The authors thank the Canadian Blood Services for a Graduate Fellowship Program Award to T.N.T. This research received financial support from the Canadian Blood Services' Centre for Innovation, funded by the federal government (Health Canada) and the provincial and territorial ministries of health. The views herein do not reflect the views of the federal, provincial, or territorial governments in Canada.

الحصول على موافقة لاستخدام العينات البشرية من قبل المجلس / مجلس المراجعة المؤسسية أخلاقيات البحث، والحصول على موافقة موقعة من جميع الجهات المانحة الإنسان. مجلس العمل المتحد ويمكن أيضا أن يقوم باستخدام PBMCs الماوس بطريقة مماثلة لفحص البشري، بعد موافقة أخلاقيات استخدام الحيوانات. مجلس العمل المتحد تستخدم تقنيات زراعة الأنسجة العقيم. ملاحظة: انظر الشكل 1. ملاحظة: على الرغم من أننا نوصي استخدام الاحتواء البيولوجي مجلس الوزراء مستوى 2 خلال فحص للحفاظ على تقنية العقيم، كأسلوب ليست سوى &quot;على المدى القصير&quot; طريقة والثقافة، وليس هناك وقت حقا ما يكفي للبكتيريا لتلويث الفحص. ولذلك، إذا لم يكن موجودا الاحتواء البيولوجي مجلس الوزراء مستوى 2، بدلا من شراء واحدة فقط لهذا الفحص، يمكن إجراء فحص خارج مجلس الوزراء الاحتواء البيولوجي، على مقاعد البدلاء مفتوحة. استخدام الحاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2، ومع ذلك، ليس خيارا، ويجب أن تستخدم لالنتائج المثلى. 1. الدم المحيطي وحيدات النوى عزل الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على الدم الكامل البشري من متبرع سليم أو المريض عن طريق بزل الوريد باستخدام vacutainers التي تحتوي على حمض سترات الدكستروز (ACD) تخثر (الأصفر أعلى أنابيب). ملاحظة: الدم كله يمكن تخزينها في حوار التعاون الآسيوي في درجة حرارة الغرفة (18-22 درجة مئوية) لمدة تصل إلى 36 ساعة قبل الانتقال إلى الخطوة التالية (11). عادة، 1-2 10 مل أنابيب vacutainer من الدم الكامل كافية للفحص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الدم الكامل 1: 1 ت / ت في حارة كاملة المتوسطة RPMI (RPMI-1640 تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني، 20 ملي HEPES، و 0.01 ملغ / مل الجنتاميسين). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل الخلايا الطرفية وحيدة النواة في الدم (PBMCs) من الدم الكامل المخفف باستخدام الكثافة الطرد المركزي التدرج، على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة (انظر قائمة من المواد). طبقة من الدم المخفف ببطء شديد على مدى التدرج الكثافة (درجة حرارة لدرجة حرارة الغرفة، 18-22 درجة مئوية). ملاحظة: تقليل كمية للانترنتنانوغرام في واجهة لفصل الأمثل من الدم عن طريق طبقات بعناية الخليط الدم بطريقة قطرة قطرة أو باستخدام ماصة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للخليط الدم إلى طبقة ببطء فوق الجزء العلوي من التدرج الكثافة عن طريق وضع طرف الماصة على مقربة من التدرج الكثافة ومن خلال تمكين خليط الدم لتشغيل أسفل الجانب من الأنبوب ببطء شديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعتمادا على حجم التجربة، طبقة 10 مل من خليط الدم على رأس 3 مل من درجة الكثافة (في أنبوب 15 مل) أو طبقة 35 مل من خليط الدم على رأس 15 مل من درجة الكثافة (في 50 مل أنبوب). عادة، 10 مل من الدم الكامل ينتج 10 ملايين PBMCs، مع بعض الاختلاف المانحة إلى الجهات المانحة. ملاحظة: من المهم جدا أن يكون هناك أي اختلاط الخليط الدم مع التدرج الكثافة. يجب أن طبقة الخليط الدم خلال التدرج كثافة وترتفع ببطء حتى كل الدم على أعلى درجة الكثافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي الخليط الطبقات في 700 x ج لمدة 30 دقيقة دون فرامل. والطرد المركزييجب فصل خليط ifuged إلى 5 طبقات (من الأعلى إلى الأسفل): البلازما، ومعطف بافي (التي تحتوي على PBMCs)، كثافة المواد التدرج، المحببة، وكرات الدم الحمراء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة والتخلص من غالبية البلازما واسترداد بعناية محتوى معطف الشهباء (PBMC) في أنبوب 15 مل جديد باستخدام ماصة باستور ولمبة الشفط. ملاحظة: إزالة طبقة معطف الشهباء يتم ذلك على نحو فعال من خلال تطبيق الشفط على ماصة باستور أثناء أداء حركة دائرية حول الجزء الخارجي من طبقة، مع غيض من ماصة ضد الأنبوب. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل PBMCs معزولة ثلاث مرات في درجة الحموضة 7.3 الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) بواسطة الطرد المركزي في 350 x ج لمدة 10 دقيقة (مع الفرامل كاملة) بين يغسل. إعادة بيليه PBMC في المتوسط ​​RPMI كاملة. اعتمادا على حجم بيليه، 3-7 مل من المتوسط ​​غير كافية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد PBMC باستخدام التريبان الأزرق وعدادة الكريات. الاعتماد فقط تلك الخلايا التي لم يتم الملون بالأزرق التريبان. Reconstitutه على PBMCs إلى 1،750،000 خلية / مل في المتوسط ​​RPMI كاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور 400 ميكرولتر (700،000 خلايا) في كل بئر من الشريحة 8 الغرفة. احتضان الشريحة في 37 درجة مئوية، ترطيب تماما نسيج الثقافة الحاضنة (تستكمل مع 5٪ CO 2) لمدة 1 ساعة للسماح للالوحيدات / الضامة على الانضمام. </li></ol> 2. المعالجة المسبقة للالالتزام وحيدات ملاحظة: هذه الخطوة الضرورية فقط إذا كنت تبحث عن سبل لمنع أو تعزيز البلعمة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انضمت قبل علاج حيدات مع أي دواء (ق) أو مركب (ق) من الفائدة. إعادة تشكيل المخدرات (ق) أو غيرها من المواد اختبار للتركيز المطلوب باستخدام المتوسطة RPMI كاملة. ملاحظة: على سبيل المثال، عادة ما تستخدم 200 ميكروغرام / مل من IVIG أن تسفر عن تثبيط 95-100٪ من البلعمة عند استخدام حيدات الإنسان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح وتجاهل طاف تحتوي على أي خلايا غير ملتصقة من الشريحة 8 الغرفة بعد حضانة 1-ساعة (بعد الخطوة 1.6). استبدله 400ميكرولتر من دواء أو علاج آخر واحتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما الشفط واستبدال