يرغب المؤلف أن أشكر البروفيسور إليوت M مييرويتز لدعمه، والتعليقات على المخطوطة، وكذلك آن لافانواي في كلية دارتموث والدكتور أندريس كولازو في مرفق البيولوجية التصوير في معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا للمساعدة في حل المسائل التقنية مع التصوير متحد البؤر الحية. ويدعم عمل ناثانيال برونيت من قبل المعاهد الوطنية الأميركية للصحة من خلال منح R01 GM104244 إلى إليوت M مييرويتز.

<ol>
	<li>Prunet, N., Jack, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flower+Development+in+Arabidopsis:+There+Is+More+to+It+Than+Learning+Your+ABCs.">Flower Development in Arabidopsis: There Is More to It Than Learning Your ABCs.</a> Methods Mol. Biol. 1110, 3-33 (2014).</li><li>Stewart, D., Graciet, E., Wellmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+regulatory+mechanisms+controlling+floral+organ+development.">Molecular and regulatory mechanisms controlling floral organ development.</a> FEBS J. , (2016).</li><li>Heisler, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+auxin+transport+and+gene+expression+during+primordium+development+revealed+by+live+imaging+of+the+Arabidopsis+inflorescence+meristem.">Patterns of auxin transport and gene expression during primordium development revealed by live imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem.</a> Curr. Biol. 15 (21), 1899-1911 (2005).</li><li>Reddy, G. V., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-cell+homeostasis+and+growth+dynamics+can+be+uncoupled+in+the+Arabidopsis+shoot+apex.">Stem-cell homeostasis and growth dynamics can be uncoupled in the Arabidopsis shoot apex.</a> Science. 310 (5748), 663-667 (2005).</li><li>Yadav, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WUSCHEL+protein+movement+mediates+stem+cell+homeostasis+in+the+Arabidopsis+shoot+apex.">WUSCHEL protein movement mediates stem cell homeostasis in the Arabidopsis shoot apex.</a> Genes &amp; Dev. 25 (19), 2025-2030 (2011).</li><li>Reddy, G. V., Heisler, M. G., Ehrhardt, D. W., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+lineage+analysis+reveals+oriented+cell+divisions+associated+with+morphogenesis+at+the+shoot+apex+of+Arabidopsis+thaliana.">Real-time lineage analysis reveals oriented cell divisions associated with morphogenesis at the shoot apex of Arabidopsis thaliana.</a> Development. 131 (17), 4225-4237 (2004).</li><li>Chandler, J. W., Jacobs, B., Cole, M., Comelli, P., Werr, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DORNROSCHEN-LIKE+expression+marks+Arabidopsis+floral+organ+founder+cells+and+precedes+auxin+response+maxima.">DORNROSCHEN-LIKE expression marks Arabidopsis floral organ founder cells and precedes auxin response maxima.</a> Plant Mol. Biol. 76 (1-2), 171-185 (2011).</li><li>Urbanus, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+localisation+patterns+of+MADS+domain+proteins+during+floral+development+in+Arabidopsis+thaliana.">In planta localisation patterns of MADS domain proteins during floral development in Arabidopsis thaliana.</a> BMC Plant Biol. 9, (2009).</li><li>Hong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable+Cell+Growth+Yields+Reproducible+OrganDevelopment+through+Spatiotemporal+Averaging.">Variable Cell Growth Yields Reproducible OrganDevelopment through Spatiotemporal Averaging.</a> Dev. Cell. 38 (1), 15-32 (2016).</li><li>Roeder, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variability+in+the+control+of+cell+division+underlies+sepal+epidermal+patterning+in+Arabidopsis+thaliana.">Variability in the control of cell division underlies sepal epidermal patterning in Arabidopsis thaliana.</a> PLoS Biol. 8 (5), e1000367 (2010).</li><li>Heisler, M. G., Ohno, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-imaging+of+the+Arabidopsis+inflorescence+meristem.">Live-imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem.</a> Methods Mol. Biol. 1110, 431-440 (2014).</li><li>Tobin, C. J., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Lineage+Analysis+to+Study+Cell+Division+Orientation+in+the+Arabidopsis+Shoot+Meristem.">Real-Time Lineage Analysis to Study Cell Division Orientation in the Arabidopsis Shoot Meristem.</a> Methods Mol. Biol. 1370, 147-167 (2016).</li><li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+flower+development+in+Arabidopsis.">Early flower development in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 2 (8), 755-767 (1990).</li><li>Prunet, N., Jack, T. P., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+confocal+imaging+of+Arabidopsis+flower+buds.">Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds.</a> Dev. Biol. , (2016).</li><li>Fernandez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+plant+growth+in+4D:+robust+tissue+reconstruction+and+lineaging+at+cell+resolution.">Imaging plant growth in 4D: robust tissue reconstruction and lineaging at cell resolution.</a> Nat. Methods. , (2010).</li><li>Cutler, S. R., Ehrhardt, D. W., Griffitts, J. S., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+GFP::cDNA+fusions+enable+visualization+of+subcellular+structures+in+cells+of+Arabidopsis+at+a+high+frequency.">Random GFP::cDNA fusions enable visualization of subcellular structures in cells of Arabidopsis at a high frequency.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97 (7), 3718-3723 (2000).</li><li>Irish, V. F., Sussex, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+the+apetala-1+gene+during+Arabidopsis+floral+development.">Function of the apetala-1 gene during Arabidopsis floral development.</a> Plant Cell. 2 (8), 741-753 (1990).</li><li>Vernoux, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+auxin+signalling+network+translates+dynamic+input+into+robust+patterning+at+the+shoot+apex.">The auxin signalling network translates dynamic input into robust patterning at the shoot apex.</a> Mol. Systems Biol. 7, 508 (2011).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+plant+stem+cell+function+by+conserved+interacting+transcriptional+regulators.">Control of plant stem cell function by conserved interacting transcriptional regulators.</a> Nature. 517 (7534), 377-380 (2015).</li><li>Barbier de Reuille, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MorphoGraphX:+A+platform+for+quantifying+morphogenesis+in+4D.">MorphoGraphX: A platform for quantifying morphogenesis in 4D.</a> Elife. 4, 05864 (2015).</li><li>Barbier de Reuille, P. B., Robinson, S., Smith, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+cell+shape+and+gene+expression+in+the+shoot+apical+meristem+using+MorphoGraphX.">Quantifying cell shape and gene expression in the shoot apical meristem using MorphoGraphX.</a> Methods Mol. Biol. 1080, 121-134 (2014).</li></ol>

