This work supported by research grant funding from the Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) of Canada, the Ontario Institute for Cancer Research (OICR, #P.SI.015.8), and the Canadian Cancer Society (CCS, #703857). The authors acknowledge the contributions of Dr. Denis Snider who provided assistance in preparing the manuscript.

تمت الموافقة على الدراسات الحيوانية البحوث مجلس الحيوان الأخلاق في جامعة ماكماستر وفقا للمجلس الكندي للرعاية الحيوان (CCAC) المبادئ التوجيهية. 1. Radiolabeling من الليجندات TZ-ثلاثي الشعب مع 99m ح تنبيه: تتطلب الإجراءات التالية استخدام المركبات المشعة. وينبغي أن يتم العمل إلا في مختبر مرخص مع الالتزام بأنظمة السلامة والتخلص منها. يجب أن يتم تنفيذ ردود الفعل الميكروويف في الميكروويف مصممة خصيصا لتركيب الكيميائي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توليف [99m ح (CO) 3 (H 2 O) 3] + 19، 20 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في قارورة الميكروويف، والجمع بين 8 ملغ K 2 [BH 3 CO 2]، 15 ملغ نا 2 CO 3، 20 ملغ نا 2 B 4 O 7 · 10H 2 O، و 25 ملغ KOCO [CH (OH)]2 COONa · 4H 2 O. تطهير القارورة لمدة 10 دقيقة مع غاز الأرجون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 4 مل من 99m TCO 4 - (~ 1100 من MBq، ~ 30 MCI) في المياه المالحة 0.9٪ إلى القارورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حرارة التفاعل في الميكروويف لمدة 3.5 دقيقة في 110 درجة مئوية بعد 10 ثانية من التحريك لضمان خلط دقيق من الكواشف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط درجة الحموضة من الحل إلى 3.5-4 باستخدام ~ 400 ميكرولتر من 1 M حمض الهيدروكلوريك. تحقق من استخدام ورقة الرقم الهيدروجيني. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Radiolabeling من Tetrazine بروابط 1-5 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل 2 ملغ من كل يجند (مركبات 1-5) في 250 ميكرولتر MeOH 21. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 250 ميكرولتر من [99m ح (CO) 3 (H 2 O) 3] + (~ 74 من MBq، ~ 2 MCI) إلى كل حل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسخين خليط التفاعل باستخدام الميكروويف لمدة 20 دقيقة عند 60 درجة مئوية. ملاحظة: هذه خطوة مماثلة لجميع tetrazines 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بالنسبة لمركبات 2- 5، تتبخر المذيبات وإعادة dissolلقد المنتجات الناشئة في 1 مل 1: 1 ت / ت DCM: TFA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسخين منتجات التفاعل المنحل (2-5) في 60 درجة مئوية في الميكروويف لمدة 6 دقائق (2-4) أو 10 دقيقة (5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التبريد لدرجة حرارة الغرفة، تتبخر المذيب باستخدام المبخر (36 ° C، 8 مللي بار، 3 دقائق، 6000 دورة في الدقيقة) وحل مجمع المجففة في 1: 1 إيه سي: H 2 O أو 1: 1 MeOH: H 2 O، قبل تنقية HPLC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية 99m ح المسمى المركبات (1-5)، بما في ذلك فصل المنتج المسمى من يجند tetrazine الخالي من الملصقات، وذلك باستخدام HPLC (C 18 عكس المرحلة). عادة، استخدام التدرج شطف من 30:70 إيه سي: H 2 O (على حد سواء مع 0.1٪ TFA) ل40:60 إيه سي: H 2 O أكثر من 20 دقيقة (18 دقيقة) وC 18 التحليلي عمود 4.6 × 100 مم. استخدام كل من الأشعة فوق البنفسجية (254 نانومتر) والكشف عن أشعة غاما. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أخذ عينة صغيرة من كل منتج وصفت ومقارنة الوقت الاحتفاظ HPLC لأن من شارك في ينجECTED، غير المشعة، ومعيار إعادة المسمى (0.125 ملغ في 20٪ الميثانول-H 2 O). يتم التعرف على المعايير وصفت رد في تتبع الأشعة فوق البنفسجية HPLC، وسوف أزل في نفس الوقت على 99m مجمع المسمى ح-في تتبع γ-HPLC. ويظهر هذا التعاون حقن قمم في أوقات الاحتفاظ مماثلة، الأمر الذي يؤكد هوية 99m مجمع ح المسمى. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتبخر المذيب من الكسور HPLC باستخدام المبخر (36 ° C، 8 مللي بار، 3 دقائق، 6000 دورة في الدقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صياغة مجمع تنقية بتركيز 7.4 كيلو بيكيريل / ميكرولتر في برنامج تلفزيوني، التي تحتوي على 0.5٪ BSA و 0.01٪ توين-80. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لضمان مركبات المسمى مستقرة، إجراء دراسة في المختبر الاستقرار. احتضان مركب وضعت في 37 درجة مئوية لمدة 1 و 4 و 6 ساعات، حقن كمية صغيرة (3.7 من MBq) من الخليط على HPLC في كل نقطة من الوقت لتقييم الاستقرار. </li></ol></li></ol> 2. الدراسات الحيوية التوزيع المستهدف قبل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><lط&gt; التحضير للحيوانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام 7-9 الاسبوع القديمة، إناث الفئران BALB / ج (ن = 3)، إدارة TCO-BP وضعت في المياه المالحة (20 ملغ / كلغ) (5 ميكروغرام / ميكرولتر)، عن طريق حقن الوريد الذيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الماوس في جهاز ضبط النفس الجسدي، والتعرف على الأوردة الموجودة على السطوح الجانبية للذيل والقضاء مع مسحة الكحول. وفي حوالي 2 سم من نهاية الذيل، اضافة الى وجود إبرة عيار 30 في زاوية الضحلة، بالتوازي مع الوريد. خفض ببطء الغطاس لحقن، وإزالة الإبرة وتطبيق الاسفنج الشاش النظيف في موقع الحقن مع الضغط الخفيف حتى يتوقف النزيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في 1 ساعة بعد الحقن من TCO-BP، إدارة ~ 0.74 من MBq (20 μCi) من 99m ح-tetrazine وضعت في 100 ميكرولتر من 0.5٪ BSA، 0.01٪ توين-80 في برنامج تلفزيوني، عن طريق حقن الوريد الذيل. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الدراسات البيولوجية توزيع <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند نقطة زمنية محددة (ر = 6 ساعات)، تخدير الفئران باستخدام 3٪ الأيزوفلورين و 2٪ خليط غاز الأكسجين. إظهار له قرصة الانسحاب على الماوس تخدير للتأكد من أنها تحت الطائرة من التخدير الجراحي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الدم (1 مل) من خلال ثقب في القلب باستخدام حقنة قبل تعامل مع الهيبارين. مكان الماوس على ظهرها مع الأنف في مخروط الأنف لاستمرار التخدير وتحديد عملية الخنجري على الحيوان. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضافة الى وجود إبرة G 25، قليلا إلى اليسار من خط الوسط الحيوان في إطار عملية الخنجري، في زاوية 20 درجة. إدراج تماما الإبرة، وسحب ببطء مرة أخرى على المكبس لرؤية الدم في محور إبرة إذا كان ثقب القلب. قليلا تعدل الإبرة في حين الضغط على المكبس إذا لزم الأمر، لثقب القلب. ببطء سحب الدم إلى المحقنة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الحيوانية خلع عنق الرحم، في حين تحت التخدير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع كل حيوان في كيس من البلاستيك واستخدام المعاير الجرعة (99m وضع ح) لقياس مستوى النشاط الجسم كله. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الأنسجة والسوائل التالية في مرحلة ما قبل تزنإد عد أنابيب: الدم والعظام (الركبة والكتف)، المرارة والكلى والكبد والمعدة (مع المحتويات)، الأمعاء الدقيقة (مع المحتويات)، الأمعاء الغليظة والمصران الأعور (مع المحتويات)، والغدة الدرقية والقصبة الهوائية، المثانة البولية مع البول ، والذيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الأنسجة المناسبة (باستثناء الدم والمرارة والمثانة البولية) في برنامج تلفزيوني لإزالة الدم وصمة عار الجافة قبل وضع الأنسجة في أنابيب العد المناسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الذبيحة في كيس من البلاستيك وقياس المتبقي نشاط الجسم كله باستخدام تدريج الجرعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وزن كل أنبوب يحتوي على عينة الأنسجة. طرح الوزن الأولي من أنبوب للحصول على كتلة من الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام جرعة تدريج (99m وضع ح) لقياس كمية من النشاط في عينة الاختبار (100 ميكرولتر) في وقت لحقن كل فأر. ملاحظة: هذه عينة اختبار تساوي حجم الحقن، مما يعطي العد النشاط في وقت الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في وقت القياس الأنسجة، لliquot 5 ميكرولتر من عينة الاختبار المستخدمة سابقا. استخدام أشعة غاما مضادة متعددة للكشف عن (99m وضع ح) والاعتماد للحصول على العد في الدقيقة (CPM) لاختبار عينة 5 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام اثنين من القيم التي تم الحصول عليها في 2.2.9 و2.2.10 لحساب النشاط والعلاقة CPM باستخدام المعادلة 1 للحصول على عامل التحويل (CPM μCi -1). (1) <img alt="المعادلة 1" src="/files/ftp_upload/55188/55188eq1.jpg" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام العداد جاما لقياس كمية الإشعاع في كل الأنسجة أو عينة السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام المعادلة 1 لحساب كمية النشاط في كل الأنسجة أو السوائل في وقت قياس نسبة إلى مجموع حقن الجرعة. ثم يتم تطبيع هذه القيمة من حيث الوزن الجهاز وذكرت كنسبة مئوية حقن جرعة غرام الواحد (أي٪ ID / ز) من الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتبع الخطوات 2.1.2 إلى 2.2.13 لإجراء تجربة السيطرة السلبية باستخدام 99m ح المسمى بروابط tetrazine في أبسينم من TCO-BP. الفئران التضحية (ن = 3) في 0.5 و 1 و 4 و 6 ساعة بعد الحقن والحصول على الأنسجة أو السوائل كما هو موضح أعلاه. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Jurisson, S. S., Lydon, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+Technetium+Small+Molecule+Radiopharmaceuticals.">Potential Technetium Small Molecule Radiopharmaceuticals.</a> Chem. Rev. 99 (9), 2205-2218 (1999).</li><li>Kluba, C. A., Mindt, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click-to-chelate:+Development+of+Technetium+and+Rhenium-Tricarbonyl+Labeled+Radiopharmaceuticals.">Click-to-chelate: Development of Technetium and Rhenium-Tricarbonyl Labeled Radiopharmaceuticals.</a> Molecules. 18, 3206-3226 (2013).</li><li>Amato, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+Medicines+Conundrum.">Nuclear Medicines Conundrum.</a> Chem. Eng. News. 87 (36), 58-70 (2009).</li><li>Hnatowich, D. J., Virzi, F., Rusckowski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigations+of+Avidin+and+Biotin+for+Imaging+Applications.">Investigations of Avidin and Biotin for Imaging Applications.</a> J. Nucl. Med. 28 (8), 1294-1302 (1987).</li><li>Blackman, M. L., Royzen, M., Fox, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrazine+Ligation:+Fast+Bioconjugation+Based+on+Inverse-Electron-Demand+Diels-Alder+Reactivity.">Tetrazine Ligation: Fast Bioconjugation Based on Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Reactivity.</a> J. Am. Chem. Soc. 130 (41), 13518-13519 (2008).</li><li>Devaraj, N. K., Weissleder, R., Hilderbrand, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrazine-Based+Cycloadditions:+Application+to+Pretargeted+Live+Cell+Imaging.">Tetrazine-Based Cycloadditions: Application to Pretargeted Live Cell Imaging.</a> Bioconjugate Chem. 19 (12), 2297-2299 (2008).</li><li>Rossin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Chemistry+for+Pretargeted+Tumor+Imaging+in+Live+Mice.">In Vivo Chemistry for Pretargeted Tumor Imaging in Live Mice.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 49 (19), 3375-3378 (2010).</li><li>Zeglis, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+Pretargeted+Strategy+for+the+PET+Imaging+of+Colorectal+Carcinoma+via+the+Modulation+of+Radioligand+Pharmacokinetics.">Optimization of a Pretargeted Strategy for the PET Imaging of Colorectal Carcinoma via the Modulation of Radioligand Pharmacokinetics.