الحلول في الشريحة 8 الغرفة، تأكد للسيطرة على تدفق السوائل بحيث خلايا الالتزام ضعيف لا يقلع. أيضا، والعمل مع فقط 2-3 الآبار فارغة في وقت وتجنب تجفيف الآبار. ملاحظة: عادة، يتم تنفيذ كل معاملة في يثلث التقنية. </li></ol></li></ol> 3. طهاية من R 2 R 2 خلايا الدم الحمراء ملاحظة: R 2 R 2 المستخدمة هنا هي الحصول عليها من مركز جمع الدم (الكندية خدمات الدم)، وإنما هي أيضا متاحة تجاريا. تستخدم Opsonized R 2 R 2 كرات الدم الحمراء كما تحكم إيجابية لالبلعمة بوساطة FcγR. السذاجة R 2 R 2 يجب أن يتم تخزينها في حل Alsever في (لإطالة العمر الافتراضي) في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 في الشهر. يتم حل Alsever لفي المنزل ويتكون من 0.8٪ ث / ت سترات الصوديوم (ثنائي الهيدرات)، 1.9٪ ث / ت سكر العنب، 0.42٪ ث / ت كلوريد الصوديوم، و 0.05٪ ث / ت حمض الستريك (الهيدرات). إذا R 2 R 2 خلايا غير متوفرة، وغيرها من الخلايا phenotyped الصحة الإنجابية، مثل R 1 R 2، R 1 R 1، R 1 ص، أو R 2 ص، ويمكن استخدامها. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل R 2 R 2 (الرفيق / الرفيق) خلايا الدم الحمراء في برنامج تلفزيوني ما مجموعه ثلاث مرات باستخدام الطرد المركزي في 350 x ج لمدة 5 دقائق لكل منهما. ملاحظة: كمية كرات الدم الحمراء اللازمة يعتمد على حجم التجريبية ويمكن أن يكون حساب العودة. غسل دائما كمية كبيرة من كرات الدم الحمراء، حيث يتم فقدان كرات الدم الحمراء خلال كل غسل بسبب تحلل أو أثناء إزالة طاف. على سبيل المثال، في تجربة مع 5 العلاجات و2 الضوابط، كل أجريت في يثلث التقنية، هناك ما مجموعه 21 بئرا. 21 بئرا مع 400 ميكرولتر / بئر 1.25٪ RBC الخليط إلى أن 105 ميكرولتر من معبأة، opsonized هناك حاجة إلى ربك. 200 ميكرولتر من RBC يجب غسلها في البداية و 150 &amp; #يجب opsonized L لضمان وجود كمية كافية من كرات الدم الحمراء للخطوة البلعمة، 181. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يستطهي غسلها R 2 R 2 بيليه مع 1: 1 ت / ت بولكلونل أضداد-D من مصل الدم البشري واحتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية، مع الخلط على فترات متقطعة. ملاحظة: إذا بولكلونل أضداد-D غير متوفرة، فمن الممكن استخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المضادة للD، وهي متوافرة تجاريا، أو مكافحة-D الذي يستخدم عادة لره الوقاية المناعي، والتي يمكن الحصول عليها من بنوك الدم أو نقل خدمات. وينبغي إجراء الاختبار الأمثل في البداية، عند إعداد مقايسة، وكلما تبديل الكثير من الأجسام المضادة، titered الامم المتحدة أو التحول إلى الأجسام المضادة وحيدة النسيلة. هذا هو تحديد تركيز الأمثل أو حجم المضادة للD المطلوبة لاختبار أضداد الغلوبولين (IAT) نتيجة بين 3+ و 4+ والبلعمة نتيجة بين 70-90 كرات الدم الحمراء المبتلعة في 100 حيدات فرزها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل يستطهيد R 2 R 2 ما مجموعه ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني باستخدام الطرد المركزي في 350 x ج لمدة 5 دقائق لكل منهما. ملاحظة: طهاية بنجاح R 2 R 2 ويمكن التأكد عن طريق إجراء IAT غير مباشر. لفترة وجيزة، وأضاف الأجسام المضادة الثانوية مكافحة الإنسان لربط الأجسام المضادة opsonizing الأولية على الأسطح RBC، وإشارة تضخيمها بحيث يمكن ملاحظتها في شكل التراص. ويمكن الاطلاع على بروتوكول الشركة المصنعة مفصل في ملف المواد التكميلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة غسلها R 2 R 2 بيليه إلى 1.25٪ ت / ت باستخدام المتوسطة RPMI كاملة. ملاحظة: الزائد R opsonized 2 R 2 يمكن تخزينها في حل Alsever لفي 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع. </li></ol> 4. البلعمة بوساطة مستقبلات-FC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح المخدرات أو طاف المتوسط من الشريحة 8 الغرفة وإضافة 400 ميكرولتر من 1.25٪ ت / ت R 2 R 2 الخليط. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلفإيه 2 ساعة من الحضانة، وإزالة الدوائر باستخدام محولات الشركة المصنعة. ربت قبالة الزائد R 2 R 2 على منشفة ورقية. تأكد من أن شريحة لا تجف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء كوب 100 مل مع برنامج تلفزيوني. غمر وغسل الشريحة التي تتحرك ببطء الشريحة ذهابا وإيابا (حوالي 30-40 السكتات الدماغية) لإزالة غالبية-المبتلعة الامم المتحدة R 2 R 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الشريحة من برنامج تلفزيوني. ربت قبالة الزائد PBS باستخدام منشفة ورقية أو الأنسجة والهواء الجاف الشريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الشريحة المجفف في الهواء في الميثانول بنسبة 100٪ لمدة 45 ثانية. ثم، والهواء الجاف الشريحة الثابتة. ملاحظة: يمكن ان تكون ثابتة الشرائح باستخدام طريقة أخرى التي هي أكثر توافقا لتلطيخ المصب، مثل وصمة عار جرونوالد بالغيمزا 21 أو وصمة عار رايت بالغيمزا 22. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل الشريحة باستخدام في صنع منزل تصاعد elvanol المتوسطة (أو المتوسطة المتزايدة المتاحة تجاريا آخر) وإضافة coverslips. يتكون Elvanol المتوسطة المتزايدة من 15٪ ث / ت ص: ملاحظةlyvinyl الراتنج الكحول و 30٪ ت / ت الجلسرين في برنامج تلفزيوني. ويسخن المزيج حتى يذوب كل الراتنج والجليسرين مختلطة متجانس. يمكن استبدال هذا مع تصاعد المتوسط ​​الأخرى المتاحة تجاريا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للجبل لتجف بين عشية وضحاها قبل الكمي. </li></ol> 5. الكمي من البلعمة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام المجهر المرحلة على النقيض من و40X عدسة الهدف، تحديد يدويا كمية من الأحداث أكلة عن طريق العد لا يقل عن 200 حيدات وعدد من المبتلعة R 2 R 2 ضمن هذه حيدات. هل لديك عداد واحد في كل يد لتحديد وقت واحد وعدد من وحيدات وعدد من المبتلعة R 2 R 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على متوسط مؤشر أكلة بقسمة عدد من المبتلعة R 2 R 2 من قبل عدد من وحيدات ضرب من قبل 100. اكسبريس البيانات كما المتوسط (متوسط مؤشر البلعمة) ± الخطأ المعياري للمتوسط (SEM). </li&gt; </ol>

