وأيد هذه الدراسة من قبل الولايات المتحدة وزارة الزراعة، دائرة البحوث الزراعية. وذكر الأسماء التجارية أو المنتجات التجارية في هذا المنشور فقط لغرض توفير معلومات محددة، ولا تعني توصية أو تأييد من قبل وزارة الزراعة في الولايات المتحدة. وزارة الزراعة الأميركية تساوي مزود الفرصة وصاحب العمل.

1. الطرفية هامش البكتيرية مستعمرة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو اكس. fastidiosa (XF) تيميكولا النوع البري 22، pilG حذف متحولة XF ΔpliG (باستخدام سبق وصفها استراتيجية حذف 23)، ولها مكملة XfΔpliG -C (باستخدام سبق وصفها القائم على كروموسوم استراتيجية تكامل الجيني 24) على PD2 لوحات المتوسطة أجار 25 عند 28 درجة مئوية لمدة 5-7 أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السيلوفان الأوتوكلاف (1 × 1 سم 2) في الماء عند 121 درجة مئوية (249 درجة فهرنهايت) لمدة 15 دقيقة. التقاط قطعة واحدة من السيلوفان، واستنزاف المياه من خلال لمس زاوية واحدة من السيلوفان على طبق بيتري فارغة، وضع بعناية السيلوفان أكثر من 15٪ من سطح أجار والهواء الجاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط فرد اكس. المستعمرات fastidiosa مع المسواك تقريب وخلايا بقعة عقيمة جو معقم و مطهر على ورقة تعقيمها من السيلوفان مضافين على 15٪ من سطح أجار في لوحات أجار. احتضان لوحةالصورة عند 28 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دراسة مورفولوجية حافة المستعمرات باستخدام مجهر تشريح مع عدسة الهدف 2X و10X عدسة العين. تصوير هامش المحيطي حول المستعمرات. </li></ol> 2. المجهري وميكروفلويديك غرف تدفق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صنع أجهزة ميكروفلويديك باستخدام إجراءات الصورة معدني مشابهة لتلك التي سبق وصفها 5،18. تصميم أربعة قنوات موازية مع برامج التصميم بمساعدة الكمبيوتر على سيد رقاقة السيليكون باستخدام أساليب الطباعة الحجرية القياسية 26. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء غرف ميكروفلويديك من سيد رقاقة السيليكون مع ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان (PDMS). صب PDMS unpolymerized على سيد رقاقة السيليكون وعلاجه عند 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. تقشر النسخة المتماثلة PDMS من سيد رقاقة وتقليم النسخة المتماثلة PDMS بشفرة إلى 22 ملم × 40 ملم ونفس الحجم من الزجاج ساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فضح النسخة المتماثلة PDMS، ساترة الزجاج (22 × 40 مم 2)، وmicroscشريحة مكتب مستشار رئيس الوزراء (51 × 76 مم 2) لالبلازما الجوية في 30 واط لمدة 2 دقيقة 27. شطيرة الجسم PDMS بين ساترة الزجاج وميكروسكوب لبناء غرفة uidic فلوريدا الصغيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفر حفرة (مم 5.5) من خلال PDMS في نهاية كل من قناة نمط. قطع أنابيب السيليكون والمطاط إلى 12-20 سم. إدراج واحدة من نهاية أنبوب السيليكون والمطاط (5.1 ملم خارج القطر، 2.1 ملم داخل القطر، 0.8 مم الجدار) في نهاية كل فتح القنوات من النسخة المتماثلة PDMS، وختم ذلك مع PDMS unpolymerized في 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط آخر من نهاية الأنبوب إلى نهاية الشائكة من الروابط LUER البلاستيكية. التفاف غرف ميكروفلويديك تجميعها مع رقائق الألومنيوم والأوتوكلاف لهم لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع البكتيريا خلايا اكس. fastidiosa النوع البري، متحولة XF ΔpliG، ومكملة XfΔpliG -C عبر كشط، وذلك باستخدام بتلقيح المتاح حلقات من لوحات PD2 المتوسطة. ضبط كثافة الخليةإلى الكثافة البصرية من 0.05 في 600 نانومتر في PD2 مرق كما هو موضح سابقا 23. جمع حل الخلية البكتيرية إلى حقنة Gastight 1 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تركيب جهاز ميكروفلويديك على مرحلة المجهر المقلوب. توصيل أنبوب مدخل إلى حقنة Gastight 5 مل تحتوي على PD2 مرق. تناسب Gastight حقنة 5 مل مع مضخات الحقنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توصيل أنبوب منفذ إلى خزان النفايات. الحفاظ على معدل التدفق المتوسط ​​من 0.2 دقيقة ميكرولتر -1 لمدة 30 دقيقة لتحقيق الاستقرار في النظام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط أنابيب الجانب مدخل إلى 1 مل Gastight حقنة تحتوي على محلول الخلية البكتيرية. مسح حل الخلية البكتيرية من خلال أنابيب مطاطية حتى يتم الوصول إلى القناة. الحفاظ على معدل التدفق المتوسط ​​من 0.2 دقيقة ميكرولتر -1 لمدة 30 دقيقة أخرى من أجل مطاردة خلايا غير منضم من الغرفة قبل التقاط الصورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل مصراع المجهر تحت الجزء المعدلة مجال المجهر للسيطرة على ضوء. ربط مصراع للتعاون مصراعنظام ntrol وربط نظام التحكم مصراع الكاميرا لجهاز الكمبيوتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل الكاميرا الرقمية إلى منفذ الفيديو المجهر وتوصيله إلى جهاز الكمبيوتر. تشغيل برنامج تسجيل مرور الزمن، حدد وظيفة &quot;مصراع&quot; من القائمة، والتعرف تلقائيا على مصراع الكاميرا المثبتة كما الافتراضي في البرنامج لتأسيس اتصالات لمصراع مع البرنامج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد وظيفة &quot;كاميرا رقمية&quot; من القائمة من برنامج تسجيل مرور الزمن إلى التعرف تلقائيا على الكاميرا الرقمية وجهاز الالتقاط الافتراضي في البرنامج وإقامة الاتصالات مع الكاميرا الرقمية مع البرنامج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد موقع الخلايا البكتيرية في واحدة من القنوات باستخدام 20X البصريات على النقيض من المرحلة، ثم التبديل إلى 40X عدسة الهدف قبل التقاط الصورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل برنامج تسجيل مرور الزمن، حدد وظيفة &quot;الحصول على الصور&quot; باستخدام المعلمات الافتراضية من القائمة للحصول على صور من المجهر.بعد ذلك، فتح وظيفة &quot;اكتساب الوقت الفاصل&quot;، وتعيين الفاصل الزمني إلى 30 ثانية 5،18،28 لمدة 6-24 ساعة اعتمادا على التجربة اللازمة لمراقبة الوخز الحركة من X. fastidiosa 5،18،28. انقر على زر &quot;موافق&quot; لبدء تسجيل مرور الزمن. انقر على &quot;وظيفة المكدس&quot; من القائمة، حدد &quot;حفظ باسم&quot; إلى كومة من الصور في مجلد الوجهة على جهاز الكمبيوتر بعد الانتهاء من التسجيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لقنوات متعددة، والتقاط الصور الوقت الفاصل بين من القناة الأولى كل 30 ثانية لمدة 6 ساعة. نقل عدسة الهدف من المجهر إلى القناة التالية لتحديد موقع الخلايا المستهدفة. تكرار الدالة مرور الزمن كما هو موضح أعلاه لالتقاط الصور في كل من أربع قنوات بالتتابع إذا تم تعيين التجربة حتى الاستفادة من أربع قنوات. مواصلة التقاط الصور الوقت الفاصل بين لطالما ثلاثة أيام متتالية. أجريت جميع التجارب في درجة حرارة الغرفة (23 ± 2 درجة مئوية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع الصور الوقت الفاصل إلىملف الفيديو باستخدام الوقت الفاصل بين برنامج تسجيل التصوير. تشغيل الوقت الفاصل بين تسجيل البرامج، انقر فوق &quot;وظيفة كومة&quot; من القائمة، ثم اختر &quot;وظيفة كومة مفتوحة&quot; لفتح الملفات مكدسة من الكمبيوتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء تشغيل وظيفة &quot;جعل الفيلم&quot; من وحدة كومة، واختيار جميع الصور واختيار &quot;افي&quot; تنسيق الإخراج. انقر فوق &quot;حفظ باسم&quot; لتخزين ملف الفيديو في مجلد الوجهة على الكمبيوتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار الأفلام التي تم تجميعها من المجلد الوجهة على الكمبيوتر واللعب بها. ثم، ومراقبة الحركة من الخلايا واحد من خلال التصور الناتجة من النشاط الوخز حركية من خلايا البكتيريا الموجودة في ملفات الفيديو التي تم إنشاؤها. </li></ol>