</a> Mol. Pharmaceutics. 12 (10), 3575-3587 (2015).</li><li>Rossin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Reactive+trans-Cyclooctene+Tags+with+Improved+Stability+for+Diels-Alder+Chemistry+in+Living+Systems.">Highly Reactive trans-Cyclooctene Tags with Improved Stability for Diels-Alder Chemistry in Living Systems.</a> Bioconjugate Chem. 24 (7), 1210-1217 (2013).</li><li>Rossin, R., Robillard, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pretargeted+Imaging+Using+Bioorthogonal+Chemistry+in+Mice.">Pretargeted Imaging Using Bioorthogonal Chemistry in Mice.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 21, 161-169 (2014).</li><li>Denk, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+18F-Labeled+Tetrazine+with+Favorable+Pharmacokinetics+for+Bioorthogonal+PET+Imaging.">Development of a 18F-Labeled Tetrazine with Favorable Pharmacokinetics for Bioorthogonal PET Imaging.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 53 (36), 9655-9659 (2014).</li><li>Herth, M. M., Andersen, V. L., Lehel, S., Madsen, J., Knudsen, G. M., Kristensen, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+11C-labeled+Tetrazine+for+Rapid+Tetrazine-Trans-Cyclooctene+Ligation.">Development of a 11C-labeled Tetrazine for Rapid Tetrazine-Trans-Cyclooctene Ligation.</a> Chem. Commun. 49 (36), 3805-3807 (2013).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrazine-Trans-Cyclooctene+Ligation+for+the+Rapid+Construction+of+18F+Labeled+Probes.">Tetrazine-Trans-Cyclooctene Ligation for the Rapid Construction of 18F Labeled Probes.</a> Chem. Commun. 46 (42), 8043 (2010).</li><li>Nichols, B., Qin, Z., Yang, J., Vera, D. R., Devaraj, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=68Ga+Chelating+Bioorthogonal+Tetrazine+Polymers+for+the+Multistep+Labeling+of+Cancer+Biomarkers.">68Ga Chelating Bioorthogonal Tetrazine Polymers for the Multistep Labeling of Cancer Biomarkers.</a> Chem. Commun. 50 (40), 5215-5217 (2014).</li><li>Zeglis, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Pretargeted+PET+Imaging+Strategy+Based+on+Bioorthogonal+Diels-Alder+Click+Chemistry.">A Pretargeted PET Imaging Strategy Based on Bioorthogonal Diels-Alder Click Chemistry.</a> J. Nucl. Med. 54 (8), 1389-1396 (2013).</li><li>Garc&#237;a, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=99mTc-Bioorthogonal+Click+Chemistry+Reagent+for+In+Vivo+Pretargeted+Imaging.">99mTc-Bioorthogonal Click Chemistry Reagent for In Vivo Pretargeted Imaging.</a> Bioorg. Med. Chem. 24 (6), 1209-1215 (2016).</li><li>Russell, R. G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphosphonates:+The+First+40+Years.">Bisphosphonates: The First 40 Years.</a> Bone. 49 (1), 2-19 (2011).</li><li>Yazdani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Bone-Seeking+Trans-Cyclooctene+for+Pretargeting+and+Bioorthogonal+Chemistry:+A+Proof+of+Concept+Study+Using+99mTc+and+177Lu-Labeled+Tetrazines.">A Bone-Seeking Trans-Cyclooctene for Pretargeting and Bioorthogonal Chemistry: A Proof of Concept Study Using 99mTc and 177Lu-Labeled Tetrazines.</a> J. Med. Chem. , (2016).</li><li>Alberto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Organometallic+Aqua+Complex+of+Technetium+for+the+Labeling+of+Biomolecules:+Synthesis+of+[99mTc(OH2)3(CO)3]++from+[99mTcO4]-+in+Aqueous+Solution+and+its+Reaction+with+a+Bifunctional+Ligand.">A Novel Organometallic Aqua Complex of Technetium for the Labeling of Biomolecules: Synthesis of [99mTc(OH2)3(CO)3]+ from [99mTcO4]- in Aqueous Solution and its Reaction with a Bifunctional Ligand.</a> J. Am. Chem. Soc. 120 (31), 7987-7988 (1998).</li><li>Alberto, R., Ortner, K., Wheatley, N., Schibli, R., Schubiger, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+properties+of+boranocarbonate:+A+convenient+in+situ+CO+source+for+the+aqueous+preparation+of+[99mTc(OH2)3(CO)3.">Synthesis and properties of boranocarbonate: A convenient in situ CO source for the aqueous preparation of [99mTc(OH2)3(CO)3.</a> J. Am. Chem. Soc. 123 (13), 3135-3136 (2001).</li><li>Lu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+SAR+of+99mTc/Re-labeled+Small+Molecule+Prostate+Specific+Membrane+Antigen+Inhibitors+with+Novel+Polar+Chelates.">Synthesis and SAR of 99mTc/Re-labeled Small Molecule Prostate Specific Membrane Antigen Inhibitors with Novel Polar Chelates.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. 23 (5), 1557-1563 (2013).</li><li>Maresca, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+Molecule+Inhibitors+of+PSMA+Incorporating+Technetium-99m+for+Imaging+Prostate+Cancer:+Effects+of+Chelate+Design+on+Pharmacokinetics.">Small Molecule Inhibitors of PSMA Incorporating Technetium-99m for Imaging Prostate Cancer: Effects of Chelate Design on Pharmacokinetics.</a> Inorg. Chim. Acta. 389, 168-175 (2012).</li><li>Bartholom&#228;, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+the+Mode+of+Action+of+Re(CO)3+Thymidine+Complexes.">Insight into the Mode of Action of Re(CO)3 Thymidine Complexes.</a> ChemMedChem. 5 (9), 1513-1529 (2010).</li></ol>