<ol><li>Hunt, J. S., Beck, M. L., Hardman, J. T., Tegtmeier, G. E., Bayer, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+erythrocyte+alloantibodies+by+IgG+subclass+and+monocyte+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Characterization of human erythrocyte alloantibodies by IgG subclass and monocyte interaction.</a> Am J Clin Pathol. 74 (3), 259-264 (1980).</li>
<li>Schanfield, M. S., Stevens, J. O., Bauman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+detection+of+clinically+significant+erythrocyte+alloantibodies+using+a+human+mononuclear+phagocyte+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">The detection of clinically significant erythrocyte alloantibodies using a human mononuclear phagocyte assay.</a> Transfusion. 21 (5), 571-576 (1981).</li>
<li>Branch, D. R., Gallagher, M. T., Mison, A. P., Sysiokian, A. L., Petz, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+determination+of+red+cell+alloantibody+significance+using+an+assay+of+monocyte-macrophage+interaction+with+sensitized+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">In vitro determination of red cell alloantibody significance using an assay of monocyte-macrophage interaction with sensitized erythrocytes.</a> Br J Haematol. 56 (1), 19-29 (1984).</li>
<li>Hunt, J. S., Beck, M. L., Wood, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte-mediated+erythrocyte+destruction.+A+comparative+study+of+current+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Monocyte-mediated erythrocyte destruction. A comparative study of current methods.</a> Transfusion. 21 (6), 735-738 (1981).</li>
<li>Noumsi, G. T., Billingsley, K. L., Moulds, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+transfusion+of+antigen+positive+blood+to+alloimmunised+patients+using+a+monocyte+monolayer+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus+Med%22%5BJournal%5D)">Successful transfusion of antigen positive blood to alloimmunised patients using a monocyte monolayer assay.</a> Transfus Med. 25 (2), 92-100 (2015).</li>
<li>Moulds, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+antibodies+and+complement%5BTitle%5D)+AND+%22Transf+Apher+Sci%22%5BJournal%5D)">Introduction to antibodies and complement.</a> Transf Apher Sci. 40 (3), 185-188 (2009).</li>
<li>Grandstaff Moulds, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Transf+Apher+Sci%22%5BJournal%5D)">Antibody identification.</a> Transf Apher Sci. 40 (3), 195-197 (2009).</li>
<li>Hendrickson, J. E., Tormey, C. A., Shaz, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+blood+cell+alloimmunization+mitigation+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus+Med+Rev%22%5BJournal%5D)">Red blood cell alloimmunization mitigation strategies.</a> Transfus Med Rev. 28 (3), 137-144 (2014).</li>
<li>Hamilton, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+and+frequently+encountered+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus+Apher+Sci%22%5BJournal%5D)">Common and frequently encountered antibodies.</a> Transfus Apher Sci. 40 (3), 189-194 (2009).</li>
<li>Kenna, M. A., Cooper, R. A., Schrieber, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+papain+on+the+interaction+between+human+monocytes%2C+erythrocytes+and+IgG%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Effect of papain on the interaction between human monocytes, erythrocytes and IgG.</a> Blood. 46 (2), 245-252 (1975).</li>
<li>Tong, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+conditions+for+the+performance+of+a+monocyte+monolayer+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Optimal conditions for the performance of a monocyte monolayer assay.</a> Transfusion. , Epub ahead of print (2016).</li>
<li>Gray, S. J., Sterling, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tagging+of+red+cells+and+plasma+proteins+with+radioactive+chromium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">The tagging of red cells and plasma proteins with radioactive chromium.</a> J Clin Invest. 29 (12), 1604-1613 (1950).</li>
<li>Mollison, P. L., Veall, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+the+isotope+51Cr+as+a+label+for+red+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">The use of the isotope 51Cr as a label for red cells.</a> Br J Haematol. 1 (1), 62-74 (1955).</li>
<li>Sebring, E. S., Polesky, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+fetal+hemorrhage+in+Rh+immune+globulin+candidates.+A+rosetting+technique+using+enzyme-treated+Rh2Rh2+indicator+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Detection of fetal hemorrhage in Rh immune globulin candidates. A rosetting technique using enzyme-treated Rh2Rh2 indicator erythrocytes.</a> Transfusion. 22 (6), 468-471 (1982).</li>
<li>Downing, I., Templeton, J. G., Mitchell, R., Fraser, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemiluminescence+assay+for+erythrophagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biolumin+Chemilumin%22%5BJournal%5D)">A chemiluminescence assay for erythrophagocytosis.</a> J Biolumin Chemilumin. 5 (4), 243-250 (1990).</li>
<li>Fabron, A. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+noninvasive+phagocytic+cellular+assays+using+autologous+monocytes+to+assess+red+cell+alloantibodies+in+sickle+cell+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus+Apher+Sci%22%5BJournal%5D)">Application of noninvasive phagocytic cellular assays using autologous monocytes to assess red cell alloantibodies in sickle cell patients.</a> Transfus Apher Sci. 31 (1), 29-35 (2004).</li>
<li>Michelis, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+hemolysis+after+intravenous+immunoglobulin+amid+host+factors+of+ABO-mismatched+bone+marrow+transplantation%2C+inflammation%2C+and+activated+mononuclear+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Acute hemolysis after intravenous immunoglobulin amid host factors of ABO-mismatched bone marrow transplantation, inflammation, and activated mononuclear phagocytes.</a> Transfusion. 54 (3), 681-690 (2014).</li>
<li>Rampersad, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+compounds+that+target+thiol-disulfide+groups+on+mononuclear+phagocytes+inhibit+immune+mediated+phagocytosis+of+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Chemical compounds that target thiol-disulfide groups on mononuclear phagocytes inhibit immune mediated phagocytosis of red blood cells.</a> Transfusion. 45 (3), 384-393 (2005).</li>
<li>Purohit, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-activity+relationships+of+pyrazole+derivatives+as+potential+therapeutics+for+immune+thrombocytopenias%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Structure-activity relationships of pyrazole derivatives as potential therapeutics for immune thrombocytopenias.</a> Bioorg Med Chem. 22 (9), 2739-2752 (2014).</li>
<li>Neschadim, A., Kotra, L. P., Branch, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+phagocytosis+inhibitors+for+immune+cytopenias%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmun+Rev%22%5BJournal%5D)">Small molecule phagocytosis inhibitors for immune cytopenias.</a> Autoimmun Rev. 15 (8), 843-847 (2016).</li>
<li>Fitzer-Attas, C. J., et al. Fcgamma receptor-mediated phagocytosis in macrophages lacking the Src family tyrosine kinases Hck, Fgr, and Lyn. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFitzer-Attas%2C+CJ+%22J.+Exp+Med%22">J. Exp Med</a>. 191 (4), 669-682 (2000).</li>
<li>Allhorn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IgG-specific+endoglycosidase+EndoS+inhibits+both+cellular+and+complement-mediated+autoimmune+hemolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The IgG-specific endoglycosidase EndoS inhibits both cellular and complement-mediated autoimmune hemolysis.</a> Blood. 115 (24), 5080-5088 (2010).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+phagocytic+recognition+of+anti-D+opsonized+Rh+D%2B+RBC+by+polymer-mediate+immunocamouflage%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hematol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of phagocytic recognition of anti-D opsonized Rh D+ RBC by polymer-mediate immunocamouflage.</a> Am J Hematol. 90 (12), 1165-1170 (2015).</li>
<li>Kwan, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+efficient+enzymes+for+the+generation+of+universal+blood+through+structure-guided+directed+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Toward efficient enzymes for the generation of universal blood through structure-guided directed evolution.</a> J Am Chem Soc. 137 (17), 5695-5705 (2015).</li>
</ol>

