نشكر البروفيسور جيفري واستينيس، جامعة كولومبيا البريطانية، للتعبير عن البذور رفب-TUB6 ومراجع مجهول للحصول على تصحيحات مفيدة. ونحن ممتنون للبروفيسور هيو ديكنسون لتنبيهنا إلى استخدام فيلم السليلوز كدعم ميكانيكي وجون بيكر للتصوير الفوتوغرافي. وقد دعم هذا العمل بمنح البحوث ببسك / بب / G013993 / 1 و بب / D004055 / 1 إلى إم، وجائزة تدريب الدكتوراه ببسرك ومنحة كلارندون إلى سك

1 - إنشاء الغرفة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام قطع الزجاج، وقطع 3 مم شرائح واسعة من نهاية شريحة المجهر 1 ملم. باستخدام سيانوكريلات فائقة الغراء أو الشريط على الوجهين، والغراء هذه الشرائط الزجاج ما يقرب من 45 ملم وبصرف النظر عبر عرض شريحة المجهر الثاني ( الشكل 1A ). مطلوب شريحة واحدة في الغرفة، بالإضافة إلى الشرائح الإضافية لصب ألواح أجار (شريحة واحدة سوف تسفر 2-3 ألواح أجار). يمكن إعادة استخدام الشرائح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بين شرائط الزجاج، والأزياء طوقا من ارتفاع متطابقة من بولي إيثيلزيلوكسان بولي (غاما). وضع الكرة من بولي (ديميثيلزيلوكسان) الصمغ على الشريحة ( الشكل 1B )، الرطب شريحة ثانية مع كمية صغيرة من 100٪ من الايثانول المطلق، وتسطيح بولي (ديميثيلزيلوكسان) الكرة اللثة مع الشريحة الثانية حتى وصلت إلى الارتفاع من شرائط الزجاج ( الشكل 1C ). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لزم الأمر، وتقليم الزائدة بولي (الدايمثيلزيلوكسان) الصمغ مع شفرة حلاقة وتكرار تسطيح. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام القاطع مناسبة أو شفرة حلاقة المبللة في الايثانول المطلق، وإزالة الجزء الداخلي من الصمغ بولي (ديميثيلزيلوكسان) لخلق تجويف التي سوف تعقد في وقت لاحق الشتلات وبلاطة أجار ( الشكل 1D ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقليم بعناية هلام مع شفرة حلاقة لخلق طوقا مع سمك الجدار النهائي ما يقرب من 2 مم ( الشكل 1E ). نفاذية الغازات من خلال حاجز بولي (ديميثيلزيلاكسان) مستقلة عن سمك فوق 50 ميكرون 11 . </li></ol> 2. إنشاء أجار-- صلابة بلاطة النمو المتوسطة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على شريحة المجهر مع اثنين من شرائط الزجاج، ووضع ساترة (22 مم × 50 مم) بحيث تقع على كل من شرائط الزجاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة ذابت نصف القوة موراشيج وسكوغ متوسطة النمو تحتوي على 1٪ ث / س السكروز و 1.5٪ ث / الخامس أغار (½ مس) في الفضاء الناتجتحت ساترة حتى يتم شغل