المؤلف ليس لديه ما يكشف.

هنا، ونحن نقدم بروتوكول لتصوير الحية، وتطوير براعم زهرة نبات الأرابيدوبسيس مع المجهر متحد البؤر وعدسة المياه غمس. في حين أن هذا يمكن أن يتم إما تستقيم أو مجهر مقلوب، هو أسهل وأسرع لاستخدام السابق. ومن الجدير بالذكر أيضا أن أنظمة متحد البؤر مختلفة تتفاوت تفاوتا كبيرا من حيث السرعة، والحساسية، والقدرة على فصل موجات. أفضل المجاهر متحد البؤر تسمح الآن إلى صورة عدة قنوات مختلفة (على سبيل المثال GFP، YFP، عن dsRed ويوديد propidium، الشكل 2G) في نفس العينات. وقد تم تجهيز بعض مجهر بؤري مع كشف الطيفي، والتي يمكن جمع مضان من عدة fluorophores في وقت واحد وفصلها بعد ذلك. عند استخدام جهاز كشف منتظم، إلا أن مجموعة من أجهزة الليزر والمرشحات يجب أن تستخدم لإثارة وفصل مضان من fluorophores مختلفة. بعض fluorophores لها أطياف الانبعاث واضح تماما (على سبيل المثال لCFPد YFP)، ويمكن تصوير في وقت واحد. fluorophores الأخرى لديها أطياف الانبعاث متداخلة جزئيا (على سبيل المثال GFP وYFP)، وعادة ما تحتاج للتصوير على حدة، مما يزيد من وقت التصوير. تصوير fluorophores وثيقة أيضا غالبا ما يتطلب تقييد كم من الطيف التي يتم جمعها لكل قناة لمنع مضان من fluorophore واحد من التسرب إلى قناة أخرى. هذا يؤدي إلى فقدان كثافة الإشارة التي تم جمعها، والتي يمكن أن تعوض زيادة في قوة الليزر واكتساب. ومع ذلك، لفترة طويلة وقت التصوير وزيادة قوة الليزر قد التبييض و / أو تلف العينة. زيادة قوة الليزر و / أو مكاسب قد يزيد أيضا من الضوضاء في الخلفية. يتم تعظيم الاستفادة من كثافة إشارة، قرار ووقت التصوير لكل عينة من خلال عملية التجربة والخطأ، وينطوي على المقايضات دائمة. يشرح هذا البروتوكول كيفية إجراء التصوير متحد البؤر حية من براعم الزهور تطوير على الجناحين لقمة تبادل لاطلاق النار تشريح. هذاويمكن القول أن كون قمة تبادل لاطلاق النار غير متصل بقية النبات وينمو في المتوسط ​​تحتوي على سيتوكينين قد تؤثر SAM والتنمية زهرة. ومع ذلك، تم تصميم هذه الوسيلة تجريبيا من خلال عملية التجربة والخطأ لضمان تبادل لاطلاق النار تشريح الخلايا الإنشائية قمية تنتج براعم الزهور الجديدة في فترة تتابع النمو الطبيعي، وأن هذه براعم الزهور تتطور عادة 15. وبالمثل، لا يظهر تشريح SEPAL أن تؤثر على أنماط التعبير الجيني أو تطوير ما تبقى من الزهور. البروتوكولات الأخرى بالتفصيل كيفية تنفيذ التصوير متحد البؤر المباشر لSAM لا تزال تعلق على بقية النباتات (مثل مرجع 11). ويمكن تكييف هذه البروتوكولات ل، وتقدم بديلا مفيدا للتصوير تطوير الزهور، وخاصة عند دراسة العمليات المتعلقة سيتوكينين. وهي تطرح عدة عيوب ولكن: ويستطيل الجذع والتقلبات، وتغيير اتجاه براعم الزهور. االثانية حين التصوير لقمة تبادل لاطلاق