The authors have nothing to disclose.

مجلس العمل المتحد هو أسلوب شاقة تتطلب الخبرة في كل من زراعة الأنسجة والفحص المجهري. هناك العديد من الخطوات الهامة لضمان النجاح: 1) جيل من أحادي الطبقة الوحيدات. 2) طهاية من كرات الدم الحمراء، و 3) الكمي اليدوي. لا تلتزم أحادي الطبقة الوحيدات بقوة إلى الشريحة الغرفة، لذلك يجب المحافظة على درجة الحموضة الفسيولوجية في جميع أنحاء فحص 11، وينبغي أن المصنف وجود عدد كاف من PBMCs. pipetting لقوي، والتي قد تعكر صفو خلايا الالتزام، ينبغي تجنبها. نهج واحد هو إزالة دائما وإضافة حلول من نفس زاوية الغرفة والتأكد من أن الحركة بطيئة وثابتة. وبالمثل، خلال خطوة الغسيل الأخيرة لإزالة الزائد كرات الدم الحمراء، وينبغي أن تكون الحركة بطيئة وثابتة. وهذا يضمن الحد الأدنى من اضطراب أحادي الطبقة في حين لا يزال إزالة الغالبية العظمى من كرات الدم الحمراء-المبتلعة الامم المتحدة. وغسل غير كافية يؤدي إلى خلفية عالية من كرات الدم الحمراء الملوثة، الأمر الذي يجعل منه اليدويntification صعوبة. ثانيا، كرات الدم الحمراء R 2 R 2 يجب opsonized بما فيه الكفاية للحصول على متوسط مؤشر أكلة من 80-120 لمراقبة البلعمة. هذا النطاق أكلة المطلوب توازنا بين سهولة العد (على سبيل المثال، المبتلعة حيدات مع أكثر من 5 كرات الدم الحمراء يصعب تحديدها بدقة) والحفاظ على كمية كافية من البلعمة للتحليل الإحصائي. درجة طهاية يمكن تأكيد من قبل معهد التكنولوجيا التطبيقية، وهناك حاجة إلى القراءة بين 3+ 4+ ل. وR 2 R يجب التخلص 2 كرات الدم الحمراء عندما يكون هناك تحلل الزائد أثناء الغسيل، عندما يتحول طاف الأحمر الداكن، أو عندما لوحظ انخفاض كبير في البلعمة في التجارب نظرا لشيخوخة الخلايا في التخزين. وأخيرا، وتحديد يدوي باستخدام المجهر ويمكن أن تكون خادعة، وخاصة عند المقارنة بين التهم بين أفراد المختبر وبين التجارب. من خلال دراسة نفس المجال على كل بئر، أو ببساطة عن طريق عد المزيد من الخلايا، يمكن الحصول على عدد أكثر اتساقا. ويوصى التدريب جنبا إلى جنب مع فني من ذوي الخبرة واستخدام مجموعة معينة من الشرائح التدريب. نقد كبير من مجلس العمل المتحد هو ذاتية الخطوة الكمي اليدوية. ومع ذلك، مع التدريب المناسب، والاتساق ويمكن الحصول عبر عدادات مختلفة. الحد الآخر هو الجوهرية الخلافات المانحة إلى الجهات المانحة في قدرات أكلة الوحيدات وفي R 2 R 2 سطح مستويات التعبير مستضد، والتي هي مصدر التباين في البيانات عند التعامل مع العينات البشرية. تتوفر لدراسة البلعمة بوساطة FcγR تقنيات بديلة أخرى. غالبية مجموعات تجارية تستخدم الناتج الفلورسنت لمراقبة البلعمة (على سبيل المثال، bioparticles وحساسة درجة الحموضة البروتين مضان، أو المسمى مفتش الخرز اللاتكس الفلورية). استخدام الناتج الفلورسنت لا تقدم الكمي أكثر موضوعية، ولكن يحتاج واحد أيضا لخداعسدر توافر والتكلفة والتدريب المرتبطة باستخدام المجهر الفلورسنت أو قياس التدفق الخلوي، فضلا عن الاعتماد التي تلت ذلك على مجموعات المتاحة تجاريا. وأخيرا، وهذا الفحص يمكن تعديلها تبعا لسؤال البحث. على سبيل المثال، عند اختبار تثبيط المخدرات البلعمة، وحيدات يمكن أن تكون إما قبل المعالجة أو المشارك حضنت مع كل من المخدرات وكرات الدم الحمراء opsonized (أي فحص المنافسة). إشارات المصب من الأجسام المضادة من أنواع فرعية مختلفة، والأجسام المضادة خيالية، أو يبني المؤتلف ويمكن أيضا اختبار. مع اختراقات الأخيرة في تطوير مستضد باطل العالمي الدم 24، مجلس العمل المتحد يمكن استخدامها في الشاشات الأولية لهذه كرات الدم الحمراء مستضد لاغيا مع مختلف الأجسام المضادة لتقييم ما إذا كان هناك بالفعل فعالية خفضت في التسبب البلعمة.