The authors declare they have no competing financial interests.

تم إعداد مجموعة من يخلب ثلاثي الشعب المرتبطة tetrazine من أقطاب مختلفة، وجرى تقييم فائدة المجمعات 99m ح في رد فعل IEDDA مع مشتق TCO في الجسم الحي. تم وضع 99m ح سيلة فعالة وقابلة للتكرار وضع العلامات لمدة خمس tetrazine-يخلب، حيث كان تركيز يجند 10 -3 م وأعقب خطوة وصف?...

يبقى 99m ح النظائر المشعة المهيمن المستخدمة في الطب النووي التشخيصي، مع أكثر من 50 مليون عملية التصوير التي أجريت في السنة في جميع أنحاء العالم 1، 2، 3. غالبية 99m كلاء ح المستخدمة سريريا هي نوع نضح المواد المشعة. هناك عدد محدود من المركبات المستهدفة بنشاط التي يتم فيها توجيه 99m ح ربط العلامات البيولوجية المحددة من خلال ربط لبناء الاستهداف. وغالبا ما تعوق إنشاء 99m المستهدفة المواد المشعة ح بتأثير 99m المجمعات TC-يجند على قدرة جزيء استهداف لربط العلامات البيولوجية من الفائدة، أو النظائر نصف الحياة ليست طويلة بما فيه الكفاية للاستخدام مع ارتفاع الجزيئات الحيوية الوزن الجزيئي مثل الأجسام المضادة. وهذه الأخيرة عادة ما يتطلب عدة أيام قبل أن يتم الحصول على الصور من أجل أن جزيء حيوي لمسح من غير المستهدفة TISS<html> UES. يقدم قبل استهداف نهجا بديلا للتغلب على هذه التحديات. قبل استهداف جنبا إلى جنب مع الكيمياء bioorthogonal وقد تبين أن يكون وسيلة فعالة لتطوير تحقيقات التصوير الجزيئي جديدة لكل مضان والإذاعة التصوير 4، 5، 6، 7، 8. ومعكوس الطلب الإلكترون ديلز-ألدر (IEDDA) التفاعل بين 1،2،4،5-tetrazine (TZ) ومشتقاتها -cyclooctene عبر (TCO)، كما هو موضح في الشكل رقم 1، وقد ثبت أن تكون فعالة بشكل خاص 6. رد فعل IEDDA مع هذه المكونات يمكن أن يحمل حركية سريعة في برنامج تلفزيوني (ك 2 ≈ 6000 م -1 ق -1) وانتقائية عالية، مما يجعلها مثالية للفي الجسم الحي قبل استهداف التطبيقات 9، 10. <html> e_content &quot;&gt; النهج الأكثر شيوعا ينطوي على إدارة ناقلات TCO المستمدة من الاستهداف وبعد فترة تأخير كافية، يدار من tetrazine رديولبلد. tetrazines رديولبلد على أساس 11 C، 18 F، 64 النحاس و 89 عنصر الزركون، و 111 في كان وذكرت 11، 12، 13، 14، 15. وفي المقابل، هناك واحد فقط تقرير ل99m ح المسمى TZ، الذي تم إعداده باستخدام نوع يجند HYNIC تتطلب استخدام المشترك بروابط لمنع بروتين ملزمة وتدهور في الجسم الحي 16. وكبديل لذلك، ونحن التقرير هنا توليف 99m ح (I) المسمى tetrazines باستخدام عائلة بروابط التي تشكل مجمعات ثلاثي الشعب مستقرة مع [99m ح (CO) 3] + الأساسية. العمر = &quot;1&quot;&gt; <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/55188/55188fig1.jpg" /> الشكل 1: IEDDA رد فعل bioorthogonal بين tetrazine و-cyclooctene العابرة. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55188/55188fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> عائلة بروابط أعد تحتوي يخلب ثلاثي الشعب التي تختلف في الاستقطاب وطبيعة المجموعة رابط بين منطقة ملزم المعادن وTZ (الشكل 2). وكان الهدف هو تحديد 99m ح-Tetrazine بناء يمكن أن توطين نحو فعال وتتفاعل مع مواقع المسمى TCO في الجسم الحي واضحة بسرعة عندما لا تكون ملزمة، من أجل انتاج عالية المستهدفة لغير المستهدفة النسب. لاختبار بروابط، تم استخدام TCO المشتقة من البايفوسفونيت (TCO-BP) 17. لقد أظهرنا في وقت سابق ان TCO-BP يموضع إلى مناطق استقلاب العظام نشط ويمكن أن تتفاعل معtetrazines رديولبلد في الجسم الحي 18. وهو كاشف مناسب لاختبار tetrazines الجديدة، لأنها يمكن أن تكون على استعداد في خطوة واحدة والتجارب لا يمكن أن يؤديها في الفئران العادية التي يحدث فيها توطين في المقام الأول في المفاصل (الركبتين والكتفين).

