pharmacologically treated flies are given to show how the techniques can detect behavioral changes in both adult flies and larvae in a highly repeatable manner.

A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila

The present protocol assesses the locomotor activity of Drosophila by tracking and analyzing the movement of flies in a hand-made arena using open-source software Fiji, compatible with plugins to segment pixels of each frame based on high-definition video recording to calculate parameters of speed, distance, etc.

تقنية بسيطة لفحص النشاط الحركي في ذبابة الفاكهة

Drosophila melanogaster is an ideal model organism for studying various diseases due to its abundance of advanced genetic manipulation techniques and ...

Behavior

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health worldwide. Although mammalian models have provided important insights into the underlying mechanisms of pathogenicity, the complexity of mammalian systems together with their high costs are limiting their use. Therefore, the simple but well-established Drosophila model-system&#160;provides an alternative for investigating the molecular pathways that are affected in these diseases. Besides behavioral deficits, neurodegenerative diseases are characterized by histological phenotypes such as neuronal death and axonopathy. To quantify neuronal degeneration and to determine how it is affected by genetic and environmental factors, we use a histological approach that is based on measuring the vacuoles in adult fly brains. To minimize the effects of systematic error and to directly compare sections from control and experimental flies in one preparation, we use the &#39;collar&#39; method for paraffin sections. Neurodegeneration is then assessed by measuring the size and/or number of vacuoles that have developed in the fly brain. This can either be done by focusing on a specific region of interest or by analyzing the entire brain by obtaining serial sections that span the complete head. Therefore, this method allows one to measure not only severe degeneration but also relatively mild phenotypes that are only detectable in a few sections, as occurs during normal aging.

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Drosophila is widely used as a model system to study neurodegeneration. This protocol describes a method by which degeneration, as determined by vacuole formation in the brain, can be quantified. It also minimizes effects due to the experimental procedure by processing and sectioning control and experimental flies as one sample.

كتلة الأنسجة لتحديد تنكس عصبي في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health ...

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal dysfunction and loss. Fluorescence-based imaging tools and technologies enable unprecedented analysis of subcellular neurobiological processes, yet there is still a need for unbiased, reproducible, and accessible approaches for extracting quantifiable data from imaging studies. We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-based imaging studies using Drosophila models of neurodegeneration. Specifically, we describe an easy-to-follow, semi-automated approach using Fiji/ImageJ to analyze two cellular processes: first, we quantify protein aggregate content and profile in the Drosophila optic lobe using fluorescent-tagged mutant huntingtin proteins; and second, we assess autophagy-lysosome flux in the Drosophila visual system with ratiometric-based quantification of a tandem fluorescent reporter of autophagy. Importantly, the protocol outlined here includes a semi-automated segmentation step to ensure all fluorescent structures are analyzed to minimize selection bias and to increase resolution of subtle comparisons. This approach can be extended for the analysis of other cell biological structures and processes implicated in neurodegeneration, such as proteinaceous puncta (stress granules and synaptic complexes), as well as membrane-bound compartments (mitochondria and membrane trafficking vesicles). This method provides a standardized, yet adaptable reference point for image analysis and quantification, and could facilitate reliability and reproducibility across the field, and ultimately enhance mechanistic understanding of neurodegeneration.

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-imaging-based cell biological studies of protein aggregation and autophagic flux in the central nervous system of Drosophila models of neurodegeneration.

بيولوجيا الخلية كمية من نيوروديجينيريشن في المورفولوجية من خلال تحليل غير منحازة للبروتينات فلوريسسينتلي المعلمة باستخدام إيماجيج

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...

Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy

Amyotrophic lateral sclerosis is a neurodegenerative disorder causing progressive muscle weakness and death within 2-5 years following diagnosis. Clinical manifestations include weight loss, dyslipidemia, and hypermetabolism; however, it remains unclear how these relate to motor neuron degeneration. Using a Drosophila model of TDP-43 proteinopathy that recapitulates several features of ALS including cytoplasmic inclusions, locomotor dysfunction, and reduced lifespan, we recently identified broad ranging metabolic deficits. Among these, glycolysis was found to be upregulated and genetic interaction experiments provided evidence for a compensatory neuroprotective mechanism. Indeed, despite upregulation of phosphofructokinase, the rate limiting enzyme in glycolysis, an increase in glycolysis using dietary and genetic manipulations was shown to mitigate locomotor dysfunction and increased lifespan in fly models of TDP-43 proteinopathy. To further investigate the effect on TDP-43 proteinopathy on glycolytic flux in motor neurons, a previously reported genetically encoded, FRET-based sensor, FLII12Pglu-700&#181;&#948;6, was used. This sensor is comprised of a bacterial glucose-sensing domain and cyan and yellow fluorescent proteins as the FRET pair. Upon glucose binding, the sensor undergoes a conformational change allowing FRET to occur. Using FLII12Pglu-700&#181;&#948;6, glucose uptake was found to be significantly increased in motor neurons expressing TDP-43G298S, an ALS causing variant. Here, we show how to measure glucose uptake, ex vivo, in larval ventral nerve cord preparations expressing the glucose sensor FLII12Pglu-700&#181;&#948;6 in the context of TDP-43 proteinopathy. This approach can be used to measure glucose uptake and assess glycolytic flux in different cell types or in the context of various mutations causing ALS and related neurodegenerative disorders.

Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy

Glucose uptake is increased in Drosophila motor neurons affected by TAR DNA binding protein (TDP-43) proteinopathy, as indicated by a FRET-based, genetically encoded glucose sensor.

قياس امتصاص الجلوكوز في نماذج Drosophila من اعتلال البروتين TDP-43

Amyotrophic lateral sclerosis is a neurodegenerative disorder causing progressive muscle weakness and death within 2-5 years following diagnosis. Clinical ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer&#8217;s disease (AD), Parkinson&#8217;s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

التحقيق في نشر وسمية البروتينات مثل بريون باستخدام Metazoan نموذج حي<em&gt; C. ايليجانس</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

Biology

مراقبة أحداث الصرع في ذبابة الفاكهة عن طريق تصوير الكالسيوم

Ex Vivo Calcium Imaging for Drosophila Model of Epilepsy

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals worldwide. Despite the clinical importance of epilepsy, the functional analysis of neural activity in the central nervous system is still to be developed. Recent advancements in imaging technology, in combination with stable expression of genetically encoded calcium indicators, such as GCaMP6, have revolutionized the study of epilepsy at both brain-wide and single-cell resolution levels. Drosophila melanogaster has emerged as a tool for investigating the molecular and cellular mechanisms underlying epilepsy due to its sophisticated molecular genetics and behavioral assays. In this study, we present a novel and efficient protocol for ex vivo calcium imaging in GCaMP6-expressing adult Drosophila to monitor epileptiform activities. The whole brain is prepared from cac, a well-known epilepsy gene, knockdown flies for calcium imaging with a confocal microscope to identify the neural activity as a follow-up to the bang-sensitive seizure-like behavior assay. The cac knockdown flies showed a higher rate of seizure-like behavior and abnormal calcium activities, including more large spikes and fewer small spikes than wild-type flies. The calcium activities were correlated to seizure-like behavior. This methodology serves as an efficient methodology in screening the pathogenic genes for epilepsy and exploring the potential mechanism of epilepsy at the cellular level.

تسليط الضوء على المؤلف: نظرة ثاقبة على تقنيات ونتائج التطورات الحديثة في أبحاث الصرع 

Here, we present a protocol for ex vivo calcium imaging in GCaMP6-expressing adult Drosophila to monitor epileptiform activities. The protocol provides a valuable tool for investigating ictal events in adult Drosophila through ex vivo calcium imaging, allowing for exploration of the potential mechanisms of epilepsy at the cellular levels.

إكس فيفو تصوير الكالسيوم لنموذج ذبابة الفاكهة للصرع

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals ...

رصد خلية إلى انتقال بروتين بريون مثل المجاميع في Melanogaster المورفولوجية

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

رصد خلايا المناعة الاتجار نيون بريون قضبان وبعد ساعات من العدوى داخل الصفاق

تقييم الظواهر الاعصاب في

تقنية بسيطة لفحص النشاط الحركي في ذبابة الفاكهة

كتلة الأنسجة لتحديد تنكس عصبي في

بيولوجيا الخلية كمية من نيوروديجينيريشن في المورفولوجية من خلال تحليل غير منحازة للبروتينات فلوريسسينتلي المعلمة باستخدام إيماجيج

قياس امتصاص الجلوكوز في نماذج Drosophila من اعتلال البروتين TDP-43

التحقيق في نشر وسمية البروتينات مثل بريون باستخدام Metazoan نموذج حي

إكس فيفو تصوير الكالسيوم لنموذج ذبابة الفاكهة للصرع

إكس فيفو تصوير الكالسيوم لنموذج ذبابة الفاكهة للصرع

إكس فيفو تصوير الكالسيوم لنموذج ذبابة الفاكهة للصرع