هذا الأخير تماما (حوالي 1 مل الحجم الكلي) وترك حتى يتم تعيين أجار (حوالي 5 دقائق). ملاحظة: المركبات الدوائية يمكن أن تدار من خلال لوح أجار بإضافة تركيزات مناسبة إلى وسط السائل قبل سكب بلاطة. وقد تم اختبار هذا بنجاح ل ديكساميثازون 12 ، إيزوكسابين، 2،6-ديكلوروبنزونيتريل (دسب)، أوريزالين، و لاترونكولين B. </li></ol> 3 - الانتهاء من إعداد غرفة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الهواء بتوازن بد عن طريق هز حجم صغير من بد في أنبوب 7 . إضافة كمية صغيرة (حوالي 200 ميكرولتر) من الهواء معاير بد إلى البئر من طوقا هلام، ولكن لا ملء الغرفة تماما. وهذا بد يساعد على تجنب محاصرة فقاعات الهواء تحت لوح أجار كما يتم وضعها في الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة ساترة من لوح أجار (في الخطوة 2.2 أعلاه) واستخدام شفرة حلاقة لقطع جزء من ديسيريد الحجم والشكل. ثم ضعه في بئر من طوقا هلام ( الشكل 1F ). يجب أن يكون هناك فجوة من 2-4 ملم إلى طوقا في جميع أنحاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء الغرفة تماما مع الهواء معاير بد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع واحد أو أكثر من الشتلات A. ثاليانا (ما يصل إلى 3 شتلات للتصوير أكثر من 2-3 أيام) على لوح أجار مع كوتيليدونس وهيبوكوتيل معلقة على الحافة، وتطفو في بد ( الشكل 1G ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحصول على الشتلات، تعقيم البذور مع 70٪ من الإيثانول، النبات على ½ مس المتوسطة تستكمل مع 1٪ السكروز و 0.8٪ أجار، ستراتيفي لمدة 2-4 أيام في 4 درجات مئوية، وتنمو على لوحات موجهة عموديا عند 22 درجة مئوية في 16 ساعة ضوء / 8 ساعة نظام الظلام. للجذور الجانبية التصوير، وتنمو النباتات لمدة 7-10 أيام قبل نقلها إلى غرف التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإغلاق الغرفة، وتطبيق ساترة مطابقة لبصريات الهدف، والضغط عليه بلطف أسفل حافة شريحة المجهر الزجاجي حتى ساترةويستند على كل من شرائط الزجاج ( الشكل 1H ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأمين ساترة مع شرائط من 1.25 سم واسعة ميكروبور الشريط الجراحية قطع في نصف طول الحكمة على كل نهاية إذا رغبت في ذلك ( الشكل 1I ). السماح للعينة لتسوية لمدة 30 دقيقة تقريبا قبل التصوير. هذا يقلل من حركة العينة أثناء التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء التصوير مع المجهر تستقيم للحفاظ على الركيزة تسيطر على النمو. استخدام أهداف 20X / 0.7NA أو 63X / 1.2NA CS2. </li></ol>