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay originally developed to better predict blood transfusion outcomes in patients with auto- or alloantibodies to red blood cells (RBCs)1-5. By assessing the effect of anti-RBC antibodies in mediating Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis using this in vitro assay, it is possible to predict the clinical outcome in vivo. Indeed, the MMA has been used successfully to avoid immune destruction of antibody-bound RBCs, despite the transfusion of serologically incompatible blood5. The typical pre-transfusion procedure for compatibility testing, also termed crossmatching, involves serological methods that include typing the patient's blood for ABO and Rh antigens and screening for the presence of anti-RBC antibodies in the patient6. Blood matched for ABO/Rh is selected, and if antibodies are present, an attempt to identify them is made so that blood for transfusion can be further selected to avoid these antigens. An ideal crossmatch result occurs when all donor blood is serologically compatible with the patient's blood, which reduces the risk of post-transfusion hemolysis7. However, this system falls short for the small group of patients who have become alloimmunized upon repeated transfusion or pregnancy. These patients produce alloantibodies against specific RBC antigens. Some produce antibodies to antigens of very high frequency in the general population, and thus become progressively more difficult to crossmatch8,9. Adding to the complexity, not all alloantibodies are clinically significant; in other words, the binding of an alloantibody to RBCs detected by a serology test does not necessarily result in hemolysis when antigen-positive, incompatible blood is transfused. The MMA was originally developed to assess the potential clinical significance of serologically incompatible blood in a transfusion setting1-5.
Since extravascular hemolysis of antibody-bound RBCs is known to be mediated by the mononuclear phagocyte system, primary monocytes/macrophages are utilized in the development of diagnostic assays. The first assay to study the interaction of monocytes, RBCs, and antibodies was published in 1975, but the sub-optimal conditions used led only to rosette formation (the binding of RBCs to the periphery of the monocyte), and no phagocytosis was observed10. Significant modifications to the assay were made by several groups, leading to an assay for which the level of phagocytosis of alloantibody-bound RBCs could be correlated to the clinical outcome of hemolysis1-5. Recently, the optimal storage conditions of clinical samples and further optimization of assay conditions were examined to enhance the utility of a clinical MMA crossmatch using autologous patient samples11.
Three other diagnostic techniques have been employed in addition to the MMA in predicting transfusion outcomes: the 51Cr release test, the rosette test, and the chemiluminescence test (CLT). In the 51Cr release test, the patient is injected with 51Cr-labeled donor RBCs, and the half-life of the labeled RBCs is monitored and is predictive of post-transfusion survival or clearance12,13. As this method uses radioactive materials, it is rarely performed anymore. The rosette test involves mixing and incubating monocytes with RBCs and quantifying the level of rosette formation (with no phagocytosis)14. The clinical significance of antibodies in vivo involves active phagocytosis by macrophages found in the spleen and/or the liver; thus, this method does not provide a relevant readout of phagocytosis. The CLT uses luminol to monitor the oxidative burst during monocyte phagocytosis of RBC, since luminol fluoresces blue when oxidized in the phagosome15. This method is good, but contamination by neutrophils can confound the readout. Parallel comparisons have been made to evaluate the sensitivity, practicality, and reproducibility of the four available methods, and both the CLT and MMA were ranked superior16. However, the CLT has been mainly utilized in assessing hemolytic disease of the fetus and newborn (HDFN), and the assay's optimal pH of 8.0 might compromise the level of phagocytosis11.
In addition to its diagnostic and clinical utility, the MMA has been modified for other research purposes. Indeed, the MMA can not only serve as a functional assay to address discrepancies between serology and biology, it has also been used to retrospectively investigate the cause of hemolysis after intravenous immunoglobulin (IVIG) therapy17. It has also been used to examine the structure-function of chemical inhibitors of Fc&#947;R-mediated phagocytosis18-20 and to study the downstream signaling of Fc&#947;R-mediated phagocytosis21. In our laboratory, in addition to using a human MMA, we are developing a murine MMA using primary mouse peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and autologous RBCs. The rationale is to screen antibodies that can induce Fc&#947;R-mediated phagocytosis as an intermediate to developing an in vivo autoimmune hemolytic anemia (AIHA) mouse model (unpublished data). The various modifications focus on different aspects of the IgG antibody and Fc&#947;R interaction that induce phagocytosis.

<table><tbody><tr><td>Acid citrate dextrose (ACD) vacutainers</td><td>BD</td><td>REF364606</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Bioshop</td><td>HEP003.100</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Multicell&amp;nbsp;</td><td>080150</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15710-64</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE</td><td>17-1440-03</td><td>https://www.gelifesciences.com/</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>8-chamber slides</td><td>Lab-Tek-ll</td><td>154534</td><td></td></tr><tr><td>R&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;R&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (cDE/cDE) red blood cells</td><td>Canadian Blood Services</td><td></td><td>Commercially available (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, http://www.bio-rad.com/en-ca/product/reagent-red-blood-cells)</td></tr><tr><td>Polyclonal anti-D from human serum</td><td>Gamma Biologics</td><td>DIN 02247724</td><td>Can be substituted with commercially available monoclonal anti-D or with Rh immune globulin</td></tr><tr><td>100% methanol</td><td>Caledon</td><td>6700-1-42</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinyl alcohol resin</td><td>Sigma</td><td>P8136</td><td>Can be substituted with commercially available mount</td></tr><tr><td>UltraPure glycerine</td><td>Invitrogen</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>Cover slips</td><td>VWR</td><td>48366 067</td><td></td></tr><tr><td>Novaclone anti-IgG</td><td>Immucorgamma</td><td>5461023</td><td>Optional for IAT (http://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/.../ucm081743.pdf)</td></tr></tbody></table>

use of a monocyte monolayer assay to evaluate fc&#947; receptor-mediated phagocytosis

