تم توفير التمويل من قبل وزارة الزراعة الأميركية كريس 5347-22620-021-00D و، في جزء منه، من قبل الزراعة والأغذية بحوث مبادرة التنافسية منحة لا. 2011-67009-30141 من المعهد الوطني USDA الأغذية والزراعة. ونحن ممتنون للدعم الفني للجوانا ناصيف. كما نشكر بول بيكر، ديفيد هورتون، دييغو نييتو، وفرانسيس Sivakoff لتوفير بعض الصور المستخدمة في الشكل (3).

1. الأقسام الداخلية، الاحتفاظ، والكشف الداخلي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإجراء بمناسبة الداخلي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الحشرات من الفائدة (ن ≈ 100 فرد) من مستعمرة المختبر تربى على النظام الغذائي الاصطناعي أو من الميدان وتقسم إلى حاويتين تربية نظيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع حزمة العادية 20 مل نظام غذائي (لا تحمل علامات علاج المراقبة السلبية) في واحدة من الحاويات. تكملة 20 مل علبة النظام الغذائي الاصطناعي الثانية مع 1.0 مل من 1.0 ملغ / مل الدجاج مفتش / IGY الحل، تخلط جيدا، ووضعه في حاوية أخرى. ملاحظة: إذا لم يكن لدى الحشرة من مصلحة نظام غذائي الاصطناعي، يمكن وضع علامة على أو في أي نظام غذائي مستدام وعادة ما على (على سبيل المثال، والفاصوليا الخضراء والبيض العث والماء والسكر والعسل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للحشرات لاستئناف نشاط التغذية لمدة 24 ساعة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علامة الداخلية إجراء الاحتفاظ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الحزم النظام الغذائي من كل حاوية وتوريد الحشرات ثإيث مصدر الغذاء أخرى للحفاظ عليها خلال مدة التجربة (على سبيل المثال، والفاصوليا الخضراء). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع لفيف (ن = 20) من الحشرات يوميا (أو في أي الفاصل الزمني المطلوب) من كل معاملة وتجمد على الفور في -20 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطيرة إجراء ELISA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكرولتر من أرنب مكافحة الدجاج IGY الأجسام المضادة الأولية المخفف 1: 500 في تريس مخزنة المالحة (TBS) إلى كل بئر من ELISA صفيحة ميكروسكوبية نظيفة واحتضان مدة لا تقل عن 1 ساعة على RT (ملاحظة: microplates يمكن أيضا أن تكون المحتضنة O / N عند 4 درجات مئوية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل الضد من لوحة ومنع كل بئر مع 300 ميكرولتر من 1.0٪ الخالي من الدسم حل الحليب الجاف لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في انتظار الخطوات الحضانة السابقة، ضع الحشرات المجمدة بشكل فردي في 1.6 مل أنابيب microcentrifuge مع 1.0 مل من TBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطحن كل الحشرات مع مدقة نظيفة حتى المتجانس تماما وإضافة 100 ميكرولتر من كل عينة لبئر الفردي للELISAطبق. السماح للعينات لاحتضان في RT لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من سلبية (TBS فقط) وإيجابية (بياض البيض في TBS) ضوابط لالآبار في العمود الأول من كل لوحة ELISA. أيضا، إضافة 100 ميكرولتر من الضوابط الحشرات السلبية (الحشرات لا تحمل علامات) إلى 8 آبار في العمود الأخير من كل لوحة (الشكل 1). السماح للعينات التحكم لاحتضان في RT لمدة 1 ساعة. لاحظ أن النموذج المقدم في الشكل رقم 1 هو القالب نستخدمها لفحوصات موحدة لدينا. وضع العينات في الآبار متروك للسلطة التقديرية للباحث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل كل بئر ثلاث مرات مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) -tween ثم إضافة 50 ميكرولتر من أرنب مكافحة الدجاج مفتش / IGY مترافق مع الفجل البيروكسيديز المخفف 1: 10000 في 1٪ محلول الحليب واحتضان لمدة 1 ساعة على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل كل بئر ثلاث مرات مع PBS-توين وإضافة 50 ميكرولتر من tetramethylbenzidine (TMB) الركيزة إلى كل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 10 دقيقة، وقراءة الآبارمع معمل صفيحة ميكروسكوبية وضعت في طول موجي 650 نانومتر. </li></ol></li></ol><img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53693/53693fig1.jpg" /> الشكل 1. رسم تخطيطي يظهر التسميات جيدا موحدة تستخدم لنموذجي 96 جيدا ELISA صفيحة ميكروسكوبية. كل لوحة تحتوي على 7 آبار مخصصة لضوابط السلبية المالحة تريس مخزنة (TBS)، وهي مخصصة بشكل جيد لعنصر تحكم البروتين الإيجابية (نقاط البيع على Ctrl)، 80 الآبار الفردية المخصصة للحشرات استعادت (نموذج 1 ... 80)، و 8 آبار مخصصة لتحمل أية علامات (السلبية) الضوابط الحشرات (NEG السيطرة 1 ... 8). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53693/53693fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> 2. الخارجية مارك، الاحتفاظ، والكشف الداخلي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإجراء بمناسبة الخارجي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الحشرات من الفائدة (ن ≈ 100الأفراد) من مستعمرة المختبر أو من مجال ومكان إلى قسمين 1.0 L حاويات من البلاستيك مع وجود ثقب قطره 2.5 سم لكمات من جانب كل حاوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رش الحشرات في الحاوية الأولى مع 1.0 مل من درهم 2 O (العلاج السيطرة السلبية) باستخدام البخاخات الطبية. رش الحشرات في الحاويات الثانية مع 1.0 مل من محلول 5.0٪ من بياض البيض والدجاج باستخدام البخاخات الطبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نعلق خرطوم من البخاخات لمنفذ الهواء المختبرات القياسية ثم قم بإدراج الفم من البخاخات إلى 2.5 سم حفرة من الحاوية. ثم، بدوره على منفذ الهواء تدريجيا حتى تنتج البخاخات بخار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مواصلة رش (وسم) حتى تم الاستغناء عن حل بياض البيض (حوالي 2-5 دقائق). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة البخاخات ووضع الفلين في حفرة من الحاويات البلاستيكية. السماح للحشرات على الوقوف في RT حتى جفت الحل تماما. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علامة الخارجية إجراء الاحتفاظ<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع كل معاملة الحشرات الجافة في وعاء منفصل تربية نظيفة لتجنب التعرض لمزيد من العلامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الغذاء والماء إلى حاويات نظيفة للحفاظ على الحشرات خلال مدة الدراسة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع لفيف (ن = 20) من الحشرات من كل معاملة يوميا وتجمد على الفور في -20 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإجراء ELISA غير المباشرة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الحشرات المجمدة بشكل فردي إلى 1.6 مل أنابيب microcentrifuge وإضافة 1.0 مل من TBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقع العينات لمدة 1 ساعة على مجموعة شاكر المداري في 120 دورة في الدقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة عناصر تحكم السلبية والإيجابية كما هو موضح في الخطوة 1.3.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد النقع، ماصة قسامة 100 ميكرولتر من كل عينة في واحدة من 80 بئرا عينة المعينة على 96 الجديدة جيدا لوحة ELISA كما هو مبين في الشكل 1 السماح للعينات لاحتضان لمدة 1 ساعة على RT (ملاحظة: في microplates يمكن أيضا أن تكون O المحتضنة / N عند 4 درجات مئوية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الآبار ثلاث مرات معPBS-توين ثم قم بإضافة 300 ميكرولتر من الفوسفات مخزنة المالحة التي تحتوي على 1٪ ألبومين المصل البقري (PBS-BSA) إلى كل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 30 دقيقة في RT يغسل مرتين مع PBS-توين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكرولتر من أرنب مكافحة البيض الأجسام المضادة الأولية الألبومين المخفف 1: 8000 في برنامج تلفزيوني BSA-Silwet (0.05٪) إلى كل بئر واحتضان لمدة 1 ساعة على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل كل بئر ثلاث مرات مع PBS-توين ثم إضافة 50 ميكرولتر من الماعز المضادة للأرنب مفتش مترافق مع الفجل البيروكسيديز المخفف 1: 2000 في برنامج تلفزيوني BSA-Silwet (0.05٪) لمدة 1 ساعة على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل كل بئر ثلاث مرات مع PBS-توين وإضافة 50 ميكرولتر من TMB الركيزة إلى كل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 10 دقيقة، وقراءة الآبار مع معمل صفيحة ميكروسكوبية وضعت في طول موجي 650 نانومتر. </li></ol></li></ol> تحليل 3. البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب قيمة الامتصاصية متوسط ​​من 8 الحشرات سيطرة سلبية على كل لوحة ELISA ثم حساب الانحراف المعياري استنادا إلى ضوابط السلبية المجمعة جيئة وذهابام كل من لوحات ELISA لدراسة معينة 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ست مرات الانحراف المعياري المجمعة إلى الوسط التي تم الحصول عليها عن كل لوحة ELISA للحصول على قيمة العتبة إيجابية ELISA. يعتبر أي عينة الحشرات ذات العوائد قيمة الامتصاصية مساوية أو أكبر من هذه القيمة أن تكون إيجابية لوجود علامة البروتين. </li></ol>

ذكر الأسماء التجارية أو المنتجات التجارية في هذا المنشور هو فقط لغرض توفير معلومات محددة، ولا يعني توصية أو تأييد من قبل وزارة الزراعة الأمريكية. USDA هو مزود تكافؤ الفرص والعمل.