<ol>
	<li>Purcell, A. H., Hopkins, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fastidious+xylem-limited+bacterial+plant+pathogens.">Fastidious xylem-limited bacterial plant pathogens.</a> Annu. Rev. Phytopathol. 34, 131-151 (1996).</li><li>Purcell, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xylella+fastidiosa,+a+regional+problem+or+global+threat.">Xylella fastidiosa, a regional problem or global threat.</a> J. Plant Pathology. 79, 99-105 (1997).</li><li>Hopkins, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xylella+fastidiosa:+Xylem-limited+bacterial+pathogen+of+plants.">Xylella fastidiosa: Xylem-limited bacterial pathogen of plants.</a> Annu. Rev. Phytopathol. 27, 271-290 (1989).</li><li>Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+IV+pili+and+twitching+motility.">Type IV pili and twitching motility.</a> Annu. Rev. Microbiol. 56, 289-314 (2002).</li><li>Meng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upstream+migration+of+Xylella+fastidiosa+via+pilus-driven+twitching+motility.">Upstream migration of Xylella fastidiosa via pilus-driven twitching motility.</a> J. Bacteriol. 187, 5560-5567 (2005).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+and+type+IV+pili+of+Xylella+fastidiosa+affect+twitching+motility,+biofilm+formation+and+cell-cell+aggregation.">Type I and type IV pili of Xylella fastidiosa affect twitching motility, biofilm formation and cell-cell aggregation.</a> Microbiology. 153, 719-726 (2007).</li><li>Simpson, A. J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+sequence+of+the+plant+pathogen+Xylella+fastidiosa.">The genome sequence of the plant pathogen Xylella fastidiosa.</a> Nature. 406, 151-157 (2000).</li><li>Maier, B., Potter, L., So, M., Long, C. D., Seifert, H. S., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+pilus+motor+forces+exceed+100+pN.">Single pilus motor forces exceed 100 pN.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 16012-16017 (2002).</li><li>Touhami, A., Jericho, M. H., Boyd, J. M., Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+characterization+and+determination+of+adhesion+forces+of+Pseudomonas+aeruginosa+pili+by+using+atomic+force+microscopy.">Nanoscale characterization and determination of adhesion forces of Pseudomonas aeruginosa pili by using atomic force microscopy.</a> J. Bacteriol. 188, 370-377 (2006).</li><li>Skerker, J. M., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+extension+and+retraction+of+type+IV+pili.">Direct observation of extension and retraction of type IV pili.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 6901-6904 (2001).</li><li>Brown, D. C., Larson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvements+to+parallel+plate+flow+chambers+to+reduce+reagent+and+cellular+requirements.">Improvements to parallel plate flow chambers to reduce reagent and cellular requirements.</a> BMC Immunol. 2, 9 (2001).</li><li>Thomas, W. E., Nilsson, L. M., Forero, M., Sokurenko, E. V., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-dependent+'stick-and-roll'+adhesion+of+type+1+fimbriated+Escherichia+coli.">Shear-dependent 'stick-and-roll' adhesion of type 1 fimbriated Escherichia coli.</a> Mol. Microbiol. 53, 1545-1557 (2004).</li><li>Thomas, W. E., Trintchina, E., Forero, M., Vogel, V., Sokurenko, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+adhesion+to+target+cells+enhanced+by+shear+force.">Bacterial adhesion to target cells enhanced by shear force.</a> Cell. 109, 913-923 (2002).</li><li>Bahar, O., Fuente, D. L., Burdman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+adhesion,+biofilm+formation+and+motility+of+Acidovorax+citrulli+using+microfluidic+flow+chambers.">Assessing adhesion, biofilm formation and motility of Acidovorax citrulli using microfluidic flow chambers.</a> FEMS Microbiol. Lett. 312, 33-39 (2010).</li><li>Thomas, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+laminar+flow+system+to+explain+shear-enhanced+bacterial+adhesion.">Using a laminar flow system to explain shear-enhanced bacterial adhesion.</a> Proceedings of ICMM2005, Third International Conference on Microchannels and Mini-channels. , 751-759 (2005).</li><li>Fuente, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+adhesion+forces+of+type+I+and+type+IV+pili+of+Xylella+fastidiosa+bacteria+by+use+of+a+microfluidic+flow+chamber.">Assessing adhesion forces of type I and type IV pili of Xylella fastidiosa bacteria by use of a microfluidic flow chamber.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 2690-2696 (2007).</li><li>DeLange, P. A., Collins, T. L., Pierce, G. E., Robinson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PilJ+localizes+to+cell+poles+and+is+required+for+type+IV+pilus+extension+in+Pseudomonas+aeruginosa.">PilJ localizes to cell poles and is required for type IV pilus extension in Pseudomonas aeruginosa.</a> Curr Microbiol. 55, 389-395 (2007).</li><li>Fuente, D. L., Burr, T. J., Hoch, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+type+I+and+type+IV+pilus+biosynthetic+genes+affect+twitching+motility+rates+in+Xylella+fastidiosa.">Mutations in type I and type IV pilus biosynthetic genes affect twitching motility rates in Xylella fastidiosa.</a> J. Bacteriol. 189, 7507-7510 (2007).</li><li>Ferandez, A., Hawkins, A. C., Summerfield, D. T., Harwood, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cluster+II+che+genes+from+Pseudomonas+aeruginosa+are+required+for+an+optimal+chemotactic+response.">Cluster II che genes from Pseudomonas aeruginosa are required for an optimal chemotactic response.</a> J. Bacteriol. 184, 4374-4383 (2002).</li><li>Cursino, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+Operon,+Pil-Chp,+That+Controls+Twitching+Motility+and+Virulence+in+Xylella+fastidiosa.">Identification of an Operon, Pil-Chp, That Controls Twitching Motility and Virulence in Xylella fastidiosa.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 10, 1198-1206 (2011).</li><li>Hazelbauer, G. L., Falke, J. J., Parkinson, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+chemoreceptors:+High-performance+signaling+in+networked+arrays.">Bacterial chemoreceptors: High-performance signaling in networked arrays.</a> Trends Biochem. Sci. 33, 9-19 (2008).</li><li>Costa, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+hosts+of+Xylella+fastidiosa+in+and+near+southern+California+vineyards.">Plant hosts of Xylella fastidiosa in and near southern California vineyards.</a> Plant Dis. 88, 1255-1261 (2004).</li><li>Shi, X. Y., Dumenyo, C. K., Hernandez-Martinez, R., Azad, H., Cooksey, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+regulatory+pathways+in+Xylella+fastidiosa:+genes+and+phenotypes+controlled+by+algU.">Characterization of regulatory pathways in Xylella fastidiosa: genes and phenotypes controlled by algU.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 6748-6756 (2007).</li><li>Matsumoto, A., Young, G. M., Igo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome-Based+Genetic+Complementation+System+for+Xylella+fastidiosa.">Chromosome-Based Genetic Complementation System for Xylella fastidiosa.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75, 1679-1687 (2009).</li><li>Davis, M. J., Purcell, A. H., Thomson, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+Media+for+the+Pierce's+Disease+Bacterium.">Isolation Media for the Pierce's Disease Bacterium.</a> Phytopathology. 70, 425-429 (1980).</li><li>Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography.">Soft lithography.</a> Annu. Rev. Mater. Sci. 28, 153-184 (1998).</li><li>Chaudhury, M. K., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+interfacial+interactions+between+semispherical+lenses+and+flat+sheets+of+poly-(dimethylsiloxane)+and+their+chemical+derivatives.">Direct measurement of interfacial interactions between semispherical lenses and flat sheets of poly-(dimethylsiloxane) and their chemical derivatives.</a> Langmuir. 7, 1013-1025 (1991).</li><li>Cruz, L. F., Parker, J. K., Cobine, P. A., De La Fuente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-enhanced+twitching+motility+in+Xylella+fastidiosa+is+linked+to+a+single+PilY1+homolog.">Calcium-enhanced twitching motility in Xylella fastidiosa is linked to a single PilY1 homolog.</a> Appl. Environ. Microbiol. 80, 7176-7196 (2014).</li></ol>