<ol>
	<li>Calder, G., Hindle, C., Chan, J., Shaw, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+imaging+chamber+for+viewing+living+plant+cells+and+tissues+at+high+resolution+for+extended+periods.">An optical imaging chamber for viewing living plant cells and tissues at high resolution for extended periods.</a> Plant Meth. 11, 22 (2015).</li><li>Grossmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RootChip:+An+Integrated+Microfluidic+Chip+for+Plant+Science.">The RootChip: An Integrated Microfluidic Chip for Plant Science.</a> Plant Cell. 23, 4234-4240 (2011).</li><li>Busch, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+device+and+computational+platform+for+high+throughput+live+imaging+of+gene+expression.">A microfluidic device and computational platform for high throughput live imaging of gene expression.</a> Nat Meth. 9, 1101-1106 (2012).</li><li>Baranenko, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubility+of+oxygen+and+carbon+dioxide+in+water.">Solubility of oxygen and carbon dioxide in water.</a> Atomic Energy. 68, 342-346 (1990).</li><li>Sena, G., Frentz, Z., Birnbaum, K. D., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+Cellular+Dynamics+in+Growing+Arabidopsis+Roots+with+Light+Sheet+Microscopy.">Quantitation of Cellular Dynamics in Growing Arabidopsis Roots with Light Sheet Microscopy.</a> Plos One. 6, (2011).</li><li>Littlejohn, G. R., Gouveia, J. D., Edner, C., Smirnoff, N., Love, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfluorodecalin+enhances+in+vivo+confocal+microscopy+resolution+of+Arabidopsis+thaliana+mesophyll.">Perfluorodecalin enhances in vivo confocal microscopy resolution of Arabidopsis thaliana mesophyll.</a> New Phytol. 186, 1018-1025 (2010).</li><li>Littlejohn, G. R., Love, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+imaging+Arabidopsis+leaves+using+perfluorodecalin+as+an+infiltrative+imaging+medium.">A simple method for imaging Arabidopsis leaves using perfluorodecalin as an infiltrative imaging medium.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Littlejohn, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+update:+improvements+in+imaging+perfluorocarbon-mounted+plant+leaves+with+implications+for+studies+of+plant+pathology,+physiology,+development+and+cell+biology.">An update: improvements in imaging perfluorocarbon-mounted plant leaves with implications for studies of plant pathology, physiology, development and cell biology.</a> Front Plant Sci. 5, 140 (2014).</li><li>Dias, A., Freire, M., Coutinho, J. A., Marrucho, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubility+of+oxygen+in+liquid+perfluorocarbons.">Solubility of oxygen in liquid perfluorocarbons.</a> Fluid Phase Equilibria. 222, 325-330 (2004).</li><li>Sukumaran, N. P., Quamme, H., Weiser, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Fluid+Fluorocarbons+to+Study+Freezing+in+Plant+Tissues.">Use of Fluid Fluorocarbons to Study Freezing in Plant Tissues.</a> Plant Physiol. 50, 632-634 (1972).</li><li>Firpo, G., Angeli, E., Repetto, L., Valbusa, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+thickness+dependence+of+polydimethylsiloxane+(PDMS)+membranes.">Permeability thickness dependence of polydimethylsiloxane (PDMS) membranes.</a> J Membrane Sci. 481, 1-8 (2015).</li><li>Kirchhelle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Specification+of+Geometric+Edges+by+a+Plant+Rab+GTPase+Is+an+Essential+Cell-Patterning+Principle+During+Organogenesis+in+Arabidopsis.">The Specification of Geometric Edges by a Plant Rab GTPase Is an Essential Cell-Patterning Principle During Organogenesis in Arabidopsis.</a> Dev Cell. 36, 386-400 (2016).</li><li>Beemster, G. T. S., Baskin, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell+division+and+elongation+underlying+the+developmental+acceleration+of+root+growth+in+Arabidopsis+thaliana.">Analysis of cell division and elongation underlying the developmental acceleration of root growth in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Physiol. 116, 1515-1526 (1998).</li><li>Geldner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+combinatorial+analysis+of+membrane+compartments+in+intact+plants+with+a+multicolor+marker+set.">Rapid, combinatorial analysis of membrane compartments in intact plants with a multicolor marker set.</a> Plant J. 59, 169-178 (2009).</li><li>Ambrose, C., Allard, J. F., Cytrynbaum, E. N., Wasteneys, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CLASP-modulated+cell+edge+barrier+mechanism+drives+cell-wide+cortical+microtubule+organization+in+Arabidopsis.">A CLASP-modulated cell edge barrier mechanism drives cell-wide cortical microtubule organization in Arabidopsis.</a> Nat Commun. 2, 430 (2011).</li><li>Kiss, J. Z., Miller, K. M., Ogden, L. A., Roth, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototropism+and+Gravitropism+in+Lateral+Roots+of+Arabidopsis.">Phototropism and Gravitropism in Lateral Roots of Arabidopsis.</a> Plant Cell Physiol. 43, 35-43 (2002).</li><li>Gendreau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+basis+of+hypocotyl+growth+in+Arabidopsis+thaliana.">Cellular basis of hypocotyl growth in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Physiol. 114, 295-305 (1997).</li><li>von Wangenheim, D., Hauschild, R., Friml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+Sheet+Fluorescence+Microscopy+of+Plant+Roots+Growing+on+the+Surface+of+a+Gel.">Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel.</a> J. Vis. Exp. (119), e55044 (2017).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

