Name: layered alginate constructs: a platform for co-culture of heterogeneous cell populations
Uploaded: 2016-08-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations at JoVE.com

This work was funded by the National Science Foundation (CBET 0845754, AHH).

1. إعداد لتشكيل الجيني أقراص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 4٪ (ث / ت) حل الجينات في الفوسفات مخزنة المالحة 1X Dulbecco ودون كلوريد الكالسيوم وأضاف أو كلوريد المغنيسيوم وقعت في 37 ° C حمام الماء. تركيزات الحل الجينات يمكن أن تختلف، ولكن 1-4٪ (ث / ت) ينصح حلول الجينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج الحل الجينات في نسبة 1: 1 مع قاعدة الوسائط زراعة الخلايا الحارة (على سبيل المثال، Dulbecco لتعديل النسر متوسطة.) لنوع من الخلايا المطلوبة. تركيز الجينات هو الآن نصف تركيز الأصلي، أي، 2٪ (ث / ت). تعقيم الجينات / حل الوسائط باستخدام معقم 0.2 ميكرومتر مرشحات حقنة النايلون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حمام من معقمة 102 ملم ثنائي هيدرات كلوريد الكالسيوم في الماء المعقم مع حل ما يكفي لغمر قوالب (~ 200-300 مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع العقيمة &quot;قالب تشكيل هلام&quot; (6 مم × 3 مم طويل القامة آبار اسطوانية 3 في × 3 في لوحة الألومنيوم، انظر <strong&gt; الشكل 1) والصفائح الطرفية (القاع: واحد 3 × 3 في في لوحة الألومنيوم، الأعلى: واحد 1.5 بوصة × 3 في لوحة الألومنيوم) وإعداد قوالب على النحو التالي: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع ورقة سميكة فلتر (مرشح ورقة نشافة) وغشاء الخلية microsieve (10 ميكرون حجم المسام) لأحجام أعلى وأسفل الصفائح الطرفية ووضعها في الحمام كلوريد الكالسيوم حتى المشبعة، حوالي 1 دقيقة. إذا رغبت في ذلك، وتعقيم ورقة الترشيح سميكة والغشاء microsieve عبر الأوتوكلاف أو الأشعة فوق البنفسجية ضوء لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انشاء نصف (النصف السفلي) من العفن بناء. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع العناصر التالية فوق بعضها البعض في الترتيب التالي وتنعيم باستخدام ملعقة العقيمة: endplate كبيرة (3 × 3 في في)، ورق الترشيح سميكة، ثم الغشاء microsieve. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عكس واضغط على العفن على كومة من المناشف الورقية لضمان فقدان محلول كلوريد الكالسيوم الزائد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع &quot;هلام تشكيل العفن&quot; مع آبار اسطوانية على أعلى جالذراع غشاء microsieve وبلطف ربط القالب معا على الجانبين باستخدام مقاطع الموثق على الجانبين الأيسر والأيمن. تأكد من ترك مساحة كافية لendplate أعلى (1.5 بوصة × 3 في) لتغطية الآبار في وقت لاحق تماما. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انشاء النصف الثاني (النصف العلوي) من العفن بناء. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع العناصر التالية فوق بعضها البعض في الترتيب التالي وتنعيم: endplate صغيرة، ورق الترشيح سميكة، وغشاء microsieve. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عكس والضغط على هذا النصف من العفن على كومة من المناشف الورقية لضمان فقدان محلول كلوريد الكالسيوم الزائد. لا أربط هذا الشوط من العفن باستخدام مقاطع الموثق في هذا الوقت. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة الخلايا كما أوصى في تعليمات الشركة الصانعة. حصاد الخلايا المطلوبة لتضمينها في الهلاميات المائية الجينات الطبقات. كثافة الخلية الموصى بها هي 1-2 × 10 6 خلية / مل، ولكن هذا يمكن أن تختلف اعتمادا على التجارب المطلوبة. ملاحظة: عند استخدام هذا الأسلوبلجعل الطبقات مع أنواع مختلفة من الخلايا، للتأكد من أنواع الخلايا ثقافة اثنين بشكل متواز لطبقات. الخلايا الجذعية الوسيطة (اللجان الدائمة) المصنفة في مناطق ذات كثافة خلية من 1 × 10 6 خلية / مل سوف تستخدم كمثال لبروتوكول التالي. عدد الخلايا وعدد القرص يمكن زيادتها لتجارب حسب الحاجة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أسبوع إلى أسبوعين قبل التضمين، الخلايا الجذعية الوسيطة البذور في مناطق ذات كثافة خلية من 3000 - 5000 خلية / سم 2 في 10 مل من وسائط النمو القاعدية (Dulbecco لتعديل النسر متوسطة، و 10٪ مصل بقري جنيني، 2٪ L-الجلوتامين، 1 ٪ غير الاساسيين الأحماض