<table><tbody><tr><td>Argon gas</td><td>Alphagaz</td><td>---</td><td>---</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;CO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>EMD Millipore</td><td>106395</td><td>---</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;B&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;7&lt;/sub&gt;&amp;#183;10H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Anachemia</td><td>S9640</td><td>---</td></tr><tr><td>KNaC&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;&amp;#183;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Anachemia</td><td>217255</td><td>---</td></tr><tr><td>Technelite &lt;sup&gt;99m&lt;/sup&gt;Tc generator</td><td>Lantheus medical imaging</td><td>---</td><td>Source of &lt;sup&gt;99m&lt;/sup&gt;TcO&lt;sup&gt;4-&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>0.9% Saline</td><td>Lantheus medical imaging</td><td>---</td><td>To elute generator</td></tr><tr><td>1 M HCl</td><td>Lab Chem</td><td>---</td><td>---</td></tr><tr><td>MeOH</td><td>Caledon</td><td>---</td><td>---</td></tr><tr><td>ACN</td><td>Caledon</td><td>---</td><td>HPLC grade</td></tr><tr><td>Millipore H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Barnstead Nanopure</td><td>---</td></tr><tr><td>DCM</td><td>Caledon</td><td>---</td><td>---</td></tr><tr><td>TFA</td><td>Caledon</td><td>---</td><td>---</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td>pH 7.4 1x</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906</td><td>---</td></tr><tr><td>Tween80</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8047</td><td>---</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>CDMV</td><td>108737</td><td>Supplier: Fresenius Kabi Animal Health</td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Waters</td><td>1525 Binary Pump, 2998 Photodiodde Array Detector, E-SAT/IN, Bioscan Flowcount PMT detector (item # 15590)</td><td>---</td></tr><tr><td>HPLC column for analysis and purification of compounds 2-4</td><td>Phenomenex</td><td>00G-4435-E0</td><td>Gemini&amp;reg; 5 &amp;micro;m C18 110&amp;nbsp;&amp;Aring;, LC Column 250 x 4.6 mm</td></tr><tr><td>HPLC column for analysis and purification of compounds 1 and 5</td><td>Waters&amp;nbsp;</td><td>186003115</td><td>XBridge BEH C18 Column, 130 &amp;Aring;, 5 &amp;micro;m, 4.6 mm x 100 mm</td></tr><tr><td>Microwave Reactor&amp;nbsp;</td><td>Biotage&amp;nbsp;</td><td>Initiator 8</td><td>---</td></tr><tr><td>Biotage V10 Evaporator</td><td>Biotage&amp;nbsp;</td><td>Serial # V1041</td><td>---</td></tr><tr><td>Dose calibrator</td><td>Capintec, Inc.&amp;nbsp;</td><td>CRC-25R</td><td>---</td></tr><tr><td>Gamma counter</td><td>Perkin Elmer</td><td>Wizard 1470 Automatic Gamma Counter</td><td>---</td></tr><tr><td>Animal room scale&amp;nbsp;</td><td>Mettler Toledo</td><td>XP105 Delta Range</td><td>---</td></tr><tr><td>Microwave vials&amp;nbsp;</td><td>Biotage&amp;nbsp;</td><td>355629</td><td>0.5-2 mL&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

preparation and evaluation of 99mtc-labeled tridentate chelates for pre-targeting using bioorthogonal chemistry

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the inverse electron demand Diels-Alder (IEDDA) cycloaddition between a radiolabeled tetrazines and trans-cyclooctene (TCO) linked to a biomolecule has proven to be a highly effective bioorthogonal approach to imaging specific biological targets. Despite the fact that technetium-99m remains the most widely used isotope in diagnostic nuclear medicine, there is a scarcity of methods for preparing 99mTc-labeled tetrazines. Herein we report the preparation of a family of tridentate-chelate-tetrazine derivatives and their Tc(I) complexes. These hitherto unknown compounds were radiolabeled with 99mTc using a microwave-assisted method in 31% to 83% radiochemical yield. The products are stable in saline and PBS and react rapidly with TCO derivatives in vitro. Their in vivo pre-targeting abilities were demonstrated using a TCO-bisphosphonate (TCO-BP) derivative that localizes to regions of active bone metabolism or injury. In murine studies, the 99mTc-tetrazines showed high activity concentrations in knees and shoulder joints, which was not observed when experiments were performed in the absence of TCO-BP. The overall uptake in non-target organs and pharmacokinetics varied greatly depending on the nature of the linker and polarity of the chelate.

تم توليفها بروابط باستخدام الربط، والدوال chelators مختلفة عبر استراتيجية أمينة الاختزالية بسيطة (الشكل 2)، تليها اقتران المنتج إلى tetrazine المتاحة تجاريا 22، 23. تم تنفيذ Radiolabeling باستخدام نفس الأسلوب لجميع المركبات...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry at JoVE.com

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Here, we describe a protocol for radiolabeling and in vivo testing of tridentate 99mTc(I) chelate-tetrazine derivatives for pre-targeting and bioorthogonal chemistry.

إعداد وتقييم<sup&gt; 99m</sup&gt; ح المسمى ثلاثي الشعب يخلب لما قبل استهداف عن طريق Bioorthogonal الكيمياء

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the ...

preparation-evaluation-99mtc-labeled-tridentate-chelates-for-pre

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Chemistry

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

8.1K Views.  McMaster University. Here, we describe a protocol for radiolabeling and in vivo testing of tridentate 99mTc(I) chelate-tetrazine derivatives for pre-targeting and bioorthogonal chemistry. 

Video: Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Microfluidic On-chip Capture-cycloaddition Reaction to Reversibly Immobilize Small Molecules or Multi-component Structures for Biosensor Applications

Methods for rapid surface immobilization of bioactive small molecules with control over orientation and immobilization density are highly desirable for biosensor and microarray applications. In this Study, we use a highly efficient covalent bioorthogonal [4+2] cycloaddition reaction between trans-cyclooctene (TCO) and 1,2,4,5-tetrazine (Tz) to enable the microfluidic immobilization of TCO/Tz-derivatized molecules. We monitor the process in real-time under continuous flow conditions using surface plasmon resonance (SPR). To enable reversible immobilization and extend the experimental range of the sensor surface, we combine a non-covalent antigen-antibody capture component with the cycloaddition reaction. By alternately presenting TCO or Tz moieties to the sensor surface, multiple capture-cycloaddition processes are now possible on one sensor surface for on-chip assembly and interaction studies of a variety of multi-component structures. We illustrate this method with two different immobilization experiments on a biosensor chip; a small molecule, AP1497 that binds FK506-binding protein 12 (FKBP12); and the same small molecule as part of an immobilized and in situ-functionalized nanoparticle.

We present a method for rapid, reversible immobilization of small molecules and functionalized nanoparticle assemblies for Surface Plasmon Resonance (SPR) studies, using sequential on-chip bioorthogonal cycloaddition chemistry and antibody-antigen capture.