النار تعلق على بقية مصنع يعمل بشكل جيد مع المجهر تستقيم، هو أكثر تعقيدا بكثير للقيام بذلك مع مجهر مقلوب. العدسات الغمر لها الفتحة العددية أفضل (NA) من العدسات &quot;الجافة&quot; (أي العدسات التي يتم فصلها من العينة عن طريق الجو)، وبالتالي توفر قرار أدق من العينة، وهو أمر حاسم عند استخدام المجهر متحد البؤر. باستخدام عدسة المياه غمس مما يوفر NA أفضل بكثير من عدسة الجافة، في حين منع قمة تبادل لاطلاق النار من التجفيف أثناء عملية التصوير. في حين الجليسرين والعدسات النفط لها NA حتى أعلى من العدسات الماء، وأنها تتطلب استخدام ساترة، وهو غير عملي جدا مع عينة حجم قمة تبادل لاطلاق النار، والتي تحافظ أيضا نموا خلال التجارب مرور الزمن. نظرا لحجم العينات (اعتمادا على مراحل الأزهار، ويمكن أن يكون أكوام أكثر من 150 ميكرون سميكة)، فمن المهم أيضا أن استخدام العدسات مع مسافة العمل الطويلة. ونحن عادة استخدام عدسة 20 أو 40X مع NA من 1 ومسافة العمل من 1،7-2،5 مم. برنامج المجهر متحد البؤر يوفر عدة طرق لتصور البيانات متحد البؤر، بما في ذلك إعادة بناء ثلاثية الأبعاد (الشكل 2، B1، B2 و B4) والآراء شريحة (الشكل 2، B3). في حين أن وجهات النظر الأكثر شيوعا ثلاثية الأبعاد هي أقصى التوقعات كثافة مبائر Z-مداخن (الشكل 2، B1 و B4)، بعض البرامج (مثل ZEN وImaris) تقديم وجهات النظر الشفافية التي بتصفية إشارة من أعمق أجزاء من العينة (الشكل 2، B2)، والتي يمكن أن تكون مفيدة عند النظر في العمليات التي تجري، أو الجينات التي أعرب عنها في وطبقة البشرة. كثافة إشارة إما أن تكون مشفرة مع لون واحد (الشكل 2، B1)، وذلك باستخدام بكسل الأسواق العالمية ضغطهاnsity، أو باستخدام رمز اللون (الشكل 2، B4). يعيش التصوير متحد البؤر يوفر ليس فقط الأفكار النوعية قيمة في التنمية زهرة، كما أنه يحتمل أن يوفر علماء البيولوجيا التطورية مع ثروة من البيانات الكمية. برامج مختلفة (على سبيل المثال Imaris، فيجي، MARS-ALT، MorphographX 15، 20، 21) يسمح لتقدير عدد أو حجم الخلايا معربا عن واحد أو عدة صحفيين، أو على مستوى التعبير مراسل في خلايا مختلفة. ويمكن أيضا أن مثل هذه البرامج يمكن استخدامها لتنفيذ تجزئة الخلية التلقائي، وتتبع الأنساب الخلايا وقياس النمو. هذا البرنامج يقدم أدوات مختلفة مماثلة، ولكنه يختلف أيضا في نواح كثيرة. تم تصميم MARS-ALT وMorphoGraphX خصيصا للمحطات 15، 20، 21، على عكس Imaris لالثانية فيجي. MorphoGraphX ​​يسمح فقط للتجزئة وتحليل طبقة البشرة، في حين Imaris وMARS-ALT تسمح للتجزئة وتحليل العينة كلها. ومع ذلك، MARS-ALT يتطلب التصوير مسبق من نفس العينة من ثلاث زوايا مختلفة 15، وImaris يتطلب سوى كومة واحدة. الوصول إلى المعلومات الكمية أمر بالغ الأهمية لزيادة فهمنا للتنمية زهرة.