الأمينية، 1٪ البنسلين / الستربتوميسين) في T-75 قوارير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وسائل الاعلام وقضي كل 2-3 أيام واستبدالها مع 10 مل من وسائط النمو القاعدية حتى الخلايا هي 80-90٪ متموجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد الخلايا، وإزالة وسائل الاعلام المستهلك، وماصة 3 مل من الفوسفات مخزنة المالحة 1X Dulbecco ودون كلوريد الكالسيوم المضافة أو كلوريد المغنيسيوم لشطف الخلايا. إزالة هذا الحل، ماصة 3 مل من 0.25٪ في محاولةpsin-EDTA على نمو الخلايا في T-75 قوارير، واحتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. بعد خلايا رفعت من على سطح الأرض ملتصقة، إضافة 6-9 مل من وسائط النمو القاعدية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اللجان الدائمة الطرد المركزي في 600 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، نضح طاف، وإعادة تعليق في 1-5 مل من وسائط النمو القاعدية. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات باستخدام تعليمات الجهاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 1 × 10 6 خلايا من إجمالي إعادة تعليق الخلية، وأجهزة الطرد المركزي التي تستخدم نفس الظروف، ونضح طاف. </li></ol></li></ol> 2. تشكيل خلية المصنفة الجيني أقراص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق بيليه خلية مع 1 مل من محلول الجينات / وسائل الإعلام العقيمة لتحقيق كثافة الخلية من 1 × 10 6 خلية / مل. سوف الخليط الخلية الجينات يكون غائما متجانس في المظهر عندما خلايا ممزوجة بشكل مناسب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 130 ميكرولتر من خليط الخلية الجينات إلى ستة 6 مم × 3 مم الآبار طويل القامة في النصف السفلي من العفنبناء قطرة قطرة، حتى لا تخلق أي فقاعات. وينبغي أن يكون الغضروف المفصلي محدب طفيف مرئية فوق حافة كل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنعيم بعناية النصف العلوي من العفن بناء باستخدام ملعقة معقمة وتحويل أكثر من ذلك، حتى أن غشاء الخلية microsieve على رأس الآبار. مكان القالب بناء على أعلى من الآبار، مع التأكد من تغطية الآبار التي تحتوي على خلية وخليط الجينات تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع القالب بناء تحميلها، وأثناء الضغط لأسفل بشدة على المركز، الموثق كليب الجانبين المتبقية (العلوي والسفلي) لربط شطري العلوية والسفلية من القالب بناء. الحلول الخلية الجينات يجب أن تقع بشكل آمن في الآبار في هذا الوقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج بناء العفن تثبيتها في الحمام كلوريد الكالسيوم 102 ملم، والتأكد من أن بناء كامل مغمورة. احتضان في الخلية هود الثقافة في درجة حرارة الغرفة لمدة 90 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نهاية ال 90 دقيقة، وإزالة بناء قالب من كلوريد الكالسيوم 102 مليحمام ومكان على كومة من المناشف الورقية في الخلية هود الثقافة. إزالة جميع مقاطع الموثق أربعة وفصل نصفي القالب بناء. الهلاميات المائية التي تشكلت في الآبار لا ينبغي أن يكون أي فقاعات، وينبغي ملء الآبار تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملعقة، وتتبع بعناية حافة الآبار التي تحتوي على الهلاميات المائية لتخفيف بعناية ووتد من الهلاميات المائية. بعد إزالة الهلاميات المائية من العفن بناء، وإسقاط الهلاميات المائية مباشرة إلى حمام من الفوسفات مخزنة المالحة 1X Dulbecco ومع كلوريد الكالسيوم وكلوريد المغنيسيوم. تغطية المواد الهلامية تماما ليغسل محلول كلوريد الكالسيوم الزائد عن 1-5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الهلاميات المائية إلى حل القاعدية وسائط النمو في طبق المطلوب (على سبيل المثال، 6 لوحات أيضا) التي تغطي تماما الهلاميات المائية. احتضان لمدة لا تقل عن 1 ساعة في الحاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 قبل المتابعة إلى الخطوة طبقات. ملاحظة: الهلاميات المائية التي تحتوي على خلايا يمكن أن تبقى فيهو المطلوب حاضنة الثقافة الخلية إلى أجل غير مسمى في هذا الوقت حتى طبقات من المواد الهلامية مع السكان خلية أخرى، شريطة أن يتم الانتهاء من التغييرات وسائل الاعلام كل 2-3 أيام. </li></ol> 3. طبقات من الجينات أقراص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلال النصف ساعة الأخيرة من حضانة 1 ساعة، جمع وإعداد قوالب معقمة وحل لوالصلب والمواد الهلامية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد &quot;العفن قطع&quot; بواسطة الربط قالب التي لديها آبار نصف ذروة &quot;هلام تشكيل العفن&quot; (6 مم × 1.5 مم الآبار طويل القامة في 3 في × 3 في لوحة الألومنيوم) إلى endplate (3 في العاشر 3 في لوحة الألومنيوم) باستخدام مقاطع الموثق على الجانبين الأيسر والأيمن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد &quot;القالب الصلب&quot; بواسطة الربط قالب الذي هو 3 مم أكبر في القطر من &quot;تشكيل العفن هلام&quot; (مم 9 × 3 مم الآبار طويل القامة في 3 في × 3 في لوحة الألومنيوم) إلى endplate (3 في العاشر 3 في لوحة الألومنيوم) باستخدام مقاطع الموثق على الجانبين الأيسر والأيمن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل100 ملي سترات الصوديوم / 30 ملي EDTA (الصوديوم سترات ثنائي الهيدرات، ethylenediaminetetraacetic حمض رباعي ملح ثنائي الهيدرات) في الماء المعقم. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المواد الهلامية من السكان الخلية المطلوبة (في هذا المثال، اثنين من الأقراص مع hMSCs) من وسائل الإعلام في الطبق، وتضع في الآبار &quot;قطع قالب&quot;. كل هلام ينبغي أن تناسب بشكل مريح في الآبار مع نصف من هلام جاحظ فوق القالب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مشرط، شريحة الجل على طول سطح القالب (وهذا سوف يقلل هيدروجيل في نصف). الوجه النصف العلوي من هلام ووضعه في العفن جيدا مفتوحة. يجب النصف من هلام أيضا تناسب بشكل مريح في القالب بشكل جيد، ولكن الآن كل من المواد الهلامية نصف ينبغي أن يكون ارتفاع القالب مع السطح الداخلي قطع مرئية. كرر مع هلام الثاني. ملاحظة: تحذير: سوف فقط قطع الأسطح الداخلية تشكل أقراص الطبقات. وذلك باستخدام الأسطح الخارجية يؤدي إلى فصل نصفين. ويشتبه في أن نسيج من الغشاء microsieve نقلها على سطح هلام منعالصورة نجاح عملية الصلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع قطعة من جفاف الغشاء الخلوي microsieve على الجزء العلوي من الآبار، والتأكد من أن غشاء microsieve على اتصال مع كل من نصفي هلام إلى أن صلب وتغطيتها تماما. ضع ورق الترشيح سميكة على رأس الغشاء microsieve، مع التأكد من تغطية المواد الهلامية تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة حل من 100 ملي سترات الصوديوم / 30 ملي EDTA (ثنائي الهيدرات سيترات الصوديوم، Ethylenediaminetetraacetic حمض رباعي ملح ثنائي الهيدرات) على ورقة الترشيح سميكة حتى يتشبع بها. ما يقرب من 750 ميكرولتر كافية لأربعة آبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان المواد الهلامية لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم، وإزالة غشاء الخلية microsieve وورق الترشيح سميكة والتخلص منها. إزالة لقطات الموثق وفتح القالب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل جيل صلب، ونقل احد سيترات الصوديوم / المعالجة EDTA نصف هيدروجيل إلى استعداد &quot;القالب الصلب&quot; مع سطح قطع متجهة لأعلى. وسيكون هذا نصف CONST صلبruct. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملعقة، ورفع ووضع سيترات الصوديوم الثاني / المعالجة EDTA نصف هلام (قد تحتوي على نوع من الخلايا المختلفة) على هلام بالفعل في &quot;القالب الصلب&quot;، التقليب هذا الشوط الثاني جل بحيث سطح الخفض هو في الاتصال مع سطح قطع من هلام بالفعل في &quot;القالب الصلب&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط بلطف إلى أسفل على المواد الهلامية اثنين باستخدام ملعقة لإزالة أي فقاعات بين لالهلام اثنين. أيضا، إعادة المواد الهلامية حسب الحاجة للتأكد من أن أنها مباشرة على رأس واحد آخر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع بلطف &quot;القالب الصلب&quot; ويغرق في حمام كلوريد الكالسيوم 102 ملي لمدة 30 دقيقة. لا تغطي الآبار مع endplate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد حضانة 30min في، إزالة &quot;القالب الصلب&quot; ووضعه على مناشف ورقية. إزالة لقطات الموثق وفصل القالب من endplate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملعقة، وجمع المواد الهلامية صلب ووضعها في الفوسفات مخزنة المالحة و1X Dulbecco ومع كلوريد الكالسيوم ومحمام كلوريد agnesium لغسل المواد الهلامية. وفي وقت لاحق، ونقل الهلاميات المائية صلب وسائل الإعلام ثقافة الخلية في طبق المطلوب (على سبيل المثال، لوحة 6 جيدا) للثقافة. </li></ol>

