ونشكر أعضاء المختبر هوس لتقديم المشورة والمساعدة. تدعمها الولايات المتحدة المعاهد الوطنية للصحة (R01-AI087644 إلى M.H.) و P30-CA008748 إلى مركز سلون كيترينج التذكاري للسرطان.

1-إعداد الأسطح الزجاجية تنشيطية
<ol><li>معطف ثمانية آبار في غرف كوفيرجلاس مع بيوتينيلاتيد بولي-L-يسين (بيو-PLL) المخفف 1: 500 في الماء المقطر، منزوع (ddH2س). احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).</li>
	<li>يغسل مع H2o.</li>
	<li>الجاف ح 2 في الرايت</li>
	<li>الكتلة الأحيائية-PLL مغلفة الأسطح مع حظر المخزن المؤقت (حبيس مخزنة المالحة [10 ملم حبيس الأس الهيدروجيني 7.4، 150 مم كلوريد الصوديوم]، مع جيش صرب البوسنة 2 ٪) لمدة 30 دقيقة في الرايت<ol>
<li>حل 5 ملغ هيدروبروميد بولي-L-يسين في 1 مل 10 مم نابو4pH 8.5.</li>
		<li>إضافة μmol 125 (0.55 ملليغرام) من دائرة الصحة الوطنية--البيوتين (من أصل 100 مغ/مل في [دمس]) والتحقق من الرقم الهيدروجيني لرد الفعل. إذا كان الرقم الهيدروجيني أقل من 8.5، إضافة 2 ميكروليتر من هيدروكسيد الصوديوم N 4 لرفعه إلى بين 8.5 و 9.5 درجة الحموضة.</li>
		<li>دوامة لمدة 30 دقيقة.</li>
		<li>إخماد رد فعل مع 50 ميكروليتر من 100 مم جليكاين حله في 20 مم تريس pH 8.0.</li>
		<li>وتدور في السلطة الكاملة لمدة 10 دقائق بنقل المادة طافية إلى أنبوب جديد. ملاحظة: نوعية بيو-PLL هو عادة بالمقارنة مع الأعمال التحضيرية السابقة بطلاء المسلسل شقين تخفيف المواد على صفيحة أليسا 96-جيدا والتحديد الكمي لمحتوى البيوتين بعد الحضانة مع الفوسفاتيز القلوية إلى جانب ستريبتافيدين.</li>
	</ol>
</li>
	<li>إزالة حجب المخزن المؤقت. لا تسمح الآبار الجافة. إضافة ستريبتافيدين (100 ميكروغرام/مل في المخزن المؤقت لحظر). احتضانها ح 1 في 4 درجات مئوية.</li>
	<li>تغسل في ميزانيات. ملء وعكس آبار دائرة الشريحة 4-5 مرات، إزالة HBS من الآبار. لا تسمح الآبار الجافة.</li>
	<li>إضافة يغاندس بيوتينيلاتيد الرهن العقاري وجزيئات الالتصاق إلى السطح. ملاحظة: لجنة التنسيق الإداري والبويضات يمكن أن فوتوكاجيد عن طريق إضافة اورثو نيتروبينزيل على أساس حماية المجموعات (مثلاً، نيتروفينيليثيل (NPE) أو نيتروفيراتريلوكسيكاربونيل (نفوك)) إلى مجموعة اليورو الأمينية الأساسية ليسينيس (K12 في لجنة التنسيق الإداري، K7 في البويضات). يمكن الحصول على فوتوكاجيد لجنة التنسيق الإداري والبويضات من الموردين التجاريين. بعد إعادة تشكيل في المخزن المؤقت مائي، هي ريفولديد إلى البكتريا أعرب-هك و H2-كب استخدام النهج المتبعة11،12.</li>
	<li>التحقق من صحة ببتيد لجنة التنسيق الإداري أو البويضات فوتواكتيفاتابل<ol>
<li>ديكاجي الببتيدات محمية نفوك من الأشعة فوق البنفسجية الإشعاعية بيده مصباح الأشعة فوق البنفسجية (انظر الجدول للمواد) لمدة 20 دقيقة في الرايت</li>
		<li>نبض 1.0 × 105 ناقلات الجنود المدرعة مع 1 ميكرومتر من الببتيد نونستيمولاتوري (السلبية التحكم، مثل خضاب الدم)، الإشعاع الببتيد فوتواكتيفاتابل، الببتيد فوتواكتيفاتابل المشع، ومؤثر الببتيد (مراقبة إيجابية، مثللجنة التنسيق الإداري) ل 1 (ح) بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.</li>
		<li>لتحفيز خلايا تي معربا عن 5 جيم. C7/2B4/وتكر، استخدام الخلايا CH12 أو ب CH27. لتحفيز خلايا تي OT1، استخدم الجيش الملكي المغربي-s أو خلايا thymoma EL4.</li>
		<li>مزيج المصفحتين نابض بعدد متساو من خلايا تي في 96-جيدا جولة أسفل لوحات في وحدة تخزين نهائي 200 ميليلتر. احتضانها في 37 درجة مئوية ح 12-24.</li>
		<li>استرداد سوبيرناتانتس من كل بئر وتحليل إيل-2 قبل أليسا مع ستريبتافيدين-الفجل البيروكسيديز كشف اللونية. ملاحظة: تأكيدا لحالة كاجينج من الببتيدات جميع من اليكتروسبراي الكتلي قبل ريفولدينج إلى مجمعات MHC، ينصح بشدة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>أداء قابلة للطي وتنقية MHC لتقليل التعرض للضوء. على سبيل المثال، التفاف للطي ردود الفعل في رقائق الألومنيوم والاضطلاع بهلام الترشيح اللوني مع مصباح الأشعة فوق البنفسجية قبالة. ملاحظة: لقد وجدت أن فوتواكتيفاتابل لجنة التنسيق الإداري هك والبويضات-H2 كب الحث على الأشعة فوق البنفسجية مستقلة تي خلية التنشيط في كثافة عالية، ربما بسبب حبس الوظيفية غير مكتملة. ومن ثم فهو المخفف الرهن فوتواكتيفاتابل إلى 10-30 العاشر الزائدة للرهن العقاري نونستيمولاتوري (مثلاً -هك المحتوية على الببتيد64-76 الهيموغلوبين (Hb)) أثناء الخطوة التثبيت. وهذا يعزز إشارة إلى نسبة الضوضاء من تجربة التصوير اللاحقة.</li>
	<li>أن فوتواكتيفاتي CD4+ تي الخلايا، جماعياً استخدام خليط من بيوتينيلاتيد هب هك (3 ميكروغرام/مل)، بيوتينيلاتيد فوتواكتيفاتابل لجنة التنسيق الإداري هك (0.1 ميكروغرام/مل)، وجسم بيوتينيلاتيد ضد الفئة أنا MHC H2-كك (0.5 ميكروغرام/ مل)-الأجسام المضادة-H2 كك تشجع جيم 5 الخلايا C7/2B4/وترينيداد، التي تعبر عن H2-كك، ينتشر على سطح الزجاج دون إخضاعها للتنشيط.</li>