وقد وصفت الإجراء immunomarking البروتين المفصلية أول ما يقرب من ربع قرن منذ 9. منذ ذلك الحين، تم تكييفها الإجراء لدراسة أنماط تشتت تشكيلة واسعة من المفصليات باستخدام تدار داخليا وخارجيا مفتش / IgYs. وقد أثبتت هذه البروتينات علامات ثابتة لمجموعة واسعة من أنواع الحشرات اخ...

تتبع حركة الآفات المفصلية، وأعداء الطبيعية (الطفيليات والمفترسات)، والملقحات في الطبيعة أمر ضروري لفهم أفضل لكيفية تحسين خدمات النظام الإيكولوجي. المكون الرئيسي لمعظم أنواع البحوث تشتت هو وجود طريقة يمكن الاعتماد عليها لوضع علامة على المفصلية (ق) من الفائدة. مجموعة متنوعة من المواد (على سبيل المثال، والدهانات والأصباغ والأتربة الملونة، والعلامات، والعناصر النادرة، البروتينات) وقد استخدمت للاحتفال المفصليات لتقييم ديناميات السكان، وتشتيت قدراته، والتغذية والسلوكيات، والتفاعلات البيئية الأخرى 1،2. ومدى ملاءمة علامة تستخدم لتفريق أي بحث معين يتوقف على نوع الدراسة التي تجري. هناك ثلاثة تصنيفات واسعة لوضع علامات المفصليات: (1) علامة الإفراج الاستيلاء (MRR)، (2) علامة التقاط، و (3) علامة التقاط النفس. للبحث علامة الافراج عن الاستيلاء، المحقق عادة يصادف المفصليات جماعي في laboratoراي والنشرات لهم في نقطة مركزية في هذا المجال. ثم استعادت المفصليات في مختلف فترات الزمنية والمكانية باستخدام أجهزة جمع مختلفة (على سبيل المثال، شبكة الاجتياح، فراغ، فخ لزجة) 3،4،5. ثم يتم فحص العينات استعاد لعلامة محددة للتمييز الإفراج عن أفراد الأصلي. للبحث علامة التقاط، المحقق عادة تنطبق علامة مباشرة في مجال استخدام معدات الرش (على سبيل المثال، بخاخ على ظهره، والازدهار وبخاخ فوهة). أفضل علامات للبحوث علامة التقاط غير مكلفة وتطبيقها بسهولة على الموائل والمفصلية ل. للبحث علامة التقاط النفس، المحقق عادة تنطبق علامات إلى الطعم المفصلية 6،7 أو عش مدخل 8. في المقابل، فإن المفصلية يمثل نفسه داخليا من قبل التهام الطعم ملحوظ أو خارجيا من قبل &quot;تنظيف&quot; حتى مقابل المارك فور خروجها من العش. كما ذكر أعلاه، فقد كان لنا العديد من أنواع علاماتإد وضع علامة مجموعة متنوعة من الأنواع المفصلية. ومع ذلك، عدد قليل جدا مفيدة للجميع ثلاثة من هذه الفئات البحوث النثر. وكان التطور الإجراء البروتين immunomarking انجازا كبيرا لوسم الحشرات. Immunomarking يضع تسمية البروتين على المفصليات سواء داخليا أو خارجيا والتي، بدورها، تم الكشف من قبل انزيم مرتبط المناعي فحص محدد لمكافحة البروتين (ELISA). وكانت أول علامات هذا البروتين المناعي تستخدم الأرانب (مفتش) والدجاج مفتش / IGY 9،10. فإنها تبين أن علامات فعالة جدا لMRR والبحوث علامة التقاط النفس (انظر المناقشة). للأسف، والبروتينات مفتش / IGY مكلفة وبالتالي فهي ليست عملية للبحث علامة التقاط ومعظم أنواع