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

في هذه الدراسة، ونحن ميزت سلوك حركة اكس. fastidiosa PilG متحولة XF ΔpilG ومتكاملة سلالات XfΔpilG- C في المصممة حديثا متعددة متوازية نانو قناة الصغرى غرف uidic فلوريدا. لا تستطيع الدوائر uidic المصممة حديثا الصغير فلوريدا قد تصل إلى أربع قاعات متوازية مع 100 ميكرو?...

Xylella fastidiosa هو غير سوطي، البكتيريا المسببة للأمراض سلبية الغرام التي تسبب عددا من الأمراض المحاصيل ذات الأهمية الاقتصادية، بما في ذلك مرض بيرس في الكرمة (كرمة العنب الاوروبي L.) 1،2، 3. هذه البكتيريا يقتصر على الخشب التي تضطلع المياه أوعية. إصابة الكرمة يتسبب في انسداد الأوعية الخشب والنتائج في الإجهاد المائي ونقص التغذية 3. الاستعمار الناجح يعتمد على قدرة بكتيريا للانتقال من موقع الأولي العدوى إلى بقية النبات 3. الوخز حركية وسيلة لحركة البكتيرية مستقلة سوطي من خلال الإرشاد، والمرفق، وتراجع من نوع القطبي الرابع البيلي 4 التي اتسمت في اكس. fastidiosa 5،6،7. وقد لوحظ أن الحركة الوخز بواسطة ملاقط الليزر ومجهر القوة الذرية (AFM) 8،9،10. باستخدام هذه التقنيات، رmotilities السحر ولدت من النوع الرابع شعرة من N. السيلان و P. تميزت الزنجارية التي كتبها فلوريدا uorescently وضع العلامات البيلي والاستيلاء على تحركاتهم مجهريا. على الرغم من أن كلتا الطريقتين قد فصلت قوة لاصقة من البكتيريا الفردية، وإجراءات معقدة وتستغرق وقتا طويلا 9،10. استخدمت الدوائر uidic فلوريدا الصغيرة لمراقبة الهجرة لمسافات طويلة من الخلايا الفردية، وكذلك مجاميع صغيرة من الخلايا البكتيرية 5،6. وقد صممت هذه الغرف باعتبارها نانو قناة microfabricated في لوحة متكاملة مع الوقت الفاصل بين نظام تسجيل صورة 11،12،13،14. فلوريدا مايكرو الأجهزة غرفة uidic توفر مزايا عدة لدراسة السلوك الحركي وخلية خلية التفاعلات من البكتيريا: (ط) أنه يوفر منصة متكاملة مع قدرات قناة متعددة؛ (ب) فإنه يمكن دراسة الاقتراحات وتجمعات من الخلايا وحيدة في ملامح نانو النطاق من البكتيريا. (ج) لأنها تتيح م مباشرicroscopic تسجيل صورة من الخلايا البكتيرية وتحليل الوقت الفاصل، (د) ويوفر الملاحظات المكانية والزمانية على المدى الطويل من سكان الفردية و / أو من البكتيريا في بيئة الصغرى؛ (ت) معدل التدفق من مستنبت في قناة يمكن التحكم بدقة ومطلوب (السادس) فقط حجم صغير جدا (1 مل) من مستنبت لكل تجربة. في الآونة الأخيرة، وقد تم توظيف الجزئي فلوريدا uidic آه فلوريدا نظام للتحقيق في سلوك الخلايا البكتيرية في إطار مختلف microenvironments 14،15،16. والإلتصاق والمرفق سطح E. القولونية 15، X. fastidiosa 16، وAcidovorax citrulli 14 إلى الواجهات الزجاجية وتقييمها باستخدام الصغير فلوريدا غرف uidic. وقد تم تحليل تشكيل تجميع وفاي الحيوي ل م بوساطة النوع الرابع الشعرة من Acidovorax citrulli 14. وعلاوة على ذلك، فإن الحركة من أ. لاحظ citrulli تحت آه فلوريدا جتظاهر onditions أن البيلي النوع الرابع قد تلعب أدوارا هامة في الاستعمار وانتشار A. citrulli في الأوعية الخشب تحت النسغ آه فلوريدا الظروف. وmotilities الوخز الزائفة الزنجارية وX. وقد لوحظت خلايا fastidiosa بنجاح ضد تيار السائل في غرفة تدفق microfabricated 5،6،17. نقص النوع الرابع شعرة pilB وpilQ المسوخ من X. تم العثور على fastidiosa إلى تغيير عميق في سرعة الوخز الحركة في ظل الظروف آه فلوريدا في الأجهزة uidic فلوريدا الصغيرة 5،6،18. وأشارت الدراسات التي أجريت على التصاق البكتيريا والحركة في الأجهزة uidic فلوريدا الصغرى أن الدوائر uidic الصغير فلوريدا هي مناسبة خاصة لتحليل حركية الوخز والهجرة من البكتيريا بوساطة البيلي في المختبر. تفسر هذه النتائج آلية الهجرة بوساطة الوخز مما يسهل التعلق خلية خلية، وتجميع والاستعمار فيالمضيف، تؤدي في النهاية إلى الإصابة النظامية. بيل-حزب الشعب الجمهوري الاوبرون من X. fastidiosa يحتوي pilG، بيلي، pilJ، حبوب منع الحمل، chpB وchpC التي مسارات إشارة ترميز التنبيغ 20. والمستقبلات الكيميائية عبر الغشاء ربط المحفزات الكيميائية في نطاق محيط بالجبلة وتفعيل شلال يشير في جزء حشوية