الطريقة المعروضة هنا هي استراتيجية بسيطة للتصوير مبائر عالية الدقة لتطوير الجذور الجانبية لمدة سنتين وتصل إلى ثلاثة أيام. لفترات تصل إلى 48 ساعة، لم يلاحظ أي آثار ضارة لنظام التصوير على تطوير الجذر الجانبي. بعد 48 ساعة، بدأ متوسط ​​نمو الجذر الجانبي في التباطؤ، على الرغم من أن مجموعة فرعية كبيرة من الجذور (37٪) استمرت في النمو بمعدلات مماثلة لمتوسط ​​نمو الجذور على الصفائح. لذلك، من خلال تصوير عدد كبير بما فيه الكفاية من الجذور، الجذور التي تباطأ النمو بعد 48 ساعة يمكن استبعادها. لم يتم إجراء اختبارات منتظمة لغرف التصوير لفترات أطول من 72 ساعة، ولكن ينصح باستراتيجيات بديلة إذا كانت فترات التصوير الموسعة مطلوبة. يمكن ترك غرف التصوير على المسرح المجهر بشكل مستمر، إذا تم توفير الظروف البيئية المناسبة، أو إزالتها إلى منشأة النمو وعاد بشكل دوري إلى المجهر. هذا يسمح العديد من غرف ليتم تصويرها في موازاة. &lt;/ P&gt; ميزة واحدة من غرف وصفها هنا هو أن الجذور الجانبية ثابتة في موقفها ويمكن تصويرها باستخدام عالية الدقة العدسات الغمر المياه. الاستقرار المكاني يعتمد بشكل حاسم على تركيز أجار المستخدمة في بلاطة أجار دعم. في البداية تم اختبار مجموعة من تركيزات مختلفة من أجار 0.8٪ إلى 2٪ آجار، وكشف عن أن تركيزات عالية في هذا النطاق جذور ثابتة ثابتة في الفضاء، ولكن تباطؤ نمو الجذر بشكل أسرع وبعض الجذور عرضت علامات الإجهاد الميكانيكي، بما في ذلك انخفاض استطالة الخلية. وعلى النقيض من ذلك، فإن تركيزات أجار منخفضة لم توفر الدعم المطلوب وجذور انجرفت في x، y، z خلال التصوير. المثلى 1.5٪ أجار بلاطة يثبت موقف العينة دون آثار ميكانيكية ضارة. في ظل هذه الظروف، بعد تسوية في أول 30 دقيقة أو نحو ذلك، جذور مستقرة على مدى ساعات عديدة، مما يسمح الحصول على البيانات بين عشية وضحاها. أثناء الحصول على البيانات 4D، كانت نطاقات z- كومة عادة بمضرب من 5-10 ميكرون إضافية ولكن هذا كان أساسا لاستيعاب النمو خارج الطائرة من الجذور الجانبية بدلا من z-- الانجراف أو تمايل. على الرغم من أن تركيز أجار القياسية يوفر بعض المقاومة ضد الاختراق، والجذور المتنامية غرافيتروبيكالي في نهاية المطاف تخترق أجار. ومع ذلك، من خلال تعديل طفيف من غرفة التصوير، ويمكن الحفاظ على نمو الجذر موازية ساترة، مما يسمح للجذور الجانبية القديمة والجذور الأولية لتكون تصوير. وعلاوة على ذلك، يمكن بسهولة أن تكون مخصصة غرفة التصوير الأساسية ل هيبوكوتيلز. هيبوكوتيلز هي أكثر بحرية العائمة في هذا النظام بحيث تم زيادة قوس Z- محور للحصول على صورة عادة إلى حوالي 20 ميكرون. في هذه الدراسة، تم استخدام المجهر تستقيم في جميع أنحاء، مما يسمح للخصائص الركيزة ليتم السيطرة عليها. غرفة التصوير قد تكون قابلة للتكيف مع تكوينات المجهر مقلوب ولكن التأثير على الوقت من ساترة جامدة على اعتراض الأجهزة تحتاج إلى تقييم. </p&gt; وقد أشار ليتلجوهن وزملاؤه إلى أن بد نفسها لا تذوب بسهولة الجزيئات البيولوجية، مما يعني أنه لا يمكن استخدامها مباشرة لتسليم المركبات الدوائية 7 . تم التغلب على هذه المشكلة عن طريق توريد مثل هذه المركبات من خلال بلاطة من وسط النمو المعزز الذي يقع على لوح أجار. في حين أن نظم نضح ستبقى الطريقة المفضلة للتجارب غسل التدريجي، وقد استخدمت غرفة التصوير بنجاح لإدارة ديكساميثازون 12 والمركبات الأخرى. ملاحظة واحدة، في حين أن هذه المادة في التحضير فون واجنهيم وزملاؤه 18 وصفت غرفة للتصوير تطوير الجذر الجانبي باستخدام ورقة الضوء المجهري.