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly versatile in vitro assay that can be modified to examine different aspects of antibody and Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis in both research and clinical settings. The assay utilizes adherent monocytes from peripheral blood mononuclear cells isolated from mammalian whole blood. MMA has been described for use in both human and murine investigations. These monocytes express Fc&#947;Rs (e.g., Fc&#947;RI, Fc&#947;RIIA, Fc&#947;RIIB, and Fc&#947;RIIIA) that are involved in immune responses. The MMA exploits the mechanism of Fc&#947;R-mediated interactions, phagocytosis in particular, where antibody-sensitized red blood cells (RBCs) adhere to and/or activate Fc&#947;Rs and are subsequently phagocytosed by the monocytes. In vivo, primarily tissue macrophages found in the spleen and liver carry out Fc&#947;R-mediated phagocytosis of antibody-opsonized RBCs, causing extravascular hemolysis. By evaluating the level of phagocytosis using the MMA, different aspects of the in vivo Fc&#947;R-mediated process can be investigated. Some applications of the MMA include predicting the clinical relevance of allo- or autoantibodies in a transfusion setting, assessing candidate drugs that promote or inhibit phagocytosis, and combining the assay with fluorescent microscopy or traditional Western immunoblotting to investigate the downstream signaling effects of Fc&#947;R-engaging drugs or antibodies. Some limitations include the laboriousness of this technique, which takes a full day from start to finish, and the requirement of research ethics approval in order to work with mammalian blood. However, with diligence and adequate training, the MMA results can be obtained within a 24-h turnover time.

باتباع الخطوات الحاسمة في الشكل (1) والإجراءات الموضحة أعلاه، مجلس العمل المتحد لا يمكن أن يؤديها بتكاثر. وقد استخدم IVIG كمثال لتثبيط البلعمة في الشكل 2. ومن المعروف IVIG لربط ومنع المستقبلات التيسير، مما يحول دون نتائج المصب البلعمة. بواسطة المعايرة كمية IVIG المستخدمة، لوحظ تثبيط تعتمد على الجرعة، التي تركيزات أعلى من 200 ميكروغرام أسفرت / مل في ما يقرب من 100٪ تثبيط وتركيزات أقل من 0.5 ميكروغرام / مل لم تمنع على الإطلاق (الشكل 2A). عندما تتحول المؤشرات أكلة وتطبيع للمراقبة إيجابية R 2 R 2 ك 0٪ كبت، منحنى تثبيط مع IC 50 من 3 ميكروغرام يمكن تحديد / مل (الشكل 2B). بالإضافة إلى إجراء فحص على الدوام، quantificaنشوئها الفحص يمكن أن يكون صعبا في بعض الأحيان. الشكل (3) عبارة عن مجموعة من المرحلة على النقيض من الصور المجهري مختلف الشرائح MMA. مع خبرة المجهر، يمكن للمرء أن يميز الوحيدات من RBC تلوث (الشكل 3D)، أو فجوة من RBC المبتلعة (الشكل 3B). وينبغي تجنب التجمعات الكثيفة للخلايا و / أو الحطام خلال الكمي (أرقام 3E و F). أيضا، ينبغي للمرء تجنب الإفراط في opsonizing آر 2 R 2 RBC، التي من شأنها أن تؤدي إلى البلعمة الكبيرة التي يمكن overcrowds الداخلية الوحيدات ويتداخل مع التقدير الدقيق (الشكل 3C). <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/55039/55039fig1.jpg" /> الشكل 1. رسم تخطيطي من مجلس العمل المتحد. ووصف خطوة بخطوة من خطوات حاسمة في مجلس العمل المتحد: عزل PBMC من الدم الكامل، وإطعام monocyt الالتزاموفاق مع opsonized R 2 R 2، وغسل الشرائح غرفة. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55039/55039fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/55039/55039fig2.jpg" /> الشكل 2. الوريد مفتش (IVIG) يمنع البلعمة في المختبر باستخدام MMA. ومن المعروف IVIG لمنع البلعمة، ويستخدم كعنصر تحكم تثبيط في MMA البشري. (A) المعايرة من IVIG أدى إلى تثبيط تعتمد على الجرعة البلعمة بالمقارنة مع غير المعالجة R 2 R 2 السيطرة. وأظهرت النتائج أن متوسط ​​± الخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM) ن = 3 تجارب. وقد أجري التحليل الإحصائي باستخدام الطلاب ر -test: ** P≤0.01 و*** P≤0.001. (ب) منحنى تثبيط IVIG مع IC 50 سو 3 ميكروغرام / مل (الخط المنقط). وتشير نتائج البيانات تطبيع لR غير المعالجة 2 R 2 (0٪ تثبيط)؛ يعني ± SEM من ن = 3 تجارب. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55039/55039fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/55039/55039fig3.jpg" /> الشكل 3. المرحلة على النقيض الصور المجهر الشرائح العينة تحت 40X التكبير. (A) الشريحة مثالية فيه حيدات المبتلعة 1-2 R 2 R 2 في المتوسط (السهام السوداء مع توهج هالة مميزة)، مع عدد قليل جدا من تلويث، برنامج الأمم المتحدة للالمبتلعة R 2 R 2 في الخلفية (السهام البيضاء). فجوات (B) كما هو مبين في هذه الشريحة، وحيدات في بعض الأحيان قد الموسع (السهام البيضاء)، والتي يمكن أن يكون مخطئا لالمبتلعة R 2 R 2. (C &lt;/ قوي&gt;) عندما يكون R 2 R 2 الإفراط في opsonized، أكثر من 4-5 المبتلعة R 2 R 2 في الوحيدات (الأسهم السوداء) تجعل عد دقيقة صعبة، منذ R 2 R 2 تزدحم داخل الوحيدات وخلية متميزة لا يمكن تمييزها الحدود. (D) غسل عدم كفاية الشريحة يؤدي إلى وفرة R 2 R 2 تلوث (السهام البيضاء)، والتي يمكن أن يكون مخطئا لكرات الدم الحمراء الالتزام. (E) في بعض الأحيان، وحيدات وكرات الدم الحمراء تلويث قد شكل مجموعات. تشير مجموعات أيضا التلوث الجرثومي، والتي ينبغي تجنبها. (F) وحيدات قد تشكل المجاميع الكبيرة، التي يجب تجنبها أثناء الكمي. عن طريق اختيار عشوائي من الحقول لعرض، لوحة (أ) هو ما لوحظ عادة إذا كان قد تم إجراء MMA بشكل صحيح. شريط النطاق هو 20 ميكرون. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55039/55039fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا</a>لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Watch this Scientific Journal Video about Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate FcÎ³ Receptor-mediated Phagocytosis at JoVE.com

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay that utilizes isolated primary monocytes obtained from mammalian peripheral whole blood to evaluate Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis.