معظم جسم النبات يشكل بعد embryonically من مجموعات من الخلايا الجذعية تقع في أو بالقرب من الحافة - أو الخلايا الإنشائية قمية - من يطلق النار والجذور. جميع الهياكل فوق الأرض من النبات الكبار مستمدة من تبادل لاطلاق النار النسيج الإنشائي القمي (SAM)، التي تنتج بشكل مستمر أجهزة الجانبية على جنباته: يغادر خلال المرحلة الخضرية، والخلايا الإنشائية زهرة (وزراء الخارجية) بعد أن التحولات إلى المرحلة الإنجابية. وزراء خارجية بدورها تتطور إلى الزهور. في حين أن نبات الأرابيدوبسيس SAM تنتج أجهزة الجانبية واحد في كل مرة، في، ونمط دوامة متكررة، وزراء خارجية تنتج أربعة أنواع من الأعضاء الزهرية في غضون أربعة جدلات، بطريقة متزامنة جزئيا، مع البرامج التنموية متعددة يتفكك في وقت واحد. تم الشبكات الوراثية الكامنة وراء تحديد هوية الأعضاء الزهرية مختلفة فك شفرتها جزئيا (للاستعراض، انظر المراجع 1 و 2)، ولكن العديد من جوانب الإنمائية لل زهرةالإقليم الشمالي، مثل تحديد المواقع الجهاز الأزهار وتعريف الحدود بين جدلات، لا تزال غير مفهومة. الدراسات الجينية الجزيئية الأولى من تطوير محطة تعتمد في الغالب على تقنيات مثل التهجين في الموقع وصحفيين المكتب المركزي للاحصاءات لتحليل التعبير الجيني. في حين أن هذه الطرق قد وفرت ثروة من المعلومات وساهمت في فهمنا لنمو النبات والتنمية زهرة إلى حد كبير، وهناك قيود هامة: أنها تفتقر إلى قرار الخلوي جيد، لا تسمح لمراقبة سهلة من نمط التعبير عن جينات متعددة في نفس العينات، والأهم من ذلك، يمكن أن ينطبق إلا على الميت الأنسجة الثابتة. والتغلب على التطورات الحديثة في الفحص المجهري متحد البؤر هذه القيود، وتوفير علماء البيولوجيا التطورية مع أداة قوية للتحقيق في العمليات الأساسية التشكل النبات. على وجه الخصوص، متحد البؤر المجهري يسمح لمراقبة الأنسجة والأعضاء الحية في جميع أنحاء تشكيلها، وهو جritical إلى فهم كامل عملية ديناميكية جوهري مثل التنمية. وقد استخدم التصوير متحد البؤر الحية على نطاق واسع لتحليل نمو الجوي من النباتات وإنتاج أجهزة الجانبية من قبل SAM (على سبيل المثال يحيل الى 3، 4، 5، 6)، ولكن باستثناء عدد قليل من التقارير (مثل الإشارات 7، 8، 9، 10)، لم يتم تطبيقها على نطاق واسع لدراسة تطوير زهرة. هي بروتوكولات التصوير متحد البؤر المباشر لSAM المتاحة (مثل يحيل الى 11، 12)، وتوفر قاعدة جيدة لكيفية صورة براعم الزهور النامية التي تحيط SAM. ومع ذلك، براعم الزهور التصوير تقدم تحديات محددة: على سبيل المثال،براعم الزهور تصبح بسرعة أكبر من SAM، وفي المرحلة 4، كأسية تبدأ تغطي FM (مراحل كما هو موضح في اشارة 13)، ويعتم مضان من وراء الأنسجة (الشكل 2A). هنا، ونحن نقدم بروتوكول مفصلة تشرح كيفية تنفيذ الحية التصوير متحد البؤر على تطوير نبات الأرابيدوبسيس براعم الزهور باستخدام إما تستقيم أو مجهر مقلوب وعدسة المياه غمس. نشرنا سابقا هذا البروتوكول في اشارة 14.

<table><tbody><tr><td>Forceps&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72701-D</td><td>Dumont Style 5 Inox, for apex dissection</td></tr><tr><td>Pin Vise</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>13560</td><td>80 cm long, for sepal ablation</td></tr><tr><td>Straight Stainless Steel Needles&amp;nbsp;</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>13561-50</td><td>0.1 mm Diameter, 1.2 cm long, for sepal ablation</td></tr><tr><td>Round plastic boxes</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>64332</td><td>transparent, 6 cm diameter, 2 cm deep, to use as dissecting dishes</td></tr><tr><td>Rectangular hinged boxes</td><td>Durphy Packaging Co.&amp;nbsp;</td><td>DG-0730</td><td>transparent, 2-7/8&amp;rdquo; long, 2&amp;rdquo; wide, 1-1/4&amp;rdquo; deep, to use as imaging dishes with an upright microscope</td></tr><tr><td>Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile</td><td>VWR</td><td>25382-064</td><td>transparent, 3.5 cm diameter, 1 cm deep,to use as imaging dishes with an inverted microscope</td></tr><tr><td>P10 and P1000 pipettes&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>with corresponding filter tips</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td></td><td></td><td>with an 80-90X maximum magnification</td></tr><tr><td>Laser ablation system</td><td></td><td></td><td>for sepal ablation</td></tr><tr><td>Laser scanning confocal microscope system</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 or 40X water-dipping lens</td><td></td><td></td><td>with a NA of 1 and a working distance of 1.7-2.5 mm</td></tr><tr><td>Agarose</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murashige and Skoog basic salt mixture</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td>without vitamins</td></tr><tr><td>Myo-inositol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7508</td><td>vitamin</td></tr><tr><td>Nicotinic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0761</td><td>vitamin</td></tr><tr><td>Pyridoxine hydrochloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6280</td><td>vitamin</td></tr><tr><td>Thiamine hydrochloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1270</td><td>vitamin</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8790</td><td>vitamin</td></tr><tr><td>N6-Benzyladenine&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3408</td><td>BAP, a cytokinin</td></tr><tr><td>Propidium iodide solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864</td><td>1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls</td></tr><tr><td>FM4-64</td><td>Invitrogen</td><td>F34653</td><td>dilute in water to 80&amp;nbsp;&amp;mu;g/mL, to stain the plasma membranes</td></tr></tbody></table>