لدراسة العمليات الخلوية والخلايا التي تكمن وراء تطوير النباتات، وهناك طلب متزايد على استراتيجيات التصوير عالية الدقة على المدى الطويل عالية الدقة. ويتمثل أحد التحديات الرئيسية في تجارب التصوير هذه في الحفاظ على الظروف الفسيولوجية بما في ذلك التبادل الغازي الكافي بالإضافة إلى إمدادات المياه والمغذيات 1 و 2 و 3 . لاستخدام الأهداف مع فتحات العددية العالية للقرار البصري الأمثل، وينبغي وضع العينات في مكان قريب وموجهة بالتوازي مع ساترة. الحركة في x، y، و z الاتجاهات يجب أن يكون الحد الأدنى خلال التصوير. في حين أن الشتلات غالبا ما يتم تركيبها في الماء أو محلول مائي للتصوير على المدى القصير، والماء لديه قدرة منخفضة لإذابة كو 2 و O 2 (1.54 ملغ / مل و 0.04 ملغ / مل، على التوالي عند 20 درجة مئوية، 0.1 ميجا باسكال) 4 ، مما يجعلفإنه غير مناسب لتجارب تمديد الوقت الفاصل. نظم الإرواء التي تحافظ على مستويات ثابتة من الأوكسجين والمواد المغذية هي حل واحد لهذه المشكلة، وقد وضعت لكلا متحد البؤر المسح الضوئي بالليزر المجهري (كلسم) 1 ، 2 ، 3 والضوء ورقة المجهري (لسم) 5 . وقد صممت نظم مثل روتشيب 2 و روتاراي 3 خصيصا للتصوير الفاصل الزمني من الجذور النامية وتنطوي على بذور الإنبات في جهاز متعدد العينات بناء مخصص. هذه الترتيبات ضمان الحد الأدنى من الاضطرابات الميكانيكية ومصممة لتحليل مواز للشتلات متعددة، ولكن ليست الأمثل لتصوير الهياكل تحت الخلوية. وقد صممت كالدر وزملاؤه غرفة التصوير على أساس نضح أكثر تعقيدا الأمثل لتصوير الهياكل تحت الخلوية التي يقام العينة في موقف من قبل شبكةللسماح باستخدام العدسات التكبير الغمر عالية 1 . عرض هنا هو بديل، حل بسيط لهذه المشكلة التي لا تقوم على نظم نضح، ولكن يستخدم بيرفلوروديكالين (بد)، وهو بيرفلوروكربون التي اكتسبت شعبية مؤخرا كوسيلة متزايدة ل أرابيدوبسيس التصوير 6 ، 7 ، 8 . في هذه التطبيقات، والقدرة العالية لل بد لذوبان كو 2 و O 2 (1.9 غ / مل ل O 2 في بد مقارنة 0.04 ملغ / مل في الماء) 9 ، ويسمح التبادل الغازي من قبل الأنسجة مغمورة. وعلاوة على ذلك، بد هو غير الفلورسنت ومؤشر الانكسار (1.313) هو مقارنة مع الماء (1.333) وأقرب إلى أن من السيتوسول (~ 1.4) من الهواء (1.000) 6 . وقد تم الإبلاغ عن المركبات البيرفلوروكربونية لديها الحد الأدنى من التأثير الفسيولوجي على مجموعة متنوعة من النباتات والنباتات رالقضايا 6 ، مع بذور الفجل تنبت بسهولة عندما تغمر في بد ويظهر النمو الطبيعي والتنمية لمدة يومين على الأقل كامل أيام عند تزويده بالماء 10 . وقد أجريت ملاحظات مماثلة لإنبات بذور الأرابيدوبسيس 6 . استنادا إلى تحفيز رامان نثر مباشرة صورة توزيع بد في الأنسجة ورقة أرابيدوبسيس بعد تسلل، ويخلص ليتلجون وزملاؤه أن بد من المرجح لا تؤخذ من قبل الخلايا الحية 8 . وقد استخدم بد في الغالب إلى الأنسجة الجوية صورة، حيث أنه يزيد بشكل كبير عمق التصوير لأنها تتسرب بسهولة الفضاء الجوي بسبب التوتر السطحي المنخفض 6 . هنا، يتم اعتماد بد للتصوير مبائر على المدى الطويل من تطوير الجذور الجانبية. في هذا التكوين، يتم وضع شتلة واحدة أو أكثر على لوح من وسط النمو تتعزز مع أجار ومغمورة في بد. و بد يسمح gتبادل عاصي في غرفة التصوير، ومنع نقص الأكسجين. بد هو متقلب للغاية لذلك يتم الاحتفاظ بها من قبل طوقا من الصمغ بولي (ثنائي ميثيل سيلوكسان) التي لديها أيضا عالية نفاذية الغاز (1.5 × 10 -12 بمول م -1 ق -1 با -1 ل كو 2 ) 11 . المغذيات والمياه يتم توفيرها من قبل بلاطة متوسطة صلابة مع أجار. في نفس الوقت، هذا أجار بلاطة يضغط بلطف الجذر ضد ساترة، وبالتالي تحديد موقفها النسبي في غرفة التصوير والسماح باستخدام عالية الدقة العدسات الغمر المياه. وعلاوة على ذلك، لوح أجار يمكن استخدامها لإدارة مجموعة من العلاجات الدوائية، بما في ذلك ديكساميثازون، أوريزالين، وإيزوكسابين. يمكن تجميع غرف التصوير بأعداد كبيرة من الشرائح المجهرية القياسية باستخدام الحد الأدنى من المعدات. وقد وضعت غرف التصوير واتسمت لدراسة التنمية الجذر الجانبي ولكن قابلة للتكيف لتصوير أجهزة الشتلات الأخرى مثل نصائح الجذر الأولية وhypocotyls.