استخدام الوحيدات أحادي الطبقة الفحص لتقييم البلعمة بوساطة مستقبلات Fcγ

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

use-monocyte-monolayer-assay-to-evaluate-fc-receptor-mediated

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.0K Views.  University of Toronto. The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay that utilizes isolated primary monocytes obtained from mammalian peripheral whole blood to evaluate Fcγ receptor (FcγR)-mediated phagocytosis.

Video: Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fcγ Receptor-mediated Phagocytosis

Determining the Phagocytic Activity of Clinical Antibody Samples

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as pathology of disease. While the properties of the variable domains of antibodies have long been considered critical to in vivo function, the ability of antibodies to recruit innate immune cells via their Fc domains has become increasingly appreciated as a major factor in their efficacy, both in the setting of recombinant monoclonal antibody therapy, as well as in the course of natural infection or vaccination1-3.
Importantly, despite its nomenclature as a constant domain, the antibody Fc domain does not have constant function, and is strongly modulated by IgG subclass (IgG1-4) and glycosylation at Asparagine 2974-6. Thus, this method to study functional differences of antigen-specific antibodies in clinical samples will facilitate correlation of the phagocytic potential of antibodies to disease state, susceptibility to infection, progression, or clinical outcome.
Furthermore, this effector function is particularly important in light of the documented ability of antibodies to enhance infection by providing pathogens access into host cells via Fc receptor-driven phagocytosis7. Additionally, there is some evidence that phagocytic uptake of immune complexes can impact the Th1/Th2 polarization of the immune response8.
Here, we describe an assay designed to detect differences in antibody-induced phagocytosis, which may be caused by differential IgG subclass, glycan structure at Asn297, as well as the ability to form immune complexes of antigen-specific antibodies in a high-throughput fashion. To this end, 1 &mu;m fluorescent beads are coated with antigen, then incubated with clinical antibody samples, generating fluorescent antigen specific immune complexes. These antibody-opsonized beads are then incubated with a monocytic cell line expressing multiple Fc&gamma;Rs, including both inhibitory and activating. Assay output can include phagocytic activity, cytokine secretion, and patterns of Fc&gamma;Rs usage, and are determined in a standardized manner, making this a highly useful system for parsing differences in this antibody-dependent effector function in both infection and vaccine-mediated protection9.

We present a high-throughput flow cytometric assay to determine the phagocytic activity of antigen-specific antibodies from clinical samples, utilizing fluorescent antigen-coated beads and a monocytic cell line expressing multiple Fc receptors&#x2014;providing receptor usage and phagocytic activity determinations in a standardized and reproducible fashion for any antigen of interest.

تحديد نشاط أكلة العينات السريرية جسم

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular processes. This technique can be used on a variety of cell types, both adherent and non-adherent, to examine a variety of cellular properties. When studying phagocytosis, fluorometric technique utilizes phagocytic cell types such as macrophages, and fluorescently labeled opsonized particles whose fluorescence can be extinguished in the presence of trypan blue. Following plating of adherent macrophages in 96-well plates, fluorescent particles (green or red) are administered and cells are allowed to phagocytose for varied amounts of time. Following internalization of fluorescent particles, cells are washed with trypan blue, which facilitates extinction of fluorescent signal from bacteria which are not internalized, or are merely adhering to the cell surface. Following the trypan wash, cells are washed with PBS, fixed, and stained with DAPI (nuclear blue fluorescent label), which serves to label nuclei of cells. By a simple fluorometric quantification through plate reading of nuclear (blue) or particle (red/green) fluorescence we can examine the ratio of relative fluorescence units of green:blue and determine a phagocytic index indicative of amount of fluorescent bacteria internalized per cell. The duration of assay using a 96-well method and multichannel pipettes for washing, from end of phagocytosis to end of data acquisition, is less than 45 min. Flow cytometry could be used in a similar manner but the advantage of fluorometry is its high throughput, rapid method of assessment with minimal manipulation of samples and quick quantification of fluorescent intensity per cell. Similar strategies can be applied to non adherent cells, live labeled bacteria, actin polymerization, and essentially any process utilizing fluorescence. Therefore, fluorometry is a promising method for its low cost, high throughput capabilities in the study of cellular processes.

Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

تقنية عالية الإنتاجية فلوروميتريك تقييم بلعم البلعمة وأكتين البلمرة

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides the necessary methodology to add this assay to an exercise immunology arsenal. The first step in this assay is to prepare two aliquots ("H" and "F") of whole blood (heparin). Then, dihydroethidium is added to the H aliquot, and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Next, Staphylococcus aureus (S. aureus) is added to the H aliquot and fluorescein isothiocyanate-labeled S. aureus is added to the F aliquot (bacteria:phagocyte = 8:1), and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Then, trypan blue is added to each aliquot to quench extracellular fluorescence, and the cells are washed with phosphate-buffered saline. Next, the red blood cells are lysed, and the white blood cells are fixed. Finally, a flow cytometer and appropriate analysis software are used to measure granulocyte and monocyte phagocytosis and OB activity. This assay has been used for over 20 years. After heavy and prolonged exertion, athletes experience a significant but transient increase in phagocytosis and an extended decrease in OB activity. The post-exercise increase in phagocytosis is correlated with inflammation. In contrast to normal weight individuals, granulocyte and monocyte phagocytosis is chronically elevated in overweight and obese participants, and is modestly correlated with C-reactive protein. In summary, this flow cytometry-based assay measures the phagocytosis and OB activity of phagocytes and can be used as an additional measure of exercise- and obesity-induced inflammation.

The purpose of this manuscript is to present a method for measuring monocyte and granulocyte phagocytosis and oxidative burst activity in human blood samples.

قياس الحبيبية والوحيدات البلعمة ومؤكسد آخر انفجار في الدم البشري

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of the actin cytoskeleton to capture, envelop and engulf large particles. Although phagocytic receptors, downstream signaling pathways, and effectors, such as Rho GTPases, have been identified, the dynamic cytoskeletal remodeling of specific receptor-mediated phagocytic events remain unclear. Four decades ago, two distinct mechanisms of phagocytosis, exemplified by Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)- and complement receptor (CR)-mediated phagocytosis, were identified using scanning electron microscopy. Binding of immunoglobulin G (IgG)-opsonized particles to Fc&#947;Rs triggers the protrusion of thin membrane extensions, which initially form a so-called phagocytic cup around the particle before it becomes completely enclosed and retracted into the cell. In contrast, complement opsonized particles appear to sink into the phagocyte following binding to complement receptors. These two modes of phagocytosis, phagocytic cup formation and sinking in, have become well established in the literature. However, the distinctions between the two modes have become blurred by reports that complement receptor-mediated phagocytosis may induce various membrane protrusions. With the availability of high resolution imaging techniques, phagocytosis assays are required that allow real-time 3D (three dimensional) visualization of how specific phagocytic receptors mediate the uptake of individual particles. More commonly used approaches for the study of phagocytosis, such as end-point assays, miss the opportunity to understand what is happening at the interface of particles and phagocytes. Here we describe phagocytic assays, using time-lapse spinning disk confocal microscopy, that allow 3D imaging of single phagocytic events. In addition, we describe assays to unambiguously image Fc&#947; receptor- or complement receptor-mediated phagocytosis.