ميكروفلويديك على رقاقة رد الفعل التقاط-إضافة حلقية لشل حركة عكسية جزيئات صغيرة أو هياكل متعدد المكون للتطبيقات الاستشعار البيولوجي

Methods  for rapid surface immobilization of bioactive small molecules with control over  orientation and immobilization density are highly desirable for ...

The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

The exceptional affinity, specificity, and selectivity of antibodies make them extraordinarily attractive vectors for tumor-targeted PET radiopharmaceuticals. Due to their multi-day biological half-life, antibodies must be labeled with positron-emitting radionuclides with relatively long physical decay half-lives. Traditionally, the positron-emitting isotopes 124I (t1/2 = 4.18 d), 86Y (t1/2 = 14.7 hr), and 64Cu (t1/2 = 12.7 hr) have been used to label antibodies for PET imaging. More recently, however, the field has witnessed a dramatic increase in the use of the positron-emitting radiometal 89Zr in antibody-based PET imaging agents. 89Zr is a nearly ideal radioisotope for PET imaging with immunoconjugates, as it possesses a physical half-life (t1/2 = 78.4 hr) that is compatible with the in vivo pharmacokinetics of antibodies and emits a relatively low energy positron that produces high resolution images. Furthermore, antibodies can be straightforwardly labeled with 89Zr using the siderophore-derived chelator desferrioxamine (DFO). In this protocol, the prostate-specific membrane antigen targeting antibody J591 will be used as a model system to illustrate (1) the bioconjugation of the bifunctional chelator DFO-isothiocyanate to an antibody, (2) the radiosynthesis and purification of a 89Zr-DFO-mAb radioimmunoconjugate, and (3) in vivo PET imaging with an 89Zr-DFO-mAb radioimmunoconjugate in a murine model of cancer.

The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

Due to its multi-day radioactive half-life and favorable decay properties, the positron-emitting radiometal 89Zr is extremely well-suited for use in antibody-based radiopharmaceuticals for PET imaging. In this protocol, the bioconjugation, radiosynthesis, and preclinical application of 89Zr-labeled antibodies will be described.

وBioconjugation وRadiosynthesis من<sup&gt; 89</sup&gt; الأجسام المضادة عنصر الزركون-DFO المسمى

The exceptional affinity, specificity, and selectivity of antibodies make them extraordinarily attractive vectors for tumor-targeted PET ...

An Optimized Protocol for the Efficient Radiolabeling of Gold Nanoparticles by Using a 125I-labeled Azide Prosthetic Group

Here, we demonstrate a detailed protocol for the radiosynthesis of a 125I-labeled azide prosthetic group and its application to the efficient radiolabeling of DBCO-group-functionalized gold nanoparticles using a copper-free click reaction. Radioiodination of the stannylated precursor (2) was carried out by using [125I]NaI and chloramine T as an oxidant at room temperature for 15 min. After HPLC purification of the crude product, the purified 125I-labeled azide (1) was obtained with high radiochemical yield (75 &plusmn; 10%, n = 8) and excellent radiochemical purity (&gt;99%). For the synthesis of radiolabeled 13-nm-sized gold nanoparticles, the DBCO-functionalized gold nanoparticles (3) were prepared by using a thiolated polyethylene glycol polymer. A copper-free click reaction between 1 and 3 gave the 125I-labeled gold nanoparticles (4) with more than 95% of radiochemical yield as determined by radio-thin-layer chromatography (radio-TLC). These results clearly indicate that the present radiolabeling method using a strain-promoted copper-free click reaction will be useful for the efficient and convenient radiolabeling of DBCO-group-containing nanomaterials.

An Optimized Protocol for the Efficient Radiolabeling of Gold Nanoparticles by Using a 125I-labeled Azide Prosthetic Group

A detailed procedure for the synthesis of a 125I-labeled azide and the radiolabeling of dibenzocyclooctyne (DBCO)-group-conjugated, 13-nm-sized gold nanoparticles using a copper-free click reaction is described.

بروتوكول الأمثل لRadiolabeling كفاءة من جزيئات الذهب عن طريق استخدام<sup&gt; 125</sup&gt; أزيد المجموعة الترقيعي المسمى أنا

Here, we demonstrate a detailed protocol for the radiosynthesis of a 125I-labeled azide prosthetic group and its application to the efficient ...

Harnessing the Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloaddition for Pretargeted PET Imaging

Due to their exquisite affinity and specificity, antibodies have become extremely promising vectors for the delivery of radioisotopes to cancer cells for PET imaging. However, the necessity of labeling antibodies with radionuclides with long physical half-lives often results in high background radiation dose rates to non-target tissues. In order to circumvent this issue, we have employed a pretargeted PET imaging strategy based on the inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition reaction. The methodology decouples the antibody from the radioactivity and thus exploits the positive characteristics of antibodies, while eschewing their pharmacokinetic drawbacks. The system is composed of four steps: (1) the injection of a mAb-trans-cyclooctene (TCO) conjugate; (2) a localization time period during which the antibody accumulates in the tumor and clears from the blood; (3) the injection of the radiolabeled tetrazine; and (4) the in vivo click ligation of the components followed by the clearance of excess radioligand. In the example presented in the work at hand, a 64Cu-NOTA-labeled tetrazine radioligand and a trans-cyclooctene-conjugated humanized antibody (huA33) were successfully used to delineate SW1222 colorectal cancer tumors with high tumor-to-background contrast. Further, the pretargeting methodology produces high quality images at only a fraction of the radiation dose to non-target tissue created by radioimmunoconjugates directly labeled with 64Cu or 89Zr. Ultimately, the modularity of this protocol is one of its greatest assets, as the trans-cyclooctene moiety can be appended to any non-internalizing antibody, and the tetrazine can be attached to a wide variety of radioisotopes.

The bioorthogonal inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition has been harnessed to create an effective and modular pretargeted PET imaging strategy for cancer. In this protocol, the steps of this methodology are described in the context of a model system employing the colorectal cancer targeted antibody huA33 and a 64Cu-labeled radioligand.