<table><tbody><tr><td>Perfluorodecalin</td><td>F2 Chemicals, F2 Chemicals Ltd., Lea Town, Lancashire, UK</td><td>FLUTEC PP6</td><td></td></tr><tr><td>Poly(dimethylsiloxane) gum&amp;nbsp;</td><td>Carolina Biological Supply; Burlington, NC, USA</td><td>Item # 132700</td><td>Carolina Observation Gel</td></tr><tr><td>Cavity Microscope Slides</td><td>VWR International Ltd, Lutterworth,&amp;nbsp;UK</td><td>10118-600</td><td>Cavity is 13 mm diameter and 0.2-0.4 mm in depth. Any cavity slide will probably suffice</td></tr><tr><td>Cyanoacrylate glue</td><td>Loctite</td><td>604753</td><td>Any &#039;super-glue&#039; suitable for glass will probably suffice</td></tr><tr><td>Cellulosic cellophane membrane</td><td>AA Packaging Limited, Preston, UK</td><td></td><td>325P cellulose film; 80 mm disc</td></tr></tbody></table>

a simple chamber for long-term confocal imaging of root and hypocotyl development

العديد من جوانب التنمية النباتية، مثل التشكل الجانبي الجذر، تحدث على فترات زمنية من عدة أيام. لدراسة العمليات الخلوية والخلايا الكامنة وراءها، مطلوب استراتيجيات عالية الدقة الفاصل الزمني الفاصل الزمني التي تحافظ على الظروف الفسيولوجية. يجب أن يكون للأنسجة النباتية ما يكفي من المغذيات وإمدادات المياه مع تبادل الغاز المستمر، ولكن عندما غمرت وتجمد تحت ساترة، فهي عرضة بشكل خاص لنقص الأكسجين. إحدى الاستراتيجيات التي تم توظيفها بنجاح هي استخدام نظام نضح للحفاظ على إمدادات ثابتة من الأوكسجين والمواد المغذية. غير أن هذه الترتيبات يمكن أن تكون معقدة ومرهقة وتتطلب معدات متخصصة. يعرض هنا هو استراتيجية بديلة لنظام التصوير بسيط باستخدام بيرفلوروديكالين كوسيلة الغمر. هذا النظام من السهل اقامة، يتطلب الحد الأدنى من المعدات، ويتم تركيبها بسهولة على مرحلة المجهر، والسماح لعدة غرف التصوير ليتم إعدادها وتصويرها في قدم المساواةعلال. في هذا النظام، لا يمكن تمييز معدلات نمو الجذر الجانبي عن معدلات النمو في ظل الظروف القياسية على لوحات أجار لليومين الأولين، ويستمر نمو الجذر الجانبي بمعدلات منخفضة ليوم آخر على الأقل. يتم توفير الأنسجة النباتية مع المواد الغذائية عن طريق لوح أجار التي يمكن استخدامها أيضا لإدارة مجموعة من المركبات الدوائية. تم إنشاء نظام لرصد التنمية الجذر الجانبي ولكن قابل للتكيف بسهولة إلى صورة الأعضاء النباتية الأخرى مثل هيبوكوتيلز والجذور الأولية.

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development at JoVE.com

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

المقدمة هنا هو تقنية بسيطة عالية الدقة متحد البؤر الفاصل الزمني التصوير من الجذر وتطوير هيبوكوتيل لمدة تصل إلى 3 أيام باستخدام عالية الأهداف العددي الفتحة و بيرفلوروديكالين كوسيلة الغمر.

غرفة بسيطة للتصوير متحد البؤر على المدى الطويل من تطوير الجذر والهيبوكوتيل

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

a-simple-chamber-for-long-term-confocal-imaging-root-hypocotyl

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.0K Views.  University of Oxford.  المقدمة هنا هو تقنية بسيطة عالية الدقة متحد البؤر الفاصل الزمني التصوير من الجذر وتطوير هيبوكوتيل لمدة تصل إلى 3 أيام باستخدام عالية الأهداف العددي الفتحة و بيرفلوروديكالين كوسيلة الغمر. 

Video: A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, phosphorus, sulfate and trace elements that plants acquire from the soil. If we want to develop sustainable approaches to producing high crop yield, we need to better understand how the root develops, takes up a wide spectrum of nutrients, and interacts with symbiotic and pathogenic organisms. To accomplish these goals, we need to be able to explore roots in microscopic detail over time periods ranging from minutes to days.
We developed the RootChip, a polydimethylsiloxane (PDMS)- based microfluidic device, which allows us to grow and image roots from Arabidopsis seedlings while avoiding any physical stress to roots during preparation for imaging1 (Figure 1). The device contains a bifurcated channel structure featuring micromechanical valves to guide the fluid flow from solution inlets to each of the eight observation chambers2. This perfusion system allows the root microenvironment to be controlled and modified with precision and speed. The volume of the chambers is approximately 400 nl, thus requiring only minimal amounts of test solution.
Here we provide a detailed protocol for studying root biology on the RootChip using imaging-based approaches with real time resolution. Roots can be analyzed over several days using time lapse microscopy. Roots can be perfused with nutrient solutions or inhibitors, and up to eight seedlings can be analyzed in parallel. This system has the potential for a wide range of applications, including analysis of root growth in the presence or absence of chemicals, fluorescence-based analysis of gene expression, and the analysis of biosensors, e.g. FRET nanosensors3.