live confocal imaging of developing arabidopsis flowers

وقد اعتمدت الدراسة نمو النبات والتنمية طويلة على تقنيات تجريبية باستخدام الميتة والأنسجة الثابتة وتفتقر إلى قرار الخلوي السليم. التطورات الحديثة في الفحص المجهري متحد البؤر، جنبا إلى جنب مع تطوير العديد من fluorophores، والتغلب على هذه القضايا وفتح إمكانية لدراسة التعبير عن جينات عدة في وقت واحد، مع قرار الخلوي جيد، في عينات حية. يوفر العيش التصوير متحد البؤر علماء الأحياء النباتية مع أداة قوية لدراسة التنمية، واستخدمت على نطاق واسع لدراسة نمو الجذور وتشكيل أجهزة الجانبية على الجناحين تبادل لاطلاق النار النسيج الإنشائي القمي. ومع ذلك، لم يتم تطبيقها على نطاق واسع لدراسة تطوير زهرة، ويرجع ذلك جزئيا إلى التحديات التي تخص التصوير الزهور، مثل كأسية التي تنمو على النسيج الإنشائي زهرة، وتصفية مضان من الأنسجة الكامنة. هنا، نقدم بروتوكول مفصل لأداء الحي التصوير متحد البؤر على الهواء مباشرة، وتطوير العربيةidopsis براعم الزهور، وذلك باستخدام إما تستقيم أو مجهر مقلوب.