	<li>ل CD8+ تي الخلايا، استخدام خليط بيوتينيلاتيد H2-دب تحمل الببتيد كافيدفاتل (1 ميكروغرام/مل)، بيوتينيلاتيد فوتواكتيفاتابل البويضات-H2 كب (0.1 ميكروغرام/مل)، والمجال خارج الخلية للجزيء الالتصاق المتكاملة-1 (2 ميكروغرام/مل تنتجها خلايا الحشرات الثقافة13). المتكاملة-1 تشجع تكوين الاتصال الوثيق بإشراك إنتغرين LFA1 على سطح الخلية T.</li>
	<li>تطبيق جميع المخاليط البروتين في المخزن المؤقت لحظر، تليها الحضانة ح 1 في الرايت أو على الأقل 2 ح في 4 درجات مئوية. ملاحظة: الكثافة الجزيئية على الأسطح من هذا النوع أن تكون ~ 8000 كل ميكرومتر2 قد سبق تحديدها6. نظراً لأن يمثل الرهن فوتواكتيفاتابل ~1/30 ستكونال من البروتين بيوتينيلاتيد على السطح، وكثافته ~ 267 الجزيئات الواحدة ميكرومتر2، قبل ديكاجينج.</li>
	<li>أغسل كما في الخطوة 1، 6 وترك في ميزانيات حتى جاهزة للاستخدام.</li>
	<li>إضافة 200,000 CD4+ أو CD8+ تي الخلايا معربا عن تكر المناسبة في كل بئر وتسمح للخلايا الانضمام في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد إرفاق الخلايا وتنتشر على السطح، أنهم على استعداد فوتواكتيفيشن والتصوير. ملاحظة: يرد توصيل الفيروسات التراجعية خلايا المستجيب تي مع الفلورسنت التصوير المسابير في التفصيل elswhere6،7. إشارات الكالسيوم يمكن أيضا دراسة استخدام الخلايا T أونترانسدوسيد محملة بالصبغة الحساسة الكالسيوم فلوو-46. صبغة راتيوميتريك Fura-2 غير مستحسن لأنه يتطلب الإثارة في نطاق الأشعة فوق البنفسجية، الذي يدفع أيضا ديكاجينج للرهن العقاري فوتواكتيفاتابل.</li>
</ol>2. الحصول على الصور
<ol><li>استخدام مجهر TIRF مقلوب تجهيزه بعدسة هدف العاشر الأشعة فوق البنفسجية 150 متوافق للحصول على الصور. الأشعة فوق البنفسجية تشعيع المناطق المعرفة من قبل المستخدم باستخدام نظام الحجاب حاجز رقمي يعلق على مصباح الزئبق W 100 (HBO). توجيه ضوء من هذا المصباح على العينة باستخدام مرآة طويلة تمرير 400 نانومتر الأشعة فوق البنفسجية.</li>
	<li>استخدام برمجيات تحليل الصورة فوتواكتيفيشن المترجمة واكتساب الوقت الفاصل. في معظم التجارب، رصد تحقيقات في قنوات الأخضر والأحمر استخدام 488 شمال البحر الأبيض المتوسط وشمال البحر الأبيض المتوسط 561 الإثارة الليزر، على التوالي. يتم توجيه ضوء الليزر على العينة باستخدام مرآة مزدوج اللون مزدوج-ممر الموجه الذي ينقل أيضا في نطاق الأشعة فوق البنفسجية (لتمكين ديكاجينج). يرجى الاطلاع على الجدول للمواد و الشكل 6 للحصول على معلومات إضافية حول تكوين المجهر.</li>
	<li>بعد تركيب الشريحة دائرة تحتوي على خلايا T، ضبط الإعدادات للحصول على الإضاءة TIRF أو ابيفلوريسسينسي، حسب الاقتضاء. في طريقة العيش، حدد حقل للخلايا التي تعرب عن probe(s) الفلورية ذات الاهتمام. إنشاء مناطق ميكرون-مقياس فوتواكتيفيشن تحت الخلايا الفردية باستخدام التحكم في البرنامج.</li>
	<li>يبدأ اكتساب الوقت الفاصل. عادة، يتم الحصول على تيميبوينتس 80، مع فاصل زمني 5 s بين كل نقطة من الزمن. وهذا يترك أكثر من ما يكفي من الوقت لمتسلسلة 488 نانومتر و 563 التعرض شمال البحر الأبيض المتوسط، وفي حالة تجارب اللون المزدوج.</li>
	<li>بعد 10 تيميبوينتس، فوتواكتيفاتي المناطق المحددة عن طريق فتح الحجاب الحاجز الرقمي مصراع ل s 1-1.5.</li>
	<li>بعد الانتهاء من الفاصل الزمني، حدد حقل جديد من الخلايا وتكرار هذه العملية.</li>
</ol>3-بيانات التحليل
ملاحظة: فوتواكتيفيشن مترجمة من يغاندس المعطل تداولها إنشاء منطقة تنشيطية ثابتة واضحة المعالم، والتي يمكن استخدامها لتحليل كمي ليشير إلى الاستجابات والأحداث يعيد cytoskeletal. تحليل البروتوكولات وعادة ما تشمل قياس كثافة الأسفار داخل منطقة المشع أو استخدام منطقة المشع كنقطة نهاية موضعية لقياسات المسافة (مثلاً. لتقييم استقطاب سينتروسومي إلى المنطقة المشع). يرد أدناه وصف كلا البروتوكولين التحليل. يمكن استخدام مختلف برامج تحليل الصور التفاعلية لجعل كثافة وقياسات المسافة، ثم يمكن أن يكون الإخراج لمعالجة إضافية وتحليلها.
<ol><li>
كثافة الأسفار
	<ol>
<li>تحديد كثافة الفلورية (وأي فأي) من المنطقة الخلفية خارج الخلية (وأي فأيب). سيتم استخدام هذا لتصحيح معلومات أساسية.<ol>
<li>رسم منطقة مربعة ميكرون الحجم خارج الخلية وتجعل قناع. لتحديد شدة الأسفار، انقر فوق تحليل | قناع الإحصاءات. حدد يعني كثافة الأسفار وتصدير القيم. ملاحظة: تشير التفاصيل الإجرائية (مثل 3.1.1.1) لبرنامج سليديبوك (انظر الجدول للمواد). تنفيذ هذا البروتوكول باستخدام حزم البرامج الأخرى (على سبيل المثال-، فيجي) ستكون مختلفة قليلاً.</li>
		</ol>
</li>
		<li>تحديد أي داخل منطقة فوتواكتيفاتيد لكل نقطة في الوقت.<ol>
<li>حدد قناع لتسليط الضوء على المنطقة التي كان فوتواكتيفاتيد. لتحديد شدة الأسفار، انقر فوق تحليل | قناع الإحصاءات. حدد يعني كثافة الأسفار وتصدير القيم.</li>
		</ol>
</li>