قدرتهم على السيطرة في نهاية المطاف البكتيرية حركية الوخز. في الاوبرون بيل-حزب الشعب الجمهوري من X. fastidiosa، وهو بروتين PilG الفوسفات المكوك هو نديد لCHEY. في E. القولونية و P. الزنجارية، CHEY هو منظم استجابة في أنظمة الكيميائي التي تتفاعل مع بروتينات سياط محرك 19 و 21. على الرغم من أن مساهمات الاوبرون بيل-حزب الشعب الجمهوري نحو الفوعة في اكس. تم فحص fastidiosa مؤخرا 20، ودور pilG في الاوبرون الكيميائي في استجابة لإشارات البيئية وتنظيم / المحرك النوع الرابع الشعرة من X. fastidiosa هو UNCلير. لتوضيح فكرة الكيميائي منظم pilG في نشاط الحركة ارتعاش اكس. fastidiosa، يتم استخدام غرفة uidic فلوريدا متناهية الصغر لتقييم الحركة ارتعاش اكس. fastidiosa. يتميز pilG من اكس fastidiosa بمقارنة الظواهر من المسخ حذف XF ΔpliG، سلالة مكملة XfΔpliG -C والنوع البري في المختبر. تسلط هذه النتائج الضوء على دور pilG في الحركة ارتعاش اكس. fastidiosa.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Biology materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;X. fastidiosa (Xf)&lt;/em&gt; Temecula wild type</td><td></td><td></td><td>Costa, H. S., &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, 2004 &lt;sup&gt;22&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;pilG&lt;/em&gt; deletion mutant &lt;em&gt;Xf&amp;Delta;pliG&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>Shi, X. Y., &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, 2007 &lt;sup&gt;26&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;pilG&lt;/em&gt; complementary strain &lt;em&gt;Xf&amp;Delta;pliG&lt;/em&gt;-C&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>Davis, M. J., &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; 1998 &lt;sup&gt;23&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Physical materials and equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disposable inoculating loops</td><td>VWR international, Radnor, PA</td><td>#22-363-607</td><td>quantitative procedures such as bacterial collection</td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>#0002709226</td><td>Sylgard 184 silicone Elastomeric Kits</td></tr><tr><td>AmScope MD2000 digital camera</td><td>AmScope, Irvine, CA</td><td>SE305R-AZ-E</td><td>Image, video recording and measurement&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tubes line</td><td>Edgewood, NY</td><td>#T4300</td><td>Connected to the syringe and microfluidic chamber</td></tr><tr><td>Plastic luer connectors</td><td>Edgewood, NY</td><td></td><td>Connected to the syringe and microfluidic chamber</td></tr><tr><td>Syringe pumps</td><td>Pico Plus, Harvard Apparatus, MA</td><td>#702209</td><td>The flow rate can be adjusted while the pump is running.</td></tr><tr><td>Syringes</td><td>Gastight, Hemilton Company, Reno, NV</td><td>#1005</td><td>Provide the flowing broth</td></tr><tr><td>Inverted Olympus IMT-2 microscope</td><td>Olympus</td><td>IMT-2 FLuoro PHase</td><td>Image observation and recording</td></tr><tr><td>SPOT-RT digital camera</td><td>Diagnostic Instruments, Inc., MI</td><td>RT230</td><td>Image, video recording and measurement</td></tr><tr><td>Microscope Shutter</td><td>The &lt;em&gt;UNIBLITZ, US&lt;/em&gt;</td><td>#LS2T2</td><td>Control camera&amp;rsquo;s exposure time</td></tr><tr><td>Microscope Shutter Control system</td><td>The &lt;em&gt;UNIBLITZ, US&lt;/em&gt;</td><td>VCM-D1</td><td>VCM-D1 Single Channel CE/UL/CSA Approved Shutter Driver</td></tr><tr><td>MetaMorph Image software</td><td>Universal Imaging Corp., PA</td><td></td><td>Real-time super-resolution image processing&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