<ol>
	<li>Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Basic+Science+of+Articular+Cartilage.">The Basic Science of Articular Cartilage.</a> Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).</li><li>Neidlinger-Wilke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+loading+of+the+intervertebral+disc:+from+the+macroscopic+to+the+cellular+level.">Mechanical loading of the intervertebral disc: from the macroscopic to the cellular level.</a> Eur. Spine J. 23 (3), 333-343 (2013).</li><li>Klein, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+of+stratified+articular+cartilage+from+chondrocyte+subpopulations.">Tissue engineering of stratified articular cartilage from chondrocyte subpopulations.</a> Osteoarth. Cartilage. 11 (8), 595-602 (2003).</li><li>Han, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-free+Grafts+for+Articular+Cartilage+Defects.">Scaffold-free Grafts for Articular Cartilage Defects.</a> Clin. Orthop. Relat. R. 466 (8), 1912-1920 (2008).</li><li>Ng, K. W., Ateshian, G. A., Hung, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zonal+chondrocytes+seeded+in+a+layered+agarose+hydrogel+create+engineered+cartilage+with+depth-dependent+cellular+and+mechanical+inhomogeneity.">Zonal chondrocytes seeded in a layered agarose hydrogel create engineered cartilage with depth-dependent cellular and mechanical inhomogeneity.</a> Tissue Eng. A. 15 (9), 2315-2324 (2009).</li><li>Ng, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+layered+agarose+approach+to+fabricate+depth-dependent+inhomogeneity+in+chondrocyte-seeded+constructs.">A layered agarose approach to fabricate depth-dependent inhomogeneity in chondrocyte-seeded constructs.</a> J. Orthop. Res. 23 (1), 134-141 (2005).</li><li>Nguyen, L. H., Kudva, A. K., Saxena, N. S., Roy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+articular+cartilage+with+spatially-varying+matrix+composition+and+mechanical+properties+from+a+single+stem+cell+population+using+a+multi-layered+hydrogel.">Engineering articular cartilage with spatially-varying matrix composition and mechanical properties from a single stem cell population using a multi-layered hydrogel.</a> Biomaterials. 32 (29), 6946-6952 (2011).</li><li>Leone, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+multilayered+composite+hydrogel+as+osteochondral+substitute.">Continuous multilayered composite hydrogel as osteochondral substitute.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 103 (8), 2521-2530 (2015).</li><li>Lai, J. H., Kajiyama, G., Smith, R. L., Maloney, W., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+catalyze+cartilage+formation+by+neonatal+articular+chondrocytes+in+3D+biomimetic+hydrogels.">Stem cells catalyze cartilage formation by neonatal articular chondrocytes in 3D biomimetic hydrogels.</a> Sci. Rep. 3, (2013).</li><li>Vigf&#250;sd&#242;ttir, &. #. 1. 9. 3. ;. T., Pasrija, C., Thakore, P. I., Schmidt, R. B., Hsieh, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Pericellular+Matrix+in+Mesenchymal+Stem+Cell+Deformation+during+Chondrogenic+Differentiation.">Role of Pericellular Matrix in Mesenchymal Stem Cell Deformation during Chondrogenic Differentiation.</a> Cell. Mol. Bioeng. 3 (4), 387-397 (2010).</li><li>Lee, C. S. D., Gleghorn, J. P., Won Choi, N., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+layered+chondrocyte-seeded+alginate+hydrogel+scaffolds.">Integration of layered chondrocyte-seeded alginate hydrogel scaffolds.</a> Biomaterials. 28 (19), 2987-2993 (2007).</li><li>Gleghorn, J. P., Lee, C. S. D., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesive+properties+of+laminated+alginate+gels+for+tissue+engineering+of+layered+structures.">Adhesive properties of laminated alginate gels for tissue engineering of layered structures.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 85 (3), 611-618 (2008).</li><li>Gharravi, A. M., Orazizadeh, M., Ansari-Asl, K., Banoni, S., Izadi, S., Hashemitabar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+Fabrication+of+Anatomical+Bioreactor+Systems+Containing+Alginate+Scaffolds+for+Cartilage+Tissue+Engineering.">Design and Fabrication of Anatomical Bioreactor Systems Containing Alginate Scaffolds for Cartilage Tissue Engineering.</a> Avicenna J. Med. Biotechnol. 4 (2), 65-74 (2012).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondrogenic+Differentiation+of+Human+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Three-Dimensional+Alginate+Gels.">Chondrogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells in Three-Dimensional Alginate Gels.</a> Tissue Eng. A. 14 (5), 667-680 (2008).</li><li>Yeatts, A. B., Gordon, C. N., Fisher, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+an+aggregated+alginate+construct+in+a+tubular+perfusion+system.">Formation of an aggregated alginate construct in a tubular perfusion system.</a> Tissue Eng. C, Methods. 17 (12), 1171-1178 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