This article provides a protocol for cultivation of Arabidopsis seedlings in the RootChip, a microfluidic imaging platform that combines automated control of growth conditions with microscopic root monitoring and FRET-based measurement of intracellular metabolite levels.

الوقت الفاصل بين التصوير الإسفار من نمو الجذور Arabidopsis مع التلاعب السريع للبيئة الجذر باستخدام RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

Bioengineering

RGB and Spectral Root Imaging for Plant Phenotyping and Physiological Research: Experimental Setup and Imaging Protocols

Better understanding of plant root dynamics is essential to improve resource use efficiency of agricultural systems and increase the resistance of crop cultivars against environmental stresses. An experimental protocol is presented for RGB and hyperspectral imaging of root systems. The approach uses rhizoboxes where plants grow in natural soil over a longer time to observe fully developed root systems. Experimental settings are exemplified for assessing rhizobox plants under water stress and studying the role of roots. An RGB imaging setup is described for cheap and quick quantification of root development over time. Hyperspectral imaging improves root segmentation from the soil background compared to RGB color based thresholding. The particular strength of hyperspectral imaging is the acquisition of chemometric information on the root-soil system for functional understanding. This is demonstrated with high resolution water content mapping. Spectral imaging however is more complex in image acquisition, processing and analysis compared to the RGB approach. A combination of both methods can optimize a comprehensive assessment of the root system. Application examples integrating root and aboveground traits are given for the context of plant phenotyping and plant physiological research. Further improvement of root imaging can be obtained by optimizing RGB image quality with better illumination using different light sources and by extension of image analysis methods to infer on root zone properties from spectral data.

An experimental protocol is presented for assessment of soil grown plant root systems with RGB and hyperspectral imaging. Combination of RGB image time series with chemometric information from hyperspectral scans optimizes insights into plant root dynamics.

RGB والتصوير الطيفي الجذر فينوتيبينج النباتية والبحوث الفسيولوجية: الإعداد التجريبية والتصوير البروتوكولات

Better understanding of plant root dynamics is essential to improve resource use efficiency of agricultural systems and increase the resistance of crop ...

Environment

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. Recent advances in confocal microscopy, combined with the development of numerous fluorophores, have overcome these issues and opened the possibility to study the expression of several genes simultaneously, with a good cellular resolution, in live samples. Live confocal imaging provides plant biologists with a powerful tool to study development, and has been extensively used to study root growth and the formation of lateral organs on the flanks of the shoot apical meristem. However, it has not been widely applied to the study of flower development, in part due to challenges that are specific to imaging flowers, such as the sepals that grow over the flower meristem, and filter out the fluorescence from underlying tissues. Here, we present a detailed protocol to perform live confocal imaging on live, developing Arabidopsis flower buds, using either an upright or an inverted microscope.

Live confocal imaging provides biologists with a powerful tool to study development. Here, we present a detailed protocol for the live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers.

يعيش متحد البؤر التصوير من تطوير نبات الأرابيدوبسيس الزهور

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic development. The activity and morphology of SAMs determine important agronomic traits, such as shoot architecture, size and number of reproductive organs, and most importantly, grain yield. Here, we provide a detailed protocol for analyzing both the surface morphology and the internal cellular structure of the living SAMs from different species through laser scanning confocal microscope. The whole procedure from the sample preparation to the acquisition of high resolution three-dimensional (3D) images can be accomplished within as short as 20 minutes. We demonstrate that this protocol is highly efficient for studying not only the inflorescence SAMs of the model species but also the vegetative meristems from different crops, providing a simple but powerful tool to study the organization and development of meristems across different plant species.

This protocol presents how to live image and analyze the shoot apical meristems from different plant species using laser scanning confocal microscopy.