visualization of twitching motility and characterization of the role of the pilg in xylella fastidiosa

Xylella fastidiosa هو نوع من البكتيريا سالبة الجرام غير سوطي التي تسبب عددا من الأمراض الهامة اقتصاديا من النباتات. تقدم الحركة الوخز اكس. fastidiosa وسيلة للحركة لمسافات طويلة داخل المصنع والاستعمار، إذ تسهم نحو المرضية في اكس. fastidiosa. إن الحركة ارتعاش اكس. يتم تشغيل fastidiosa من النوع الرابع الشعرة. وينظم النوع الرابع الشعرة من Xylella fastidiosa التي كتبها pilG، منظم الكيميائي في بيل-حزب الشعب الجمهوري البروتينات ترميز الاوبرون التي تشارك مع مسارات نقل الإشارة. لتوضيح أدوار pilG في الحركة ارتعاش اكس. وقد وضعت fastidiosa، وpilG -deficient متحولة XF ΔpilG وسلالة مكملة لها XfΔpilG- C التي تحتوي على pilG مواطن. واستخدمت غرف ميكروفلويديك متكاملة مع نظام تسجيل صورة مرور الزمن لمراقبة الوخز الحركة في XfΔpILG، XfΔpilG- C ونوع السلالة في البرية. باستخدام هذا النظام تسجيل، فإنه يسمح الملاحظات على المدى الطويل المكانية والزمانية لتجميع والهجرة من الخلايا الفردية والسكان من البكتيريا عبر حركية الوخز. اكس. أظهر fastidiosa النوع البري ومكملة XfΔpilG- C سلالة خصائص الوخز حركية نموذجية الملاحظة المباشرة في غرف تدفق الموائع الدقيقة، في حين عرضت متحولة XfΔpliG النمط الظاهري نقص الوخز. وتوضح هذه الدراسة أن pilG يساهم في الحركة ارتعاش اكس. fastidiosa. ويستخدم غرفة تدفق الموائع الدقيقة كوسيلة لمراقبة الوخز حركية.