هنا، نحن تصف بروتوكول لتشكيل الطبقات أقراص هيدروجيل الجينات لدراسة شارك في ثقافات السكان الخلية متعددة، مثل تلك الموجودة في الأنسجة الطبقات من الناحية الفسيولوجية، على سبيل المثال، والغضروف. هياكل الطبقات، مثل منصة الثقافة وصفها، ويمكن استخدامها لدراسة التف?...

الضغط الحاملة الأنسجة مثل الغضاريف المفصلية أو الأقراص الفقرية تتكون من مناطق الأنسجة غير المتجانسة التي تعتبر بالغة الأهمية لكلا ظيفة النشاط الحيوي ومناسبة والميكانيكية تنبيغ في الأنسجة. ليس فقط هو تنظيم الخلوية وظيفة متميزة في مختلف المناطق، ولكن تباينت مصفوفات خارج الخلية (ECM) أيضا في تكوين وتنظيم. على سبيل المثال، والغضروف المفصلي يتكون من ثلاث مناطق رئيسية مع اختلاف شكل الخلية، وظيفة الميكانيكية، وECM. الاختلافات في المبادرة ECM لالتفاضلية المسؤوليات الحاملة. وتشارك الطبقة السطحية في المقام الأول ردا الشد لتحميل، في حين أن المناطق الوسطى وعميقة مسؤولة أساسا للاستجابة لضغط 1. وبالمثل، في القرص الفقري، وحاصرت النواة اللبية هلامية من التليف رقائقي بالطوق والخلايا داخل هذه المناطق متميزة اثنين من تجربة أنواع مختلفة من المحفزات الطبيعية الحيوية2. في هذا النوع من الأنسجة والخلايا ومصفوفات خارج الخلية داخل طبقات الأنسجة تتفاعل مع بعضها البعض كما يخضع الأنسجة وتستجيب لقوى ميكانيكية. تبقى خلاصة من هذه الهياكل الأنسجة غير المتجانسة تحديا في هندسة الأنسجة والطب التجديدي، وفهمنا من الأهمية البيولوجية محدودة. هناك حاجة لزراعة منصات لتحليل الأنسجة الطبقية وكذلك شارك في ثقافات مجموعات مختلفة من الخلايا في بناء واحد. في هندسة الأنسجة الغضروف المفصلي، تم تشييد بنيات-سقالة أقل الطبقات عن طريق تسخير قدرة غضروفية مناطقية لإيداع ECM متنوعة لتقليد طبقات مختلفة من هذا النسيج 3،4. ومع ذلك، توفر بنيات هيدروجيل الطبقات فرصة لتحقيق تفاعل الأنواع المختلفة للسكان الخلية التي تفتقر إلى القدرة على تكوين الأنسجة قوية بشكل مستقل. على سبيل المثال، والبوب ​​مختلفةulations الخلايا الجذعية الوسيطة يمكن أن يشترك في تربيتها داخل بنيات الطبقات. وقد استخدمت هذه السقالات الطبقات مع كل غضروفية والتفريق الخلايا الجذعية الوسيطة لتحسين هندسة الأنسجة 5. لا يمكن إلا أن يكون شارك في تربيتها السكان مختلفة من الخلايا في طبقات هيدروجيل مماثلة، ولكن يمكن أيضا نوع وحيد الخلية يمكن تربيتها داخل الطبقات التي تم التلاعب بها لديك متفاوتة الصلابة أو المحتوى الكيميائي لانتزاع استجابات مختلفة من الخلايا 6،7. وقد استخدمت العديد من الهلاميات المائية بيولوجية مختلفة لطبقة السكان الخلية لهندسة الأنسجة الغضروف مثل تلك التي تستخدم البولي ايثيلين جلايكول أو بولي فينيل الكحول قواعد 7-9. ومع ذلك، الهلاميات المائية الجينات هي واحدة من أبسط المواد الحيوية من خلالها إنشاء السقالات الطبقات لدراسة السكان الخلية غير متجانسة في الثقافة المشتركة. في حين شكلت أيضا الهلاميات المائية الاغاروز بسهولة، الهلاميات المائية الجينات لها فائدة إضافية تتمثل في السماح السهل هوolation من الخلايا من بناء 3-D لتحليل الخلايا الفردية كما وصفت سابقا 10. في دراسات سابقة، وقد تم تشكيل الهلاميات المائية الجينات ثنائية الطبقات في صفائح رقيقة ومن هذه الأوراق، وشرائح أقسام (على سبيل المثال، باستخدام لكمة خزعة) لتطبيقات معينة مثل لتحليل المحتوى الكيميائي أو خصائص القص بينية 11،12. وقد وصفت طريقة أخرى لتشكيل صفائح الجينات رقيقة مع إمكانية التقسيم إلى طبقات متعددة، ولكن لا يزال يتطلب تغيير في هيدروجيل لاستخدامها في اختبار الميكانيكية 13. هنا، فإننا نقدم وسيلة لخلق بتكاثر أقراص هيدروجيل الجينات ثنائية الطبقات لاستخدامها في زراعة-المشارك مجموعات مختلفة من الخلايا. هذه المنصة القرص الجينات تمتلك العديد من المزايا. في المقام الأول، وشكل استنساخه وحجم صغير يؤدى لالتحفيز الميكانيكي للخلايا جزءا لا يتجزأ من دون الحاجة إلى خزعة بوNCH ​​أو غيرها من التغيير المادي للهيدروجيل للعديد من التطبيقات. بالإضافة إلى ذلك، لا تزال بقاء الخلية عالية أثناء عملية التصفيف، وبعد تشكيل هلام فصل واضح من السكان الخلية اثنين داخل هلام غير مرئية مع أي منطقة متداخلة الأولية.