ويبين الشكل 2 وجهات نظر مختلفة من مبائر Z-أكوام من العيش براعم زهرة نبات الأرابيدوبسيس التعبير عن مختلف الجينات مراسل الفلورسنت، وملطخة إما يوديد propidium (الشكل 2، A-C5 وG) أو FM4-64 (الشكل 2، E1-F) ل تقديم مشروع قرار الخلوية واضح. معظم أنظمة مبائر تسمح للتصوير اثنين fluorophores مع عدم تداخل الأطياف الانبعاثات مثل GFP أو YFP مع أي من يوديد propidium أو FM4-64 (الشكل 2A - 2F). نظم أفضل متحد البؤر هي أيضا قادرة على فصل fluorophores متعددة مع أطياف الانبعاث متداخلة جزئيا في نفس العينات، مثل GFP وYFP، وعن dsRed ويوديد propidium (الشكل 2G). وتعرض ثلاثة أمثلة من تجارب الوقت الفاصل في الشكل2 وتظهر براعم الزهور النامية عادة بعد إجراء الاستئصال SEPAL إما مع نظام الاستئصال بالليزر (الشكل 2، C1-C5 وD1-D5) أو يدويا مع دبوس ملزمة ومسمار معدني (الشكل 2، E1-E2). لاحظ أن برعم زهرة هو مبين في الشكل 2، E1-E2 هو من نبات متحولة سوبرمان-1، وهذا هو السبب لم يتم الالتزام براعم خباء في وسط برعم في مرحلة 7. ليزر الاجتثاث من براعم SEPAL الناشئة في برعم زهرة هو مبين في الشكل 2، C1-C5 يمنعهم من تغطية FM، التي لا يزال من الممكن تصويرها في المرحلة 5 (الشكل 2، C5). على العكس من ذلك، في حالة برعم زهرة هو مبين في الشكل 2، D1-D5، الاستئصال بالليزر تأخر النمو فقط سيبال، ولكن كأسية نما في نهاية المطاف لتغطية معظم FM من المرحلة 5 (الشكل 2، D5 </قوية&gt;). على العكس من ذلك، إذا تم استخدام الكثير من السلطة ليزر ومسكن وقت خلال الاستئصال بالليزر، وينتشر الأضرار التي لحقت الجزء المركزي من زهرة ويؤثر على نموها، وأحيانا يؤدي إلى وفاة لاحق من برعم زهرة كله. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/55156/55156fig2.jpg" /> الشكل 2: تصور مبائر Z-أكوام من براعم الزهور الحية. A و B2 وجهات نظر الشفافية؛ B1 و B4-G هي أقصى التوقعات كثافة. B3 هو وجهة نظر شريحة متعامد. (A - E2) الزهور تعبر عن مراسل فينوس لجين APETALA3 (الأخضر)؛ كانت ملطخة جدران الخلايا مع يوديد propidium (أحمر، باستثناء B4 والأخضر). (A) الإزهار. الأرقام تشير إلى مراحل الأزهار. كأسية في المرحلة 4 و 5 الزهور تصفية مضان لمراسل الزهرة، التي عادة FOالتربيعي حلقة. لاحظ أن بعض براعم الزهور تبدو مائلة مقارنة الإزهار. (B1 - B4) أربعة وجهات نظر مختلفة من نفس متحد البؤر Z-كومة من برعم مرحلة 5 زهرة: أقصى التوقعات كثافة (B1 و B4) مع فينوس كثافة إشارة مشفرة مع كثافة بكسل في اللون الأخضر (B1) أو مع رمز اللون النار (B4، يظهر رمز اللون في الجزء السفلي من لوحة)؛ عرض الشفافية (B2) وعرض شريحة متعامد (B3، يشار إلى التوجه XY، XZ وYZ من شرائح في لوحة). (C1 - C5) 4 أيام الوقت الفاصل بين برعم زهرة فردية من المرحلة 3 إلى المرحلة 5؛ أداء تذرية ليزرية (وضعت الصفات البيضاء) في يوم 1 و 3 أيام كانت كافية لمنع كأسية من تغطية وسط برعم زهرة في مرحلة 5. (D1 - D5) 4 أيام الوقت الفاصل بين برعم زهرة فردية من المسرح3 مرحلة 5؛ كانت تذرية ليزرية أجريت يوم 1 و 2 و 3 كافية لمنع كأسية من تغطية وسط برعم زهرة. (E1 - E2) الفردية برعم زهرة بعد الإزالة اليدوية للمجافي المحور وكأسية متجه نحو المحور (E1)، وجميع كأسية (E2)؛ وتشير السهام البيضاء كأسية المتبقية. وتشير العلامات النجمية البيضاء الندوب الناتجة عن إزالة كأسية. (F) المرحلة 7 زهرة apetala1-1 تعبر عن مراسل DR5-3xVenusN7 18 (الأخضر)؛ كانت ملطخة أغشية البلازما مع FM4-64 (الأحمر)؛ وتشير السهام الزرقاء هياكل تشبه أوراق التي تحل محل كأسية ولا تغطي برعم زهرة. (G) المرحلة 4 برعم زهرة تعبر عن مراسل GFP الفلورسنت لDORNROSCHEN مثل 7 (الأخضر)، وهو مراسل فينوس لسوبرمان (الحمراء)، ومراسل لعن dsRed CLAVATA3 19 (السماوي). خلاياكانت ملطخة الجدران مع يوديد propidium (الرمادي). د: اليوم؛ أولا: المرحلة. الحانات النطاق = 25 ميكرون. المقياس هو متطابقة في B1، B2 وB4، في C1-C5 وفي D1-D5. تم تعديل هذا الرقم من إشارة 14. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55156/55156fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers at JoVE.com

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

يوفر العيش التصوير متحد البؤر علماء الأحياء مع أداة قوية لدراسة التنمية. هنا، نقدم بروتوكول مفصل عن التصوير متحد البؤر المباشر لتطوير الزهور نبات الأرابيدوبسيس.

يعيش متحد البؤر التصوير من تطوير نبات الأرابيدوبسيس الزهور

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

live-confocal-imaging-of-developing-arabidopsis-flowers

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

14.8K Views.  California Institute of Technology.  يوفر العيش التصوير متحد البؤر علماء الأحياء مع أداة قوية لدراسة التنمية. هنا، نقدم بروتوكول مفصل عن التصوير متحد البؤر المباشر لتطوير الزهور نبات الأرابيدوبسيس. 

Video: Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the flexible and efficient GreenGate cloning system with the proven and benchmarked LhGR system (here termed GR-LhG4) for the inducible expression, we have generated a set of transgenic Arabidopsis lines that can drive the expression of an effector cassette in a range of specific cell types in the three main plant meristems. To this end, we chose the previously developed GR-LhG4 system based on a chimeric transcription factor and a cognate pOp-type promoter ensuring tight control over a wide range of expression levels. In addition, to visualize the expression domain where the synthetic transcription factor is active, an ER-localized mTurquoise2 fluorescent reporter under control of the pOp4 or pOp6 promoter is encoded in driver lines. Here, we describe the steps necessary to generate a driver or effector line and demonstrate how cell type specific expression can be induced and followed in the shoot apical meristem, the root apical meristem and the cambium of Arabidopsis. By using several or all driver lines, the context specific effect of expressing one or multiple factors (effectors) under control of the synthetic pOp promoter can be assessed rapidly, for example in F1 plants of a cross between one effector and multiple driver lines. This approach is exemplified by the ectopic expression of VND7, a NAC transcription factor capable of inducing ectopic secondary cell wall deposition in a cell autonomous manner.