وجود هامش مستعمرة الطرفية يدل على النوع الرابع بوساطة شعرة الوخز حركية، لوحظ في مستعمرات اكس. النوع البري fastidiosa ومكملة سلالة XF ΔpliG -C (الشكل 1). متحولة XfΔpliG، ومع ذلك، لم تظهر هامشية حول المحيط الخارجي للمستعمرات (?...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa at JoVE.com

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

في هذه الدراسة، كان يعمل في غرفة تدفق نانو ميكروفلويديك لتصور وظيفيا تميز الحركة ارتعاش Xylella fastidiosa، وهي البكتيريا التي تسبب مرض بيرس في الكرمة.

التصور من الوخز على الحركة وتوصيف دور<em&gt; PilG</em&gt; في<em&gt; Xylella fastidiosa</em

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility ...

visualization-twitching-motility-characterization-role-pilg-xylella

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

10.7K Views.  University of California, Davis.  في هذه الدراسة، كان يعمل في غرفة تدفق نانو ميكروفلويديك لتصور وظيفيا تميز الحركة ارتعاش Xylella fastidiosa، وهي البكتيريا التي تسبب مرض بيرس في الكرمة. 

Video: Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Fluorescence live-cell imaging of bacterial cells is a key method in the analysis of the spatial and temporal dynamics of proteins and chromosomes underlying central cell cycle events. However, imaging of these molecules in slow-growing bacteria represents a challenge due to photobleaching of fluorophores and phototoxicity during image acquisition. Here, we describe a simple protocol to circumvent these limitations in the case of Myxococcus xanthus (which has a generation time of 4 - 6 h). To this end, M. xanthus cells are grown on a thick nutrient-containing agar pad in a temperature-controlled humid environment. Under these conditions, we determine the doubling time of individual cells by following the growth of single cells. Moreover, key cellular processes such as chromosome segregation and cell division can be imaged by fluorescence live-cell imaging of cells containing relevant fluorescently labeled marker proteins such as ParB-YFP, FtsZ-GFP, and mCherry-PomX over multiple cell cycles. Subsequently, the acquired images are processed to generate montages and/or movies.

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Bacterial cells are spatially highly organized. To follow this organization over time in slow growing Myxococcus xanthus cells, a set-up for fluorescence live-cell imaging with high spatiotemporal resolution over several generations was developed. Using this method, spatiotemporal dynamics of important proteins for chromosome segregation and cell division could be determined.

الأسفار خلايا حية تصوير "دورة الخلية الخضري كاملة" من "بكتيريا الاجتماعية" بطيئة النمو إكسانثوس ميكسوكوككوس

Fluorescence live-cell imaging of bacterial cells is a key method in the analysis of the spatial and temporal dynamics of proteins and chromosomes ...

Biochemistry

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding and invasion. Current animal models for the study of T. cruzi allow limited observation of parasites in vivo, representing a challenge for understanding parasite behavior during the initial stages of infection in humans. This protozoan has a flagellar stage in both vector and mammalian hosts, but there are no studies describing its motility in vivo.The objective of this project was to establish a live vertebrate zebrafish model to evaluate T. cruzi motility in the vascular system. Transparent zebrafish larvae were injected with fluorescently labeled trypomastigotes and observed using light sheet fluorescence microscopy (LSFM), a noninvasive method to visualize live organisms with high optical resolution. The parasites could be visualized for extended periods of time due to this technique&#39;s relatively low risk of photodamage compared to confocal or epifluorescence microscopy. T. cruzi parasites were observed traveling in the circulatory system of live zebrafish in different-sized blood vessels and the yolk. They could also be seen attached to the yolk sac wall and to the atrioventricular valve despite the strong forces associated with heart contractions. LSFM of T. cruzi-inoculated zebrafish larvae is a valuable method that can be used to visualize circulating parasites and evaluate their tropism, migration patterns, and motility in the dynamic environment of the cardiovascular system of a live animal.

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

In this protocol, fluorescently labeled T. cruzi&#160;were injected into transparent zebrafish larvae, and parasite motility was observed in vivo using light sheet fluorescence microscopy.

إنشاء الزرد اليرقات "نموذج الحيوان" للتحقيق مثقبيه الكروزية حركية في فيفو

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Developmental Biology

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

جيل ومتعدد المظهري فحص عالية المحتوى من<em&gt; الكوكسيلا البورنيتية</em&gt; المسوخ ينقول

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Recording Multicellular Behavior in Myxococcus xanthus Biofilms using Time-lapse Microcinematography

A swarm of the &delta;-proteobacterium Myxococcus xanthus contains millions of cells that act as a collective, coordinating movement through a series of signals to create complex, dynamic patterns as a response to environmental cues. These patterns are self-organizing and emergent; they cannot be predicted by observing the behavior of the individual cells. Using a time-lapse microcinematography tracking assay, we identified a distinct emergent pattern in M. xanthus called chemotaxis, defined as the directed movement of a swarm up a nutrient gradient toward its source 1.
In order to efficiently characterize chemotaxis via time-lapse microcinematography, we developed a highly modifiable plate complex (Figure 1) and constructed a cluster of 8 microscopes (Figure 2), each capable of capturing time-lapse videos. The assay is rigorous enough to allow consistent replication of quantifiable data, and the resulting videos allow us to observe and track subtle changes in swarm behavior. Once captured, the videos are transferred to an analysis/storage computer with enough memory to process and store thousands of videos. The flexibility of this setup has proven useful to several members of the M. xanthus community.