		<li>قم بطرح الخلفية وأي فأي من القيم وأي فأي قياس داخل المنطقة. ثم تطبيع القياسات فأي تصحيح بقسمة المتوسط، خلفية تصحيح أي الإطارات 9 أولاً قبل فوتواكتيفيشن. ΔF/F = ((FI-FIb)/mean(FI1-9)--وأي فأيب)). ملاحظة: الرسم البياني ΔF/و كدالة للزمن.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
المسافة
	<ol>
<li>الحصول على x و y إحداثيات مركز منطقة فوتواكتيفاتيد.<ol>
<li>لتحديد x و y إحداثيات مركز منطقة فوتواكتيفاتيد، حدد قناع لتسليط الضوء على المنطقة التي كان فوتواكتيفاتيد. حالما يتم تسليط الضوء على منطقة فوتواكتيفيشن، حدد تحليل | قناع الإحصاءات | مركز منطقة وتصدير القيم.</li>
		</ol>
</li>
		<li>تحديد x و y الإحداثيات لمسبار الفلورسنت من الفائدة لكل نقطة في الوقت. ويتحقق ذلك عادة عن طريق الجسيمات اليدوية أو الآلية التي تتبع.<ol>
<li>لتحديد x و y الإحداثيات لمسبار الفلورسنت ذات الاهتمام، حدد دليل الجسيمات تتبع ثم انقر فوق المسبار الفلورسنت من الاهتمام على مر الزمن. مرة واحدة وقد تم تعقب جميع النقاط الزمنية، حدد تحليل | قناع الإحصاءات | مركز منطقة وتصدير القيم.</li>
		</ol>
</li>
		<li>حساب المسافة بين بروتين فلوري الاهتمام ومركز منطقة فوتواكتيفاتيد لكل مرة استخدام المعادلة: المسافة = √ ((س2-س1)2+ (ص2-ص1)2)، ×2 و y2 بإحداثيات البروتين الفلورسنت ل الفائدة و x1 وص1 هي إحداثيات مركز منطقة فوتواكتيفاتيد.</li>
		<li>الرسم البياني المسافة كدالة للزمن.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dustin, M. L., Chakraborty, A. K., Shaw, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+structure+and+function+of+the+immunological+synapse.">Understanding the structure and function of the immunological synapse.</a> Cold Spring Harb.Perspect.Biol. 2, a002311 (2010).</li><li>Liu, X., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+Synapse+Formation:+Cell+Polarity+During+T+Cell-APC+Interaction.">Immunological Synapse Formation: Cell Polarity During T Cell-APC Interaction.</a> Cell Polarity 1. , 247-275 (2015).</li><li>Bunnell, S. C., Kapoor, V., Trible, R. P., Zhang, W., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+actin+polymerization+drives+T+cell+receptor-induced+spreading:+A+role+for+the+signal+transduction+adaptor+LAT.">Dynamic actin polymerization drives T cell receptor-induced spreading: A role for the signal transduction adaptor LAT.</a> Immunity. 14, 315-329 (2001).</li><li>Dustin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+Function+of+the+Immunological+Synapse+from+Studies+with+Supported+Planar+Bilayers.">Insights into Function of the Immunological Synapse from Studies with Supported Planar Bilayers.</a> Current topics in microbiology and immunology. 340, (2010).</li><li>Chauveau, A., Le Floc'h, A., Bantilan, N. S., Koretzky, G. a., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diacylglycerol+kinase+&#945;+establishes+T+cell+polarity+by+shaping+diacylglycerol+accumulation+at+the+immunological+synapse.">Diacylglycerol kinase &#945; establishes T cell polarity by shaping diacylglycerol accumulation at the immunological synapse.</a> Sci. Signal. 7, ra82 (2014).</li><li>Huse, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+Temporal+Dynamics+of+T+Cell+Receptor+Signaling+with+a+Photoactivatable+Agonist.">Spatial and Temporal Dynamics of T Cell Receptor Signaling with a Photoactivatable Agonist.</a> Immunity. 27, 76-88 (2007).</li><li>Quann, E. J., Merino, E., Furuta, T., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+diacylglycerol+drives+the+polarization+of+the+microtubule-organizing+center+in+T+cells.">Localized diacylglycerol drives the polarization of the microtubule-organizing center in T cells.</a> Nat Immunol. 10, 627-635 (2009).</li><li>Basu, R., Chen, Y., Quann, E. J., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+variable+hinge+region+of+novel+PKCs+determines+localization+to+distinct+regions+of+the+immunological+synapse.">The variable hinge region of novel PKCs determines localization to distinct regions of the immunological synapse.</a> PLoS One. 9, 1-8 (2014).</li><li>Liu, X., Kapoor, T. M., Chen, J. K., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diacylglycerol+promotes+centrosome+polarization+in+T+cells+via+reciprocal+localization+of+dynein+and+myosin+II.">Diacylglycerol promotes centrosome polarization in T cells via reciprocal localization of dynein and myosin II.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 11976-11981 (2013).