[كنفوكل] تصوير مباشر من تبادل لإطلاق النار قمية الخلايا الإنشائية من الأنواع النباتية المختلفة

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

على المدى الطويل الوقت الفاصل بين التصوير من الفأر القوقعة إإكسبلنتس

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

Neuroscience

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by their natural environment, root hair morphology and function are difficult to study and often excluded from plant research. In recent years, microfluidic platforms have offered a way to visualize root systems at high resolution without disturbing the roots during transfer to an imaging system. The microfluidic platform presented here builds on previous plant-on-a-chip research by incorporating a two-layer device to confine the Arabidopsis thaliana main root to the same optical plane as the root hairs. This design enables the quantification of root hairs on a cellular and organelle level and also prevents z-axis drifting during the addition of experimental treatments. We describe how to store the devices in a contained and hydrated environment, without the need for fluidic pumps, while maintaining a gnotobiotic environment for the seedling. After the optical imaging experiment, the device may be disassembled and used as a substrate for atomic force or scanning electron microscopy while keeping fine root structures intact.

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

This article demonstrates how to culture Arabidopsis thaliana seedlings in a two-layer microfluidic platform that confines the main root and root hairs to a single optical plane. This platform can be used for real-time optical imaging of fine root morphology as well as for high-resolution imaging by other means.

التصوير مورفولوجيا الجذر الشعر شتلات نبات في منصة موائع جزيئية طبقتين

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

Development of Microfluidic Devices to Study the Elongation Capability of Tip-growing Plant Cells in Extremely Small Spaces

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior in such restrictive conditions. To address this issue, we have developed growth chambers for tip-growing plant cells that contain a series of narrow, micro-fabricated gaps (~1 &#181;m) in a poly-dimethylsiloxane (PDMS) substrate. This transparent material allows the user to monitor tip elongation processes in individual cells during microgap penetration by time-lapse imaging. Using this experimental platform, we observed morphological changes in pollen tubes as they penetrated the microgap. We captured the dynamic changes in the shape of a fluorescently labeled vegetative nucleus and sperm cells in a pollen tube during this process. Furthermore, we demonstrated the capability of root hairs and moss protonemata to penetrate the 1 &#181;m gap. This in vitro platform can be used to study how individual cells respond to physically constrained spaces and may provide insights into tip-growth mechanisms.

We describe a method to investigate the capability of tip-growing plant cells, including pollen tubes, root hairs, and moss protonemata, to elongate through extremely narrow gaps (~1 &#181;m) in a microfluidic device.

تطوير أجهزة موائع جزيئية لدراسة قدرة استطالة نصيحة زراعة الخلايا النباتية في المساحات الصغيرة للغاية

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

على المدى الطويل، عالية الدقة الفاصل الزمني متحد البؤر التصوير من<em&gt; الطفلق ل arabidopsis</em&gt; البشرة خلال إنبات

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Biology

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ binding proteins that initiate Ca2+ signaling cascades. However, we still know little about how stimulus specific Ca2+ signals are generated. The specificity of a Ca2+ signal may be attributed to the sophisticated regulation of the activities of Ca2+ channels and/or transporters in response to a given stimulus. To identify these cellular components and understand their functions, it is crucial to use systems that allow a sensitive and robust recording of Ca2+ signals at both the tissue and cellular levels. Genetically encoded Ca2+ indicators that are targeted to different cellular compartments have provided a platform for live cell confocal imaging of cellular Ca2+ signals. Here we describe instructions for the use of two Ca2+ detection systems: aequorin based FAS (film adhesive seedlings) luminescence Ca2+ imaging and case12 based live cell confocal fluorescence Ca2+ imaging. Luminescence imaging using the FAS system provides a simple, robust and sensitive detection of spatial and temporal Ca2+ signals at the tissue level, while live cell confocal imaging using Case12 provides simultaneous detection of cytosolic and nuclear Ca2+ signals at a high resolution.

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Ca2+ signaling regulates diverse biological processes in plants. Here we present approaches for monitoring abiotic stress induced spatial and temporal Ca2+ signals in Arabidopsis cells and tissues using the genetically encoded Ca2+ indicators Aequorin or Case12.

قياس المكانية والزمانية كاليفورنيا<sup&gt; 2+</sup&gt; إشارات في النباتات نبات الأرابيدوبسيس

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the observation of the whole organ with a high spatial- as well as temporal resolution over prolonged periods of time, which may cause photo-toxic effects. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy, which is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel. The plant is mounted in such a way that the roots are submerged in a liquid medium while the leaves remain in the air. In order to ensure photosynthetic activity of the plant, a custom-made lighting system illuminates the leaves. To keep the roots in darkness the water surface is covered with sheets of black plastic foil. This method allows long-term imaging of plant organ development in standardized conditions.

This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.

المجهر الضوئي ورقة الإسفار من جذور النباتات التي تنمو على سطح الأرض من هلام

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

غرفة بسيطة للتصوير متحد البؤر على المدى الطويل من تطوير الجذر والهيبوكوتيل

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video