<table><tbody><tr><td>Alginic Acid sodium salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1112</td><td>Solution made in wt% using DPBS (-/-)</td></tr><tr><td>1x Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline (-/-)</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>1x Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline (+/+)</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>11965</td><td>Example. Use desired medium type</td></tr><tr><td>Syringe Filters (0.02 &amp;#956;m Nylon)</td><td>FisherBrand</td><td>0979C</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride Dihydrate</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP510</td><td>Prepare solution in sterile water</td></tr><tr><td>Criterion Blotter Filter Paper</td><td>Biorad</td><td>1704085</td><td>Cut to size of endplates for mold formation</td></tr><tr><td>Cell Microsieve Membrane (10 &amp;#956;m pore size)</td><td>Biodesign Inc of New York</td><td>N10R</td><td>Cut to size of endplates for mold formation</td></tr><tr><td>Sodium citrate dihydrate</td><td>FisherScience</td><td>S93364</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate (EDTA)</td><td>FisherBioreagent</td><td>BP121</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&amp;nbsp;</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>26140</td><td>Used in example mesenchymal stem cell basal growth media</td></tr><tr><td>Penicilin/Streptomycin (10,000 U/ml)</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>15140</td><td>Used in example mesenchymal stem cell basal growth media</td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>25030081</td><td>Used in example mesenchymal stem cell basal growth media</td></tr><tr><td>Non-essential Amino Acids (100x)</td><td>Gibco Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>11140050</td><td>Used in example mesenchymal stem cell basal growth media</td></tr></tbody></table>

layered alginate constructs: a platform for co-culture of heterogeneous cell populations

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential mechanosensing characteristics. Engineering and analysis of these tissue types remain a challenge. Layered hydrogel constructs provide an opportunity for investigating the interactions among multiple cell populations within single constructs. Alginate hydrogels are both biocompatible and allow for easy isolation of cells after experimentation. Here, we describe a method for the development of small sized dual layered alginate hydrogel discs. This process maintains high cell viability of human mesenchymal stem cells during the formation process and these layered discs can withstand unconfined cyclic compression, commonly used for stimulation of hMSCs undergoing chondrogenesis. These layered constructs can potentially be scaled up to include additional levels, and also be used to segregate cell populations initially after layering. This dual layer alginate hydrogel culture platform can be used for many different applications including engineering and analysis of cells of load bearing tissues and co-cultures of other cell types.

الشكل 1 يصور تشكيل وطبقات من الهلاميات المائية الجينات. أكملت المواد الهلامية ثنائية الطبقات يحمل الفصل الأول كاملة من السكان الخلية كما هو مبين في الشكل 2. بقاء الخلية من الخلايا الجذعية الوسيطة الإنسان) جزءا لا يتجزأ من داخل هذه ?...

Watch this Scientific Journal Video about Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations at JoVE.com

Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct.

الطبقات الجيني التركيبات: منصة لالمشارك ثقافة بالسكان خلية غير المتجانسة

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

layered-alginate-constructs-platform-for-co-culture-heterogeneous

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.8K Views.  University of Maryland. Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct. 

Video: Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

Microfabricated المنصات الحيوي للثقافة الخلية ميكانيكيا

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ovarian cancers is still in question and might be either the ovarian surface epithelium (OSE) or the distal epithelium of the fallopian tube fimbriae2,3. Culturing the normal cells as a primary culture in vitro will enable scientists to model specific changes that might lead to ovarian cancer in the distinct epithelium, thereby definitively determining the cell type of origin. This will allow development of more accurate biomarkers, animal models with tissue-specific gene changes, and better prevention strategies targeted to this disease.
Maintaining normal cells in alginate hydrogels promotes short term in vitro culture of cells in their three-dimensional context and permits introduction of plasmid DNA, siRNA, and small molecules. By culturing organs in pieces that are derived from strategic cuts using a scalpel, several cultures from a single organ can be generated, increasing the number of experiments from a single animal. These cuts model aspects of ovulation leading to proliferation of the OSE, which is associated with ovarian cancer formation. Cell types such as the OSE that do not grow well on plastic surfaces can be cultured using this method and facilitate investigation into normal cellular processes or the earliest events in cancer formation4.
Alginate hydrogels can be used to support the growth of many types of tissues5. Alginate is a linear polysaccharide composed of repeating units of &beta;-D-mannuronic acid and &alpha;-L-guluronic acid that can be crosslinked with calcium ions, resulting in a gentle gelling action that does not damage tissues6,7. Like other three-dimensional cell culture matrices such as Matrigel, alginate provides mechanical support for tissues; however, proteins are not reactive with the alginate matrix, and therefore alginate functions as a synthetic extracellular matrix that does not initiate cell signaling5. The alginate hydrogel floats in standard cell culture medium and supports the architecture of the tissue growth in vitro.
A method is presented for the preparation, separation, and embedding of ovarian and oviductal organ pieces into alginate hydrogels, which can be maintained in culture for up to two weeks. The enzymatic release of cells for analysis of proteins and RNA samples from the organ culture is also described. Finally, the growth of primary cell types is possible without genetic immortalization from mice and permits investigators to use knockout and transgenic mice.