</li><li>Quann, E. J., Liu, X., Altan-Bonnet, G., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cascade+of+protein+kinase+C+isozymes+promotes+cytoskeletal+polarization+in+T+cells.">A cascade of protein kinase C isozymes promotes cytoskeletal polarization in T cells.</a> Nat. Immunol. 12, 647-654 (2011).</li><li>Boniface, J. J., Reich, Z., Lyons, D. S., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamics+of+T+cell+receptor+binding+to+peptide-MHC:+evidence+for+a+general+mechanism+of+molecular+scanning.">Thermodynamics of T cell receptor binding to peptide-MHC: evidence for a general mechanism of molecular scanning.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 11446-11451 (1999).</li><li>Garboczi, D. N., Hung, D. T., Wiley, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA-A2-peptide+complexes:+refolding+and+crystallization+of+molecules+expressed+in+Escherichia+coli+and+complexed+with+single+antigenic+peptides.">HLA-A2-peptide complexes: refolding and crystallization of molecules expressed in Escherichia coli and complexed with single antigenic peptides.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 3429-3433 (1992).</li><li>Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+use+two+directionally+distinct+pathways+for+cytokine+secretion.">T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion.</a> Nat. Immunol. 7, 247-255 (2006).</li><li>Abeyweera, T. P., Merino, E., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+signaling+blocks+activating+receptor+clustering+and+induces+cytoskeletal+retraction+in+natural+killer+cells.">Inhibitory signaling blocks activating receptor clustering and induces cytoskeletal retraction in natural killer cells.</a> J. Cell Biol. 192, 675-690 (2011).</li><li>Nguyen Duc, T., Huse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Generalizable+Platform+for+the+Photoactivation+of+Cell+Surface+Receptors.">A Generalizable Platform for the Photoactivation of Cell Surface Receptors.</a> ACS Chem. Biol. 10, 2435-2440 (2015).</li><li>Airan, R. D., Thompson, K. R., Fenno, L. E., Bernstein, H., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+precise+in+vivo+control+of+intracellular+signalling.">Temporally precise in vivo control of intracellular signalling.</a> Nature. 458, 1025-1029 (2009).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+chemokine+receptor+signal+and+T-cell+migration.">Optogenetic control of chemokine receptor signal and T-cell migration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 111, 6371-6376 (2014).</li><li>Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+cell+signalling+using+a+light-switchable+protein+interaction.">Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction.</a> Nature. 461, 997-1001 (2009).</li><li>Guntas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+an+improved+light-induced+dimer+(iLID)+for+controlling+the+localization+and+activity+of+signaling+proteins.">Engineering an improved light-induced dimer (iLID) for controlling the localization and activity of signaling proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 112-117 (2015).</li><li>Wu, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+photoactivatable+Rac+controls+the+motility+of+living+cells.">A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells.</a> Nature. 461, 104-108 (2009).</li><li>Pathak, G. P., Vrana, J. D., Tucker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+cell+function+using+engineered+photoreceptors.">Optogenetic control of cell function using engineered photoreceptors.</a> Biol. cell/under auspices Eur. Cell Biol. Organ. 105, 59-72 (2014).</li><li>Grusch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporally+precise+activation+of+engineered+receptor+tyrosine+kinases+by+light.">Spatio-temporally precise activation of engineered receptor tyrosine kinases by light.</a> EMBO J. 33, 1713-1726 (2014).</li><li>Yi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+repositioning+in+T+cells+is+biphasic+and+driven+by+microtubule+end-on+capture-shrinkage.">Centrosome repositioning in T cells is biphasic and driven by microtubule end-on capture-shrinkage.</a> J. Cell Biol. 202, 779-792 (2013).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