Here we describe methods using spinning disk confocal microscopy to image single phagocytic events by mouse resident peritoneal macrophages. The protocols can be extended to other phagocytic cells.

الوقت الفاصل بين التصوير 3D البلعمه التي الضامة الماوس

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

Prediction of Red Blood Cell Antibody Significance Using the Monocyte-Macrophage Assay

Derived from monocytes in the bone marrow, macrophages are large, innate immune cells that play a major role in clearing dead cells, debris, tumor cells, and foreign pathogens. The phagocytic capacity of monocytes versus macrophages is a concept that is not well understood. Here, we aim to examine a difference in the phagocytosis of monocytes versus macrophages, specifically M1/M2 macrophages, against various opsonized red cells using a modified and updated version of the established monocyte monolayer assay (MMA). Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated from donor buffy coats. Using purified monocytes, inflammatory M1 and anti-inflammatory M2 macrophages were produced by in vitro culture and polarization. M1/M2 cells were harvested and used in an MMA-like assay, which we refer to as the M-MA, to decipher clinically significant phagocytosis of various red cell antibodies. A phagocytic index (PI) &#62; 5 was deemed clinically significant phagocytosis with the use of monocytes. A phagocytic index (PI) &#62; 12 was deemed clinically significant phagocytosis with the use of M1/M2 macrophages. M2 macrophages demonstrate an increased ability to phagocytose opsonized RBCs compared to monocytes and M1s. The same weak antibody (anti-S) yields significant phagocytosis with only M2 macrophages (PI=43) but not M1s (PI=2) or monocytes (PI=0), and this was demonstrated repeatedly using various antibodies. The use of M2 macrophages instead of monocytes may allow for more accurate results as these cells are more phagocytic, offering further clinical relevance to the assay. Further studies with different antibodies to red blood cells, including validation of the monocyte-macrophage assay (M-MA) with antibodies having known clinical significance, may show the M-MA&#160;more useful to help predict clinically significant red cell alloantibodies and transfusion reactions. This method will advance the field of transfusion medicine and immunology.

We have developed enhancements and updated methods for the existing monocyte-monolayer assay (MMA), in which macrophages are used to help better predict the clinical relevance of red cell alloantibodies in transfusion medicine and immunology. This assay is named the monocyte-macrophage assay (M-MA).

التنبؤ بأهمية الأجسام المضادة لخلايا الدم الحمراء باستخدام اختبار البلاعم وحيدة الخلايا

Derived from monocytes in the bone marrow, macrophages are large, innate immune cells that play a major role in clearing dead cells, debris, tumor cells, ...

Real-Time Imaging of Macrophage Phagocytosis of IgG-Opsonized Red Blood Cells

Source: Horsthemke, M., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/57566">Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates an assay to monitor independent macrophage-mediated red blood cell (RBC) phagocytosis events. Mouse immunoglobulin G (IgG)-opsonized human RBCs are incubated with mouse macrophages and observed under a confocal microscope. The RBCs are engulfed by macrophages via a phagocytic cup formation and targeted for lysosomal degradation.

التصوير في الوقت الحقيقي لكثرة البلعمة الضامة لخلايا الدم الحمراء IgG

Source: Horsthemke, M., et al. Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages. J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates an assay to monitor ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

Specialized Assays

An In Vitro Assay for Evaluating the Immunomodulatory Impact of Monocytes on Leukocyte Proliferation

Source: Hsu, P., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/53265">Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells (MSCs).</a> J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates an in vitro assay to explore the immunomodulatory influence of mesenchymal stem cells (MSCs) on effector T cell proliferation. The assay includes co-culturing MSCs with PBMCs to induce the monocyte population to acquire an immunomodulatory phenotype, leading to the secretion of interleukin-10 (IL-10). Following incubation with activated CD4+ T cells, the induced monocytes effectively suppress T cell proliferation.

اختبار في المختبر لتقييم التأثير المناعي للخلايا الوحيدة على تكاثر الكريات البيض

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Density Gradient Isolation of ...

In Vitro and In Vivo Models

An Assay to Assess Phagocytosis and Oxidative Burst Activity In Granulocytes and Monocytes

Source: Meaney, M. P. et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/54264">Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video demonstrates the assay to confirm phagocytic activity by cells in human blood via flow cytometry. The granulocytes and monocytes confirm their phagocytic activity by showing green and red fluorescence confirming the presence of engulfed bacteria and oxidative burst activity respectively.

اختبار لتقييم البلعمة ونشاط الانفجار التأكسدي في الخلايا المحببة والخلايا الوحيدة

All procedures involving human participants have been performed in compliance with the institutional, national, and international guidelines for human ...

An Assay for Quantifying Antibody-Mediated Phagocytosis of Parasite-Infected Erythrocytes

Source: Quintana, M. d. P. et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/61538">Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2020)
This video demonstrates a flow cytometry-based phagocytosis assay involving labeled and opsonized Plasmodium falciparum-infected erythrocytes by monocytes. Flow cytometry identifies fluorescence in monocytes, confirming the successful identification of opsonized erythrocytes through phagocytosis.

اختبار لقياس البلعمة بوساطة الأجسام المضادة لكريات الدم الحمراء المصابة بالطفيليات

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Parasite culture
NOTE: Follow the ...

An In Vitro Assay to Measure Antibody-Dependent Cellular Phagocytosis by Phagocytes

Source: Powell, R. L., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/60149">Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates an assay to measure the antibody-dependent cellular phagocytosis (ADCP) by breast milk phagocytes. Fluorescently labeled microspheres conjugated to an antigen-antibody complex, are combined with a cell suspension isolated from breast milk to induce antibody-dependent cellular phagocytosis by the phagocytic leukocytes. Upon labeling the cells with antibodies against common leukocyte antigen (CD45), flow cytometry is used to measure the fluorescence intensity of microsphere-positive viable phagocytic leukocytes, indicating the level of ADCP activity.

اختبار في المختبر لقياس البلعمة الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة بواسطة الخلايا البلعمية

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Target Microsphere preparation

	...