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Here, we describe the generation and application of a set of transgenic Arabidopsis thaliana lines enabling inducible, tissue-specific expression in the three main meristems, the shoot apical meristem, the root apical meristem, and the cambium.

إيندوسيبلي، الخلية المحددة بنوع التعبير في نبات التمويل "عن طريق لحجر" بوساطة ترانس-التنشيط

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

Genetics

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, early stage plant embryos are small and contain few cells, making them difficult to observe and analyze. A method is described here for characterizing pattern formation in plant embryos under a microscope using the model organism Arabidopsis. Following the clearance of fresh ovules using Hoyer's solution, the cell number in and morphology of embryos could be observed, and their developmental stage could be determined by differential interference contrast microscopy using a 100X oil immersion lens. In addition, the expression of specific marker proteins tagged with Green Fluorescent Protein (GFP) was monitored to annotate cell identity specification during embryo patterning by confocal laser scanning microscopy. Thus, this method can be used to observe pattern formation in wild-type plant embryos at the cellular and molecular levels, and to characterize the role of specific genes in embryo patterning by comparing pattern formation in embryos from wild-type plants and embryo-lethal mutants. Therefore, the method can be used to characterize embryogenesis in Arabidopsis.

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

This protocol outlines a method for observing embryogenesis in Arabidopsis via ovule clearance followed by the inspection of embryo pattern formation under a microscope.

أسلوب لوصف امبريوجينيسيس في نبات

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic development. The activity and morphology of SAMs determine important agronomic traits, such as shoot architecture, size and number of reproductive organs, and most importantly, grain yield. Here, we provide a detailed protocol for analyzing both the surface morphology and the internal cellular structure of the living SAMs from different species through laser scanning confocal microscope. The whole procedure from the sample preparation to the acquisition of high resolution three-dimensional (3D) images can be accomplished within as short as 20 minutes. We demonstrate that this protocol is highly efficient for studying not only the inflorescence SAMs of the model species but also the vegetative meristems from different crops, providing a simple but powerful tool to study the organization and development of meristems across different plant species.

This protocol presents how to live image and analyze the shoot apical meristems from different plant species using laser scanning confocal microscopy.

[كنفوكل] تصوير مباشر من تبادل لإطلاق النار قمية الخلايا الإنشائية من الأنواع النباتية المختلفة

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in molecular and imaging technologies allowed us to gain insights into how biochemical signals influence morphogenetic events. However, it is increasingly evident that apart from biochemical signals, mechanical cues also impact several aspects of cell and tissue growth. The Arabidopsis shoot apical meristem (SAM) is a dome-shaped structure responsible for the generation of all aboveground organs. The organization of the cortical microtubule cytoskeleton that mediates apoplastic cellulose deposition in plant cells is spatially distinct. Visualization and quantitative assessment of patterns of cortical microtubules are necessary for understanding the biophysical nature of cells at the SAM, as cellulose is the stiffest component of the plant cell wall. The stereotypical form of cortical microtubule organization is also a consequence of tissue-wide physical forces existing at the SAM. Perturbation of these physical forces and subsequent monitoring of cortical microtubule organization allows for the identification of candidate proteins involved in mediating mechano-perception and transduction. Here we describe a protocol that helps investigate such processes.

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

Here we describe a protocol for live cell imaging of the cortical microtubule cytoskeleton at the shoot apical meristem and monitoring its response to changes in physical forces.

حية الخلية التصوير من Microtubule Cytoskeleton والتلاعب micromechanical من عربيدوبسيس تبادل لاطلاق النار Apical Meristem

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of plant leaves or vertebrate lungs further difficulties arise from multiple transitions in refractive index between cellular components, between cells and airspaces and between the biological tissue and the rest of the optical system. Moreover, refractive index mismatches lead to attenuation of fluorophore excitation and signal emission in fluorescence microscopy. We describe here the application of the perfluorocarbon, perfluorodecalin (PFD), as an infiltrative imaging medium which optically improves laser scanning confocal microscopy (LSCM) sample imaging at depth, without resorting to damaging increases in laser power and has minimal physiological impact2. We describe the protocol for use of PFD with Arabidopsis thaliana leaf tissue, which is optically complex as a result of its structure (Figure 1). PFD has a number of attributes that make it suitable for this use3. The refractive index of PFD (1.313) is comparable with that of water (1.333) and is closer to that of cytosol (approx. 1.4) than air (1.000). In addition, PFD is readily available, non-fluorescent and is non-toxic. The low surface tension of PFD (19 dynes cm-1) is lower than that of water (72 dynes cm-1) and also below the limit (25 - 30 dyne cm-1) for stomatal penetration4, which allows it to flood the spongy mesophyll airspaces without the application of a potentially destructive vacuum or surfactant. Finally and crucially, PFD has a great capacity for dissolving CO2 and O2, which allows gas exchange to be maintained in the flooded tissue, thus minimizing the physiological impact on the sample. These properties have been used in various applications which include partial liquid breathing and lung inflation5,6, surgery7, artificial blood8, oxygenation of growth media9, and studies of ice crystal formation in plants10. Currently, it is common to mount tissue in water or aqueous buffer for live confocal imaging. We consider that the use of PFD as a mounting medium represents an improvement on existing practice and allows the simple preparation of live whole leaf samples for imaging.