وفي السنوات الأخيرة، برز الضوء كأداة ممتازة للتنشيط التي تسيطر عليها سباتيوتيمبورالي من العمليات الخلوية. قد وضعت منهجيات مختلفة، مع كل المزايا المرتبطة بها وعيوب. النظام المذكور هنا، الذي يستند إلى ديكاجينج يغاندس المعطل تداولها، خارج الخلية، مثاليا لتحليل استجابات إرسال الإشارات الس...

تي اللمفاويات (الخلايا T) تلعب دوراً مركزياً في مناعة خلوية بالاعتراف بمولده الببتيدات المعروضة في سياق سطح الخلية MHC. مستضد الاعتراف، الذي هو توسط تكر، محركات التفريق بين السذاجة تي الخلايا ويعزز تقديم استجابات السكان المستجيب عن والتواصل. مشاركة تكر يستحث أيضا تغييرات جذرية في البنية الخلوية. في غضون دقائق، جلومس الخلايا T إلى الجانب من الخلية عرض مستضد (APC)، تشكل واجهة استقطاب المعروفة باسم المشبك المناعية (ق. أ)1،2. هو يقوي التي تعالج ردود الخلية T المستجيب بتمكين الإفراج عن الاتجاه السيتوكينات، أو في حالة اللمفاويات T السامة للخلايا (CTLs)، البروتينات الحال التي تدمر APC.
مشاركة تكر بالرهن العقاري يدفع الفسفرة السريع متعددة الجزيئات محول المتلقين للمعلومات، بما في ذلك رابط "تنشيط تي" الخلايا (LAT)، الذي يعزز في نهاية المطاف إعادة عرض قوي cytoskeleton متشابك2. أكتين الخيطية القشرية (F-أكتين) محركات الأقراص خلية T تنتشر فوق سطح آسيا والمحيط الهادئ، وثم يحل في بنية حلقية تتميز بتراكم واكتين في محيط هو واستنفاد من المركز. أحكام يقترن تشكيل عصابة واكتين لإعادة توجيه مركز تنظيم microtubule (بعد، كما دعا سينتروسومي في خلايا تي) إلى موضع تحت مركز الواجهة فقط. كل الأحداث تحدث في غضون دقائق اعتراف مستضد الأولية وإنشاء السياق المعماري المستجيب وأحداث التنشيط اللاحقة التي تحدث استجابات.
دراسة تشكيل هو، طورت مختبرات مختلف النهج الذي يتم استبداله في آسيا والمحيط الهادئ على سطح زجاج الذي يحتوي على يغاندس تكر المعطل تداولها أو يدعم دهن بلير نفسه يحتوي على3،يغاندس4. وتشكل الخلايا T هو مثل جهات الاتصال على هذه الأسطح التي يمكن تصويرها بالتأمل الداخلي الإجمالي fluorescence المجهر (TIRF) أو [كنفوكل] مجهرية، تمكين الدراسات ذات الدقة العالية من أوائل تي خلية التنشيط وهو تشكيل.
على الرغم من أن هذه النهج قد سمحت لرؤية ممتازة من هو مجمع بشكل كامل، تحدث الكثير من ربط TCR:pMHC إرسال الإشارات التالية في غضون ثوان، إلى تعقيد الجهود الرامية إلى تحديد تسلسل الأحداث بعد التنشيط تكر بدقة . للالتفاف حول هذه المسألة، وضعت نهجاً فوتواكتيفيشن، التي يستخدم فيها فوتواكتيفاتابل الرهن العقاري لتحقيق الرقابة الزمانية المكانية تكر التنشيط5،،من67. في هذا النظام، يتم إرفاق الخلايا T بالواجهات الزجاجية التي تحتوي على الرهن العقاري فوتواكتيفاتابل التي غير محفزة تكر حتى المشع مع الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية). يزيل إشعاع الأشعة فوق البنفسجية لمنطقة ميكرون الحجم من السطح أسفل الخلية T فوتوكاجي إنشاء منطقة تنشيطية يمكن التعرف عليه بواسطة الخلية T. ثم يتم رصد الأحداث إرسال الإشارات اللاحقة وإعادة عرض cytoskeletal الصحفيين الفلورسنت وراثيا المشفرة باستخدام. فوتواكتيفاتابل إصدارين من الببتيدات المستضديه، العثة السيتوكروم ج88-103 (MCC) و ovalbumin257-264 (OVA)، التي ترد في سياق الطبقة MHC ثانيا-هك والفئة الأول MHC H2-كب، على التوالي، وقد تم البلدان المتقدمة النمو (الشكل 1). وهذا يتيح تحليل CD4 كلا+ تي الخلايا المحددة للتنسيق الإداري هك (التعبير عن جيم 5 C7، 2B4، أو تكرس) و CD8+ تي الخلايا المحددة للبويضات-H2 كب (الإعراب عن تكر OT1).
على مدى العقد الماضي، قد استخدم نهج فوتواكتيفيشن وتصوير تكر إنشاء حركية دقيقة من أوائل تكر مما يشير إلى الخطوات وأيضا لتحديد المسارات الجزيئية تحكم الاستقطاب يعيد سيتوسكيليتال5، 6 , 7 , 8 , 9 , 10. على سبيل المثال، المقايسة كان مفيداً في تحديد تلك سينتروسومي إعادة توجيه نحو APC هو توسط تدرج مترجمة من diacylglycerol رسول الدهن الثانية تركزت في هو. ومن المتوقع أن تواصل هذه المنهجية أن تكون قيمة بالنسبة للتطبيقات التي تتطلب تحليل التصوير عالي الدقة للدالة T الخلية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1152">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass</td>
			<td style="width:211px;">Thermofischer Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">155361</td>
			<td style="width:443px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-L-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2636</td>
			<td>Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZ-Link NHS-Biotin</td>
			<td>Thermofischer Scientific</td>
			<td align="right">20217</td>
			<td>Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptavidin</td>
			<td style="width:211px;">Thermofischer Scientific</td>
			<td align="right">434301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BirA-500: BirA biotin-protein ligase standard reaction kit</td>
			<td>Avidity</td>
			<td>BirA500</td>
			<td>Will be used to biotinylate proteins</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Biotinylated Hb I-EK&#160;</td>
			<td style="width:211px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For protein folding, see reference 6. For biotinylation, use BirA kit</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Biotinylated NPE-MCC I-EK&#160;</td>
			<td>Anaspec</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) can be purchased from Anaspec</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Biotinylated &#945;H2-Kk antibody</td>
			<td style="width:211px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right">553591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Biotinylated NPE-OVA H2-Kb</td>
			<td style="width:211px;">Anaspec</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) can be purchased from Anaspec</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Biotinylated KAVY H2-Db&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Anaspec</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Custom synthesized protein (KAVYDFATL) can be purchased from Anaspec</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biotinylated ICAM1&#160;</td>
			<td style="width:211px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For protein folding, see reference in protocol. For biotinylation, use BirA kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Hand held UV lamp</td>
			<td style="width:211px;">UVP</td>
			<td style="width:119px;">UVGL-25</td>
			<td>Lamp is held &#60; 1 cm from the sample.&#160; 30 s of 365 light is sufficient for detectable decaging, 20 min for quantitative decaging.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Olympus IX-81 OMAC TIRF system.</td>
			<td style="width:211px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Additional information about the imaging system can be found in Figure 6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:379px;">Mosaic digital diaphragm</td>
			<td style="width:211px;">Andor</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:379px;">Slidebook software</td>
			<td style="width:211px;">Intelligent Imaging Innovations</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatial and temporal control of t cell activation using a photoactivatable agonist