Culture of normal cells in their three-dimensional context represents an alternative method to study early events required for cellular transformation and tumorigenesis. This method is used to grow normal ovarian and oviductal cells to study early events in ovarian cancer formation.

ألجينات الهلاميات المائية للثقافة الجهاز ثلاثي الأبعاد من المبيضين وناقلة البيضات

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening. However, the development of a mass culture system would be required for using PS cells in these applications. Suspension culture is one promising culture method for the mass production of PS cells, although some issues such as controlling aggregation and limiting shear stress from the culture medium are still unsolved. In order to solve these problems, we developed a method of calcium alginate (Alg-Ca) encapsulation using a co-axial nozzle. This method can control the size of the capsules easily by co-flowing N2 gas. The controllable capsule diameter must be larger than 500 &#181;m because too high a flow rate of N2 gas causes the breakdown of droplets and thus heterogeneous-sized capsules. Moreover, a low concentration of Alg-Na and CaCl2 causes non-spherical capsules. Although an Alg-Ca capsule without a coating of Alg-PLL easily dissolves enabling the collection of cells, they can also potentially leak out from capsules lacking an Alg-PLL coating. Indeed, an alginate-PLL coating can prevent cellular leakage but is also hard to break. This technology can be used to research the stem cell niche as well as the mass production of PS cells because encapsulation can modify the micro-environment surrounding cells including the extracellular matrix and the concentration of secreted factors.

We established a method of encapsulating pluripotent stem cells (PS cells) into alginate hydrogel capsules using a co-axial nozzle. This prevents cells from aggregating excessively and limits the shear stress experienced by cells in suspension culture. The technique is applicable to the mass production of PS cells as well as research on stem cell niche.

تغليف الجينات المحفزة للخلايا الجذعية باستخدام فوهة المشارك المحوري

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Developmental Biology

Generation of Alginate Microspheres for Biomedical Applications

Alginate-based materials have received considerable attention for biomedical applications because of their hydrophilic nature, biocompatibility, and physical architecture. Applications include cell encapsulation, drug delivery, stem cell culture, and tissue engineering scaffolds. In fact, clinical trials are currently being performed in which islets are encapsulated in PLO coated alginate microbeads as a treatment of type I diabetes. However, large numbers of islets are required for efficacy due to poor survival following transplantation. The ability to locally stimulate microvascular network formation around the encapsulated cells may increase their viability through improved transport of oxygen, glucose and other vital nutrients. Fibroblast growth factor-1 (FGF-1) is a naturally occurring growth factor that is able to stimulate blood vessel formation and improve oxygen levels in ischemic tissues. The efficacy of FGF-1 is enhanced when it is delivered in a sustained fashion rather than a single large-bolus administration. The local long-term release of growth factors from islet encapsulation systems could stimulate the growth of blood vessels directly towards the transplanted cells, potentially improving functional graft outcomes. In this article, we outline procedures for the preparation of alginate microspheres for use in biomedical applications. In addition, we describe a method we developed for generating multilayered alginate microbeads. Cells can be encapsulated in the inner alginate core, and angiogenic proteins in the outer alginate layer. The release of proteins from this outer layer would stimulate the formation of local microvascular networks directly towards the transplanted islets.

In the following sections, we outline procedures for the preparation of alginate microspheres for use in biomedical applications. We specifically illustrate a technique for creating multilayered alginate microspheres for the dual purpose of cell and protein encapsulation as a potential treatment for type 1 diabetes.

جيل من المجهرية الجيني للتطبيقات الطبية الحيوية

Alginate-based materials have received considerable attention for biomedical applications because of their hydrophilic nature, biocompatibility, and ...

Medicine

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

خلية المشارك الثقافة الزخرفة باستخدام مائي مرحلتين أنظمة

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue geometry. The resulting 3D hydrogel-based cellular constructs have been introduced as an alternative to animal experiments for advanced biological studies, pharmacological assays and organ transplant applications. Although hydrogel-based particles and fibers can be easily fabricated, it is difficult to manipulate them for tissue reconstruction. In this video, we describe a fabrication method for micropatterned alginate hydrogel sheets, together with their assembly to form a macro-scale 3D cell culture system with a controlled cellular microenvironment. Using a mist form of the calcium gelling agent, thin hydrogel sheets are easily generated with a thickness in the range of 100 - 200 &#181;m, and with precise micropatterns. Cells can then be cultured with the geometric guidance of the hydrogel sheets in freestanding conditions. Furthermore, the hydrogel sheets can be readily manipulated using a micropipette with an end-cut tip, and can be assembled into multi-layered structures by stacking them using a patterned polydimethylsiloxane (PDMS) frame. These modular hydrogel sheets, which can be fabricated using a facile process, have potential applications of in vitro drug assays and biological studies, including functional studies of micro- and macrostructure and tissue reconstruction.