تسخير الطلب Bioorthogonal معكوس الكترون ديلز-ألدر الإضافة الحلقية لPretargeted PET التصوير

Due to their exquisite affinity and specificity, antibodies have become extremely promising vectors for the delivery of radioisotopes to cancer cells for ...

Bioengineering

MR Molecular Imaging of Prostate Cancer with a Small Molecular CLT1 Peptide Targeted Contrast Agent

Tumor extracellular matrix has abundance of cancer related proteins that can be used as biomarkers for cancer molecular imaging. In this work, we demonstrated effective MR cancer molecular imaging with a small molecular peptide targeted Gd-DOTA monoamide complex as a targeted MRI contrast agent specific to clotted plasma proteins in tumor stroma. We performed the experiment of evaluating the effectiveness of the agent for non-invasive detection of prostate tumor with MRI in a mouse orthotopic PC-3 prostate cancer model. The targeted contrast agent was effective to produce significant tumor contrast enhancement at a low dose of 0.03 mmol Gd/kg. The peptide targeted MRI contrast agent is promising for MR molecular imaging of prostate tumor.

To demonstrate MR cancer molecular imaging with a small peptide targeted MRI contrast agent specific to clotted plasma proteins in tumor stroma in a mouse prostate cancer model.

MR التصوير الجزيئي للسرطان البروستاتا مع وكيل النقيض المستهدفة الجزيئية الببتيد الصغيرة CLT1

Tumor extracellular  matrix has abundance of cancer related proteins that can be used as biomarkers  for cancer molecular imaging. In this work,  we ...

Medicine

Pretargeted Radioimmunotherapy Based on the Inverse Electron Demand Diels-Alder Reaction

While radioimmunotherapy (RIT) is a promising approach for the treatment of cancer, the long pharmacokinetic half-life of radiolabeled antibodies can result in high radiation doses to healthy tissues. Perhaps not surprisingly, several different strategies have been developed to circumvent this troubling limitation. One of the most promising of these approaches is pretargeted radioimmunotherapy (PRIT). PRIT is predicated on decoupling the radionuclide from the immunoglobulin, injecting them separately, and then allowing them to combine in vivo at the target tissue. This approach harnesses the exceptional tumor-targeting properties of antibodies while skirting their pharmacokinetic drawbacks, thereby lowering radiation doses to non-target tissues and facilitating the use of radionuclides with half-lives that are considered too short for use in traditional radioimmunoconjugates. Over the last five years, our laboratory and others have developed an approach to in vivo pretargeting based on the inverse electron-demand Diels-Alder (IEDDA) reaction between trans-cyclooctene (TCO) and tetrazine (Tz). This strategy has been successfully applied to pretargeted positron emission tomography (PET) and single-photon emission computed tomography (SPECT) imaging with a variety of antibody-antigen systems. In a pair of recent publications, we have demonstrated the efficacy of IEDDA-based PRIT in murine models of pancreatic ductal adenocarcinoma and colorectal carcinoma. In this protocol, we describe protocols for PRIT using a 177Lu-DOTA-labeled tetrazine radioligand ([177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz) and a TCO-modified variant of the colorectal cancer targeting huA33 antibody (huA33-TCO). More specifically, we will describe the construction of huA33-TCO, the synthesis and radiolabeling of [177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz, and the performance of in vivo biodistribution and longitudinal therapy studies in murine models of colorectal carcinoma.

This protocol describes the synthesis and characterization of a trans-cyclooctene (TCO)-modified antibody and a 177Lu-labeled tetrazine (Tz) radioligand for pretargeted radioimmunotherapy (PRIT). In addition, it details the use of these two constructs for in vivo biodistribution and longitudinal therapy studies in a murine model of colorectal cancer.

راديويمونوثيرابي بريتارجيتيد بناء على تفاعل ديلز-الدر الطلب إلكترون معكوس

While radioimmunotherapy (RIT) is a promising approach for the treatment of cancer, the long pharmacokinetic half-life of radiolabeled antibodies can ...

Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. Yet maleimide-based conjugates display limited stability in vivo because the succinimidyl thioether linkage can undergo a retro-Michael reaction. This, of course, can lead to the release of the radioactive payload or its exchange with thiol-bearing biomolecules in circulation. Both of these processes can produce elevated activity concentrations in healthy organs as well as decreased activity concentrations in target tissues, resulting in reduced imaging contrast and lower therapeutic ratios. In 2018, we reported the creation of a modular, stable, and easily accessible phenyloxadiazolyl methyl sulfone reagent &#8212; dubbed &#8216;PODS&#8217; &#8212; as a platform for thiol-based bioconjugations. We have clearly demonstrated that PODS-based site-selective bioconjugations reproducibly and robustly create homogenous, well-defined, highly immunoreactive, and highly stable radioimmunoconjugates. Furthermore, preclinical experiments in murine models of colorectal cancer have shown that these site-selectively labeled radioimmunoconjugates exhibit far superior in vivo performance compared to radiolabeled antibodies synthesized via maleimide-based conjugations. In this protocol, we will describe the four-step synthesis of PODS, the creation of a bifunctional PODS-bearing variant of the ubiquitous chelator DOTA (PODS-DOTA), and the conjugation of PODS-DOTA to the HER2-targeting antibody trastuzumab.

In this protocol, we will describe the synthesis of PODS, a phenyoxadiazolyl methyl sulfone-based reagent for the site-selective attachment of cargos to the thiols of biomolecules, particularly antibodies. In addition, we will describe the synthesis and characterization of a PODS-bearing bifunctional chelator and its conjugation to a model antibody.

تعديل التوليف وبيوكونجوجيشن من الكواشف ثيول المتفاعلة لإنشاء الموقع بشكل انتقائي إيمونوكونجوجاتيس

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. ...