اللمفاويات T الانخراط في إشارات سريعة، والاستقطاب، التي تحدث في غضون دقائق بعد التنشيط تكر. وهذا يدفع تشكيل المشبك المناعية، مفترق الطرق نمطية خلية-خلية ينظم تنشيط خلية تي وتوجه يستهدف استجابات المستجيب. دراسة هذه العمليات فعالة، نهج تصوير مصمم خصيصا لالتقاط استجابات سريعة والاستقطاب اللازمة. ويصف هذا البروتوكول مثل هذا نظام، الذي يستند فوتواكتيفاتابل ببتيد-رئيسية histocompatibility معقدة (الرهن العقاري) التي غير محفزة حتى أنه يتعرض للأشعة فوق البنفسجية. ديكاجينج المستهدفة من هذا الكاشف أثناء تجارب فيديوميكروسكوبي يتيح مراقبة دقيقة الزمانية المكانية للتنشيط تكر ورصد الاستجابات الخلوية اللاحقة بالتأمل الداخلي الإجمالي (TIRF) التصوير عالية الدقة. وهذا النهج أيضا متوافقة مع استراتيجيات اضطراب الوراثية والدوائية. وهذا يسمح للجمعية العامة من المعالم المسارات الجزيئية التي تربط تكر يشير إلى تشكيل هياكل cytoskeletal الاستقطاب التي تكمن وراء المشبك المناعية.