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

We describe the use of perfluorodecalin as an infiltrative mounting medium. This is a simple method for improving depth of imaging in Arabidopsis thaliana leaf tissue with minimal physiological impact.

طريقة بسيطة للتصوير Arabidopsis يغادر طريق Perfluorodecalin كوسيط التصوير إختراقي

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

Biology

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

تحليل خلية معينة من<em&gt; ل arabidopsis</em&gt; يترك طريق الإسفار خلية المنشط الفرز

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

على المدى الطويل، عالية الدقة الفاصل الزمني متحد البؤر التصوير من<em&gt; الطفلق ل arabidopsis</em&gt; البشرة خلال إنبات

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ binding proteins that initiate Ca2+ signaling cascades. However, we still know little about how stimulus specific Ca2+ signals are generated. The specificity of a Ca2+ signal may be attributed to the sophisticated regulation of the activities of Ca2+ channels and/or transporters in response to a given stimulus. To identify these cellular components and understand their functions, it is crucial to use systems that allow a sensitive and robust recording of Ca2+ signals at both the tissue and cellular levels. Genetically encoded Ca2+ indicators that are targeted to different cellular compartments have provided a platform for live cell confocal imaging of cellular Ca2+ signals. Here we describe instructions for the use of two Ca2+ detection systems: aequorin based FAS (film adhesive seedlings) luminescence Ca2+ imaging and case12 based live cell confocal fluorescence Ca2+ imaging. Luminescence imaging using the FAS system provides a simple, robust and sensitive detection of spatial and temporal Ca2+ signals at the tissue level, while live cell confocal imaging using Case12 provides simultaneous detection of cytosolic and nuclear Ca2+ signals at a high resolution.

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Ca2+ signaling regulates diverse biological processes in plants. Here we present approaches for monitoring abiotic stress induced spatial and temporal Ca2+ signals in Arabidopsis cells and tissues using the genetically encoded Ca2+ indicators Aequorin or Case12.

قياس المكانية والزمانية كاليفورنيا<sup&gt; 2+</sup&gt; إشارات في النباتات نبات الأرابيدوبسيس

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed &#8216;residence time&#8217;) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

The goal of this protocol is to demonstrate how to monitor fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces with variable-angle epifluorescence microscopy, showing blinking dots of GFP-tagged PATROL1, a membrane trafficking protein, in the cell cortex of the stomatal complex in Arabidopsis thaliana.

التصوير في الوقت الحقيقي من النبات خلية سطح حيوية مع زاوية المتغير المجهر epifluorescence

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is regulated spatially and temporally. The use of a fluorescent gene under the control of an immunity-related promoter in combination with an automated fluorescence microscopy is a simple way to understand spatiotemporal regulation of plant immunity. In contrast to the root tissues that have been used for a number of various intravital fluorescent imaging experiments, there exist few fluorescent live-imaging examples for the leaf tissues that encounter an array of airborne microbial infections. Therefore, we developed a simple method to mount leaves of Arabidopsis thaliana plants for live-cell imaging over an extended period of time. We used transgenic Arabidopsis plants expressing the yellow fluorescent protein (YFP) genefused to the nuclear localization signal (NLS) under the control of the promoter of a defense-related marker gene, Pathogenesis-Related 1 (PR1). We infiltrated a transgenic leaf with Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (avrRpt2) strain (Pst_a2) and performed in vivo time-lapse imaging of the YFP signal for a total of 40 h using an automated fluorescence stereomicroscope. This method can be utilized not only for studies on plant immune responses but also for analyses of various developmental events and environmental responses occurring in leaf tissues.

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

We report a simple and versatile method for performing fluorescent live-imaging of Arabidopsis thaliana leaves over an extended period of time. We use a transgenic Arabidopsis plant expressing a fluorescent reporter gene under the control of an immunity-related promoter as an example for gaining spatiotemporal understanding of plant immune responses.

أسلوب متعدد الاستخدامات لتركيب نبات يترك لتصوير الوقت الفاصل بين إينترافيتال

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...

يعيش متحد البؤر التصوير من تطوير نبات الأرابيدوبسيس الزهور

Summary

Explore More Videos