Positron Emission Tomography Imaging of Cell Trafficking: A Method of Cell Radiolabeling

Stem cell and chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapies are emerging as promising therapeutics for organ regeneration and as immunotherapy for various cancers. Despite significant progress having been made in these areas, there is still more to be learned to better understand the pharmacokinetics and pharmacodynamics of the administered therapeutic cells in the living system. For noninvasive, in vivo tracking of cells with positron emission tomography (PET), a novel [89Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine ([89Zr]Zr-DBN)-mediated cell radiolabeling method has been developed utilizing 89Zr (t1/2 78.4 h). The present protocol describes a [89Zr]Zr-DBN-mediated, ready-to-use, radiolabeling synthon for direct radiolabeling of variety of cells, including mesenchymal stem cells, lineage-guided cardiopoietic stem cells, liver regenerating hepatocytes, white blood cells, melanoma cells, and dendritic cells. The developed methodology enables noninvasive PET imaging of cell trafficking for up to 7 days post-administration without affecting the nature or the function of the radiolabeled cells. Additionally, this protocol describes a stepwise method for the radiosynthesis of [89Zr]Zr-DBN, biocompatible formulation of [89Zr]Zr-DBN, preparation of cells for radiolabeling, and finally the radiolabeling of cells with [89Zr]Zr-DBN, including all the intricate details needed for the successful radiolabeling of cells.

Presented here is a protocol to radiolabel cells with a positron emission tomography (PET) radioisotope, 89Zr (t1/2 78.4 h), using a ready-to-use radiolabeling synthon, [89Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine ([89Zr]Zr-DBN). Radiolabeling cells with [89Zr]Zr-DBN allows noninvasive tracking and imaging of administered radiolabeled cells in the body with PET for up to 7 days post-administration.

التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني لتهريب الخلايا: طريقة لوضع العلامات الإشعاعية للخلايا

Stem cell and chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapies are emerging as promising therapeutics for organ regeneration and as immunotherapy for ...

Cancer Research

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used in cancer treatment and imaging due to increased cellular accumulation over current ACs. During early AC in vitro development, fluorescence techniques and radioimmunoassays are sufficient for determining intracellular localization, accumulation efficiency, and target cell specificity. Currently, there is no consensus on standardized methods for preparing cells for evaluating AC intracellular accumulation and localization. The initial testing of ACs modified with virus-derived peptides is critical especially if several candidates have been constructed. Determining intracellular accumulation by fluorescence can be affected by background signal from ACs at the cell surface and complicate the interpretation of accumulation. For radioimmunoassays, typically treated cells are fractionated and the radioactivity in different cell compartments measured. However, cell lysis varies from cell to cell and often nuclear and cytoplasmic compartments are not adequately isolated. This can produce misleading data on payload delivery properties. The intravenous injection of radiolabeled virus-derived peptide-modified ACs in tumor bearing mice followed by radionuclide imaging is a powerful method for determining tumor targeting and payload delivery properties at the in vivo phase of development. However, this is a relatively recent advancement and few groups have evaluated virus-derived peptide-modified ACs in this manner. We describe the processing of treated cells to more accurately evaluate virus-derived peptide-modified AC accumulation when using confocal microscopy and radioimmunoassays. Specifically, a method for trypsinizing cells to remove cell surface bound ACs. We also provide a method for improving cellular fractionation. Lastly, this protocol provides an in vivo method using positron emission tomography (PET) for evaluating initial tumor targeting properties in tumor-bearing mice. We use the radioisotope 64Cu (t1/2 = 12.7 h) as an example payload in this protocol.

Viral-derived peptides coupled to antibody-conjugates (ACs) is an approach gaining momentum due to the potential of delivering molecular payloads with increased tumor cell accumulation. Utilizing common methods to evaluate peptide conjugation, AC and payload intracellular accumulation, and tumor targeting, this protocol helps researchers during the key initial development phases.

تعديل التقييم الأولى لجسم-يصرف مع الببتيدات المشتقة من الفيروسية لزيادة تراكم الخلوية وتحسين استهداف الورم

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte cell culture and 64Cu-antibody receptor targeting of the cells. In vitro evaluation of the radiolabel and non-invasive in vivo cell tracking in an animal model of an airway delayed-type hypersensitivity reaction (DTHR) by PET/CT are described.
In detail, the conjugation of a mAb with the chelator 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA) is shown. Following the production of radioactive 64Cu, radiolabeling of the DOTA-conjugated mAb is described. Next, the expansion of chicken ovalbumin (cOVA)-specific CD4+ interferon (IFN)-&#947;-producing T helper cells (cOVA-TH1) and the subsequent radiolabeling of the cOVA-TH1 cells are depicted. Various in vitro techniques are presented to evaluate the effects of 64Cu-radiolabeling on the cells, such as the determination of cell viability by trypan blue exclusion, the staining for apoptosis with Annexin V for flow cytometry, and the assessment of functionality by IFN-&#947; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Furthermore, the determination of the radioactive uptake into the cells and the labeling stability are described in detail. This protocol further describes how to perform cell tracking studies in an animal model for an airway DTHR and, therefore, the induction of cOVA-induced acute airway DHTR in BALB/c mice is included. Finally, a robust PET/CT workflow including image acquisition, reconstruction, and analysis is presented.
The 64Cu-antibody receptor targeting approach with subsequent receptor internalization provides high specificity and stability, reduced cellular toxicity, and low efflux rates compared to common PET-tracers for cell labeling, e.g.64Cu-pyruvaldehyde bis(N4-methylthiosemicarbazone) (64Cu-PTSM). Finally, our approach enables non-invasive in vivo cell tracking by PET/CT with an optimal signal-to-background ratio for 48 h. This experimental approach can be transferred to different animal models and cell types with membrane-bound receptors that are internalized.

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Following the preparation of a 64Cu-modified monoclonal antibody binding to a transgenic murine T cell receptor, T cells are radiolabeled in vivo, analyzed for viability, functionality, labeling stability and apoptosis, and adoptively transferred into mice with an airway delayed-type hypersensitivity reaction for non-invasive imaging by positron emission tomography/computed tomography (PET/CT).

الفئران اللمفاويات وسمها من قبل<sup&gt; 64</sup&gt; النحاس والأجسام المضادة مستقبلات استهداف ل<em&gt; في فيفو</em&gt; الاتجار خلية بواسطة PET / ط م

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

إعداد وتقييم

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video