يسمح نهج فوتواكتيفيشن وتصوير للمراقبة وسهلة القياس الكمي للاستجابات الإشارات السريعة، والاستقطاب. لتوضيح قدراته، يرد هنا هو تجربة دراسة العلاقة الزمانية المكانية بين تراكم همرشولد المستحثة تكر وإعادة توجيه سينتروسومي. جيم 5 ريتروفيرالي كانت ترانسدوسيد الانفجارات الخ...

Watch this Scientific Journal Video about Spatial and Temporal Control of T Cell Activation Using a Photoactivatable Agonist at JoVE.com

Spatial and Temporal Control of T Cell Activation Using a Photoactivatable Agonist

السيطرة المكانية والزمانية لتنشيط الخلية تي استخدام مؤثر فوتواكتيفاتابل

ويصف هذا البروتوكول أسلوب المستندة إلى تصوير لتنشيط الخلايا اللمفية تي MHC الببتيد فوتواكتيفاتابل، مما يتيح مراقبة دقيقة الزمانية المكانية لتنشيط الخلية T باستخدام.

T lymphocytes engage in rapid, polarized signaling, occurring within minutes following TCR activation. This induces formation of the immunological ...

spatial-temporal-control-t-cell-activation-using-photoactivatable

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

6.2K Views.  Memorial Sloan-Kettering Cancer Center. ويصف هذا البروتوكول أسلوب المستندة إلى تصوير لتنشيط الخلايا اللمفية تي MHC الببتيد فوتواكتيفاتابل، مما يتيح مراقبة دقيقة الزمانية المكانية لتنشيط الخلية T باستخدام.

Video: Spatial and Temporal Control of T Cell Activation Using a Photoactivatable Agonist

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

تنبيغ من فيروسات تي خلية المستقبلات في الخلايا التائية ماوس

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

تحريض الطعم ضد المضيف المرض و<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; مراقبة الخلايا T باستخدام نموذج MHC المطابقة الفئران

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike classical T cells, NKT cells recognize lipid antigen in the context of CD1 molecules2. NKT cells express an invariant TCR&alpha; chain rearrangement: V&alpha;14J&alpha;18 in mice and V&alpha;24J&alpha;18 in humans, which is associated with V&beta; chains of limited diversity3-6, and are referred to as canonical or invariant NKT (iNKT) cells. Similar to conventional T cells, NKT cells develop from CD4-CD8- thymic precursor T cells following the appropriate signaling by CD1d 7. The potential to utilize NKT cells for therapeutic purposes has significantly increased with the ability to stimulate and expand human NKT cells with &alpha;-Galactosylceramide (&alpha;-GalCer) and a variety of cytokines8. Importantly, these cells retained their original phenotype, secreted cytokines, and displayed cytotoxic function against tumor cell lines. Thus, ex vivo expanded NKT cells remain functional and can be used for adoptive immunotherapy. However, NKT cell based-immunotherapy has been limited by the use of autologous antigen presenting cells and the quantity and quality of these stimulator cells can vary substantially. Monocyte-derived DC from cancer patients have been reported to express reduced levels of costimulatory molecules and produce less inflammatory cytokines9,10. In fact, murine DC rather than autologous APC have been used to test the function of NKT cells from CML patients11. However, this system can only be used for in vitro testing since NKT cells cannot be expanded by murine DC and then used for adoptive immunotherapy. Thus, a standardized system that relies on artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) could produce the stimulating effects of DC without the pitfalls of allo- or xenogeneic cells12, 13. Herein, we describe a method for generating CD1d-based aAPC. Since the engagement of the T cell receptor (TCR) by CD1d-antigen complexes is a fundamental requirement of NKT cell activation, antigen: CD1d-Ig complexes provide a reliable method to isolate, activate, and expand effector NKT cell populations.

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Here we describe a method for activating and expanding human NKT cells from bulk T cell populations using artificial antigen presenting cells (aAPC). The use of CD1d-based aAPC provides a standardized method for generating high numbers of functional NKT cells.

مستضد تقديم الاصطناعي تنشيط الخلية بوساطة (AAPC) والتوسع في الخلايا التائية القاتلة الطبيعية

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with antigen presenting cells. T cells accomplish regulated adhesion by controlling the adhesive properties of integrins, a class of cell adhesion molecules consisting of heterodimeric pairs of transmembrane proteins that interact with target molecules on partner cells or extracellular matrix. The most prominent T cell integrin is lymphocyte function associated antigen (LFA)-1, composed of subunits &#945;L and &#946;2, whose target is the intracellular adhesion molecule (ICAM)-1. The ability of a T cell to control adhesion derives from the ability to regulate the affinity states of individual integrins. Inside-out signaling describes the process whereby signals inside a cell cause the external domains of integrins to assume an activated state. Much of our knowledge of these complex phenomena is based on mechanistic studies performed in simplified in&#160;vitro model systems. The T lymphocyte adhesion assay described here is an excellent tool that allows T cells to adhere to target molecules, under static conditions, and then utilizes a fluorescent plate reader to quantify adhesiveness. This assay has been useful in defining adhesion-stimulatory or inhibitory substances that act on lymphocytes, as well as characterizing the signaling events involved. Although described here for LFA-1 - ICAM-1 mediated adhesion; this assay can be readily adapted to allow for the study of other adhesive interactions (e.g.&#160;VLA-4 - fibronectin).

Static adhesion assay is a powerful tool that can be used to model the interactions between T lymphocytes and other cell types. Interactions are generated by injecting labeled T cells into wells coated with adhesion molecules, while a plate reader is used to quantify the number of adherent cells following serial washes.

ثابت التصاق الفحص لدراسة إنتغرين تنشيط الخلايا اللمفية تي في

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

الماوس السذاجة CD4<sup&gt; +</sup&gt; عزل T خلية و<em&gt; في المختبر</em&gt; التمايز إلى T مجموعات فرعية خلية

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell interaction known as the immunological synapse. F-actin is also speculated to play a role in regulating molecular distributions at the membrane of cells including sub-membranous vesicle dynamics and protein clustering. While standard light microscope techniques allow generalized and diffraction-limited observations to be made, many cellular and molecular events including clustering and molecular flow occur in populations at length-scales far below the resolving power of standard light microscopy. By combining total internal reflection fluorescence with the super resolution imaging method structured illumination microscopy, the two-dimensional molecular flow of F-actin at the immune synapse of T cells was recorded. Spatio-temporal image correlation spectroscopy (STICS) was then applied, which generates quantifiable results in the form of velocity histograms and vector maps representing flow directionality and magnitude. This protocol describes the combination of super-resolution imaging and STICS techniques to generate flow vectors at sub-diffraction levels of detail. This technique was used to confirm an actin flow that is symmetrically retrograde and centripetal throughout the periphery of T cells upon synapse formation.