We describe the fabrication of micropatterned hydrogel sheets using a simple process, which can be assembled and manipulated in a freestanding form. Using these modular hydrogel sheets, a simple macro-scaled 3D cell culture system can be generated with a controlled cellular microenvironment.

بناء وحدات صفائح هيدروجيل لتحجيم الكلي Micropatterned 3D الخلوية العمارة

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Ultrathin Porated Elastic Hydrogels As a Biomimetic Basement Membrane for Dual Cell Culture

The basement membrane is a critical component of cellular bilayers that can vary in stiffness, composition, architecture, and porosity. In vitro studies of endothelial-epithelial bilayers have traditionally relied on permeable support models that enable bilayer culture, but permeable supports are limited in their ability to replicate the diversity of human basement membranes. In contrast, hydrogel models that require chemical synthesis are highly tunable and allow for modifications of both the material stiffness and the biochemical composition via incorporation of biomimetic peptides or proteins. However, traditional hydrogel models are limited in functionality because they lack pores for cell-cell contacts and functional in vitro migration studies. Additionally, due to the thickness of traditional hydrogels, incorporation of pores that span the entire thickness of hydrogels has been challenging. In the present study, we use poly-(ethylene-glycol) (PEG) hydrogels and a novel zinc oxide templating method to address the previous shortcomings of biomimetic hydrogels. As a result, we present an ultrathin, basement membrane-like hydrogel that permits the culture of confluent cellular bilayers on a customizable scaffold with variable pore architectures, mechanical properties, and biochemical composition.

Current bilayer culture models do not allow for functional in vitro studies that mimic in vivo microenvironments. Using polyethylene glycol and a zinc oxide templating method, this protocol describes the development of an ultrathin biomimetic basement membrane with tunable stiffness, porosity, and biochemical composition that closely mimics in vivo extracellular matrices.

سامسونج بوراتيد مطاطا الهلاميات المائية كغشاء الطابق السفلي المحاكاة البيولوجية لثنائي خلية ثقافة

The basement membrane is a critical component of cellular bilayers that can vary in stiffness, composition, architecture, and porosity. In vitro studies ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

ثلاثي الأبعاد الثقافة الجيني حبة من خلايا الإنسان ورم الغدة النخامية

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the interface with a liquid core. The latter is removed post-printing, leaving behind a hollow tube. Integrating an additive manufacturing technique (like the one described here with tailor-made [bio]inks, which structurally and biochemically mimic the native extracellular matrix [ECM]) is an important step towards advanced tissue engineering. However, precise fabrication of well-defined structures requires tailored fabrication strategies optimized for the material in use. Therefore, it is sensible to begin with a set-up that is customizable, simple-to-use, and compatible with a broad spectrum of materials and applications. This work presents an easy-to-manufacture core/shell nozzle with luer-compatibility to explore core/shell printing of woodpile structures, tested with a well-defined, alginate-based scaffold material formulation.

Presented here is a simple-to-use, core/shell, three-dimensional bioprinting set-up for one-step fabrication of hollow scaffolds, suitable for tissue engineering of vascular and other tubular structures.

الاساسيه/شل السقالات الطباعة للهندسة الانسجه من الهياكل أنبوبي

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the ...

Microgel-Extracellular Matrix Composite Support for the Embedded 3D Printing of Human Neural Constructs

The embedded 3D printing of cells inside a granular support medium has emerged in the past decade as a powerful approach for the freeform biofabrication of soft tissue constructs. However, granular gel formulations have been restricted to a limited number of biomaterials that allow for the cost-effective generation of large amounts of hydrogel microparticles. Therefore, granular gel support media have generally lacked the cell-adhesive and cell-instructive functions found in the native extracellular matrix (ECM).
To address this, a methodology has been developed for the generation of self-healing annealable particle-extracellular matrix (SHAPE) composites. SHAPE composites consist of a granular phase (microgels) and a continuous phase (viscous ECM solution) that, together, allow for both programmable high-fidelity printing and an adjustable biofunctional extracellular environment. This work describes how the developed methodology can be utilized for the precise biofabrication of human neural constructs.
First, alginate microparticles, which serve as the granular component in the SHAPE composites, are fabricated and combined with a collagen-based continuous component. Then, human neural stem cells are printed inside the support material, followed by the annealing of the support. The printed constructs can be maintained for weeks to allow the differentiation of the printed cells into neurons. Simultaneously, the collagen continuous phase allows for axonal outgrowth and the interconnection of regions. Finally, this works provides information on how to perform live-cell fluorescence imaging and immunocytochemistry to characterize the 3D-printed human neural constructs.

This work describes a protocol for the freeform embedded 3D printing of neural stem cells inside self-healing annealable particle-extracellular matrix composites. The protocol enables the programmable patterning of interconnected human neural tissue constructs with high fidelity.

The embedded 3D printing of cells inside a granular support medium has emerged in the past decade as a powerful approach for the freeform biofabrication ...