Recording Multicellular Behavior in Myxococcus xanthus Biofilms using Time-lapse Microcinematography

To study Myxococcus xanthus swarm behavior, we have designed a time-lapse microcinematography protocol that can be modified for different assays. It employs standard growth conditions adapted for microscopy, and yields reproducible results by the use of inexpensive, reusable silicone gaskets. We have used this method to quantify multicellular chemotaxis.

تسجيل متعددة الخلايا في السلوك Myxococcus زانثس الأغشية الحيوية باستخدام الزمن الفاصل بين Microcinematography

A swarm of the &delta;-proteobacterium Myxococcus xanthus contains millions of cells that act as a collective, coordinating movement through a series of ...

Biology

A Semi-quantitative Approach to Assess Biofilm Formation Using Wrinkled Colony Development

Biofilms, or surface-attached communities of cells encapsulated in an extracellular matrix, represent a common lifestyle for many bacteria. Within a biofilm, bacterial cells often exhibit altered physiology, including enhanced resistance to antibiotics and other environmental stresses 1. Additionally, biofilms can play important roles in host-microbe interactions. Biofilms develop when bacteria transition from individual, planktonic cells to form complex, multi-cellular communities 2. In the laboratory, biofilms are studied by assessing the development of specific biofilm phenotypes. A common biofilm phenotype involves the formation of wrinkled or rugose bacterial colonies on solid agar media 3. Wrinkled colony formation provides a particularly simple and useful means to identify and characterize bacterial strains exhibiting altered biofilm phenotypes, and to investigate environmental conditions that impact biofilm formation. Wrinkled colony formation serves as an indicator of biofilm formation in a variety of bacteria, including both Gram-positive bacteria, such as Bacillus subtilis 4, and Gram-negative bacteria, such as Vibrio cholerae 5, Vibrio parahaemolyticus 6, Pseudomonas aeruginosa 7, and Vibrio fischeri 8.
The marine bacterium V. fischeri has become a model for biofilm formation due to the critical role of biofilms during host colonization: biofilms produced by V. fischeri promote its colonization of the Hawaiian bobtail squid Euprymna scolopes 8-10. Importantly, biofilm phenotypes observed in vitro correlate with the ability of V. fischeri cells to effectively colonize host animals: strains impaired for biofilm formation in vitro possess a colonization defect 9,11, while strains exhibiting increased biofilm phenotypes are enhanced for colonization 8,12. V. fischeri therefore provides a simple model system to assess the mechanisms by which bacteria regulate biofilm formation and how biofilms impact host colonization.
In this report, we describe a semi-quantitative method to assess biofilm formation using V. fischeri as a model system. This method involves the careful spotting of bacterial cultures at defined concentrations and volumes onto solid agar media; a spotted culture is synonymous to a single bacterial colony. This 'spotted culture' technique can be utilized to compare gross biofilm phenotypes at single, specified time-points (end-point assays), or to identify and characterize subtle biofilm phenotypes through time-course assays of biofilm development and measurements of the colony diameter, which is influenced by biofilm formation. Thus, this technique provides a semi-quantitative analysis of biofilm formation, permitting evaluation of the timing and patterning of wrinkled colony development and the relative size of the developing structure, characteristics that extend beyond the simple overall morphology.

We provide a simple, semi-quantitative method to investigate biofilm formation in vitro. This method takes advantage of the Zeiss stemi 2000-C Dissecting Microscope (with camera attachment) to monitor both the timing and pattern of biofilm formation, as assessed by the development of wrinkled colonies.

مقاربة شبه كمي لتقدير تشكيل بيوفيلم طريق تجعد التنمية مستعمرة

Biofilms, or surface-attached communities of cells encapsulated in an extracellular matrix, represent a common lifestyle for many bacteria. Within a ...

Kinetic Visualization of Single-Cell Interspecies Bacterial Interactions

Polymicrobial communities are ubiquitous in nature, yet studying their interactions at the single-cell level is difficult. Thus, a microscopy-based method has been developed for observing interspecies interactions between two bacterial pathogens. The use of this method to interrogate interactions between a motile Gram-negative pathogen, Pseudomonas aeruginosa and a non-motile Gram-positive pathogen, Staphylococcus aureus is demonstrated here. This protocol consists of co-inoculating each species between a coverslip and an agarose pad, which maintains the cells in a single plane and allows for visualization of bacterial behaviors in both space and time.
Furthermore, the time-lapse microscopy demonstrated here is ideal for visualizing the early interactions that take place between two or more bacterial species, including changes in bacterial species motility in monoculture and in coculture with other species. Due to the nature of the limited sample space in the microscopy setup, this protocol is less applicable for studying later interactions between bacterial species once cell populations are too high. However, there are several different applications of the protocol which include the use of staining for imaging live and dead bacterial cells, quantification of gene or protein expression through fluorescent reporters, and tracking bacterial cell movement in both single species and multispecies experiments.

This live-bacterial cell imaging protocol allows for visualization of interactions between multiple bacterial species at the single-cell level over time. Time-lapse imaging allows for observation of each bacterial species in monoculture or coculture to interrogate interspecies interactions in multispecies bacterial communities, including individual cell motility and viability.

التصور الحركي لتفاعلات البكتيريا بين الخلايا المفردة

Polymicrobial communities are ubiquitous in nature, yet studying their interactions at the single-cell level is difficult. Thus, a microscopy-based method ...

Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility

The study of glycosylation in prokaryotes is a rapidly growing area. Bacteria harbor different glycosylated structures on their surface whose glycans constitute a strain-specific barcode. The associated glycans show higher diversity in sugar composition and structure than those of eukaryotes and are important in bacterial-host recognition processes and interaction with the environment. In pathogenic bacteria, glycoproteins have been involved in different stages of the infectious process, and glycan modifications can interfere with specific functions of glycoproteins. However, despite the advances made in the understanding of glycan composition, structure, and biosynthesis pathways, understanding of the role of glycoproteins in pathogenicity or interaction with the environment remains very limited. Furthermore, in some bacteria, the enzymes required for protein glycosylation are shared with other polysaccharide biosynthetic pathways, such as lipopolysaccharide and capsule biosynthetic pathways. The functional importance of glycosylation has been elucidated in several bacteria through mutation of specific genes thought to be involved in the glycosylation process and the study of its impact on the expression of the target glycoprotein and the modifying glycan. Mesophilic Aeromonas have a single and O-glycosylated polar flagellum. Flagellar glycans show diversity in carbohydrate composition and chain length between Aeromonas strains. However, all strains analyzed to date show a pseudaminic acid derivative as the linking sugar that modifies serine or threonine residues. The pseudaminic acid derivative is required for polar flagella assembly, and its loss has an impact on adhesion, biofilm formation, and colonization. The protocol detailed in this article describes how the construction of null mutants can be used to understand the involvement of genes or genome regions containing putative glycosyltransferases in the biosynthesis of a flagellar glycan. This includes the potential to understand the function of the glycosyltransferases involved and the role of the glycan. This will be achieved by comparing the glycan deficient mutant to the wild-type strain.

Here, we describe the construction of null mutants of Aeromonas in specific glycosyltransferases or regions containing glycosyltransferases, the motility assays, and flagella purification performed to establish the involvement and function of their encoded enzymes in the biosynthesis of a glycan, as well as the role of this glycan in bacterial pathogenesis.

توليد الطفرات الخالية لتوضيح دور الجليكوسيل ترانسفيراز البكتيري في الحركة البكتيرية

The study of glycosylation in prokaryotes is a rapidly growing area. Bacteria harbor different glycosylated structures on their surface whose glycans ...

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar and sometimes inclusion of specific nutrients in the growth medium. The preparation of such explicit media and surface growth conditions serves to provide the favorable conditions that allow not just bacterial growth but coordinated motility of bacteria over these surfaces within thin liquid films. Reproducibility of swarm plate and other surface motility plate assays can be a major challenge. Especially for more &#8220;temperate swarmers&#8221; that exhibit motility only within agar ranges of 0.4%-0.8% (wt/vol), minor changes in protocol or laboratory environment can greatly influence swarm assay results. &#8220;Wettability&#8221;, or water content at the liquid-solid-air interface of these plate assays, is often a key variable to be controlled. An additional challenge in assessing swarming is how to quantify observed differences between any two (or more) experiments. Here we detail a versatile two-phase protocol to prepare and image swarm assays. We include guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay media preparation and quantification of data from these assays. We specifically demonstrate our method using bacteria that express fluorescent or bioluminescent genetic reporters like green fluorescent protein (GFP), luciferase (lux operon), or cellular stains to enable time-lapse optical imaging. We further demonstrate the ability of our method to track competing swarming species in the same experiment.

Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.

التحضير والتصوير، والكمي لالسطحية الجرثومي على الحركة فحوصات

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

Biophysical Characterization of Flagellar Motor Functions

The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel in response to a variety of environmental stimuli and are among the triggers for surface colonization and infections. The precise mechanisms by which motors remodel and promote cellular adaptation likely depend on key motor attributes. The photomultiplier-based bead-tracking technique presented here enables accurate biophysical characterization of motor functions, including adaptations in motor speeds and switch-dynamics. This approach offers the advantage of real-time tracking and the ability to probe motor behavior over extended durations. The protocols discussed can be readily extended to study flagellar motors in a variety of bacterial species.

Recent findings suggest that bacterial flagellar motors sense a variety of environmental signals and remodel in response. The bead-assays discussed here are expected to help explain the role of remodeling in cellular adaptation to environmental stressors.

توصيف الفيزيائية الحيوية من وظائف سوطي للسيارات

The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel ...

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, to elucidate the function and assembly of flagellar parts, and to examine and understand patterns of movement. Here we demonstrate a combination of three of these methodologies. Motility in soft agar is the oldest, offering a strong selection for isolating gain-of-function suppressor mutations in motility-impaired strains, where motility is restored through a second mutation. The cell-tethering technique, first employed to demonstrate the rotary nature of the flagellar motor, can be used to assess the impact of signaling effectors on the motor speed and its ability to switch rotational direction. The &#8220;border-crossing&#8221; assay is more recent, where swimming bacteria can be primed to transition into moving collectively as a swarm. In combination, these protocols represent a systematic and powerful approach to identifying components of the motility machinery, and to characterizing their role in different facets of swimming and swarming. They can be easily adapted to study motility in other bacterial species.

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Many bacteria use flagella-driven motility to navigate their environment and colonize favorable surroundings both individually and as a collective. Demonstrated here is the use of three established methods that exploit motility as a selection tool to identify components/pathways contributing to swimming and swarming motility.

التحقيق في حركية Flagella يحركها في الإشريكية القولونية من خلال تطبيق ثلاث تقنيات راسخة في سلسلة

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, ...

التصور من الوخز على الحركة وتوصيف دور

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video