To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.

القشرية أكتين تدفق في خلايا T كميا بواسطة المكانية والزمانية صورة الارتباط الطيفي للهيكلة الإضاءة المجهر البيانات

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

ل<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج من حاجز الدم في الدماغ عن طريق التحليل الطيفي المعاوقة: التركيز على التفاعل خلية تي خلية البطانية

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal of immunosuppression. The mixed leukocyte reaction (MLR), limiting dilution assays, and trans-vivo delayed-type hypersensitivity (DTH) assay have all been applied to this question, but these methods have limited predictive ability and/or significant practical limitations that reduce their usefulness. Imaging flow cytometry is a technique that combines the multiparametric quantitative powers of flow cytometry with the imaging capabilities of fluorescent microscopy. We recently made use of an imaging flow cytometry approach to define the proportion of recipient T cells capable of forming mature immune synapses with donor antigen-presenting cells (APCs). Using a well-characterized mouse heart transplant model, we have shown that the frequency of in vitro immune synapses among T-APC membrane contact events strongly predicted allograft outcome in rejection, tolerance, and a situation where transplant survival depends on induced regulatory T cells. The frequency of T-APC contacts increased with T cells from mice during acute rejection and decreased with T cells from mice rendered unresponsive to alloantigen. The addition of regulatory T cells to the in vitro system reduced prolonged T-APC contacts. Critically, this effect was also seen with human polyclonally expanded, naturally occurring regulatory T cells, which are known to control the rejection of human tissues in humanized mouse models. Further development of this approach may allow for a deeper characterization of the alloreactive T-cell compartment in transplant recipients. In the future, further development and evaluation of this method using human cells may form the basis for assays used to select patients for immunosuppression minimization, and it can be used to measure the impact of tolerogenic therapies in the clinic.

This paper describes a method for measuring alloreactivity in a mixed population of T cells using imaging flow cytometry.

قياس T خلية Alloreactivity عن طريق التصوير التدفق الخلوي

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and multiplexing ability. Using fluorescent nano-diamond fiducial markers, we describe the drift correction and alignment procedures required to obtain high precision in single molecule localization microscopy. In addition, a new multiplexing strategy, madSTORM, is described in which multiple molecules are targeted in the same cell using sequential binding and elution of fluorescent antibodies. madSTORM is demonstrated on an activated T cell to visualize the locations of different components within a membrane-bound, multi-protein structure called the T cell receptor microcluster. In addition, application of madSTORM as a general tool for visualization of multi-protein structures is discussed.

We demonstrate a method to image multiple molecules within heterogeneous nano-structures at single molecule accuracy using sequential binding and elution of fluorescently labeled antibodies.

عالية متعددة، والتصوير فائقة الدقة من الخلايا T باستخدام مادستورم

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and damaging the testes. During an infection with the ZIKV, immune cells have been shown to infiltrate into the tissues. However, the cellular mechanisms that define the protection and/or immunopathogenesis of these immune cells during a ZIKV infection are still largely unknown. Herein, we describe methods to evaluate the virus-specific T-cell functionality in these immunoprivileged organs of ZIKV-infected mice. These methods include a) a ZIKV infection and vaccine inoculation in Ifnar1-/- mice; b) histopathology, immunofluorescence, and immunohistochemistry assays to detect the virus infection and inflammation in the brain, testes, and spleen; c) the preparation of a tetramer of ZIKV-derived T-cell epitopes; d) the detection of ZIKV-specific T cells in the monocytes isolated from the brain, testes, and spleen. Using these approaches, it is possible to detect the antigen-specific T cells that have infiltrated into the immunoprivileged organs and to evaluate the functions of these T cells during the infection: potential immune protection via virus clearance and/or immunopathogenesis to exacerbate the inflammation. These findings may also help to clarify the contribution of T cells induced by the immunization against ZIKV.

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

A protocol to evaluate antigen-specific T-cell responses in the immunoprivileged organs of the Ifnar1-/- murine model for the Zika virus (ZIKV) infection is described. This method is pivotal for investigating the cellular mechanisms of the protection and immunopathogenesis of ZIKV vaccines and is also valuable for their efficacy evaluation.

تقييم الاستجابات الخاصة بفيروس زيكا تي خلية في أجهزة إيمونوبريفيليجيد من الفئران المصابة Ifnar1-/-

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

السيطرة المكانية والزمانية لتنشيط الخلية تي استخدام مؤثر فوتواكتيفاتابل

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

تنبيغ من فيروسات تي خلية المستقبلات في الخلايا التائية ماوس

تحريض الطعم ضد المضيف المرض و

مستضد تقديم الاصطناعي تنشيط الخلية بوساطة (AAPC) والتوسع في الخلايا التائية القاتلة الطبيعية

ثابت التصاق الفحص لدراسة إنتغرين تنشيط الخلايا اللمفية تي في

الماوس السذاجة CD4

القشرية أكتين تدفق في خلايا T كميا بواسطة المكانية والزمانية صورة الارتباط الطيفي للهيكلة الإضاءة المجهر البيانات

ل

قياس T خلية Alloreactivity عن طريق التصوير التدفق الخلوي

عالية متعددة، والتصوير فائقة الدقة من الخلايا T باستخدام مادستورم

تقييم الاستجابات الخاصة بفيروس زيكا تي خلية في أجهزة إيمونوبريفيليجيد من الفئران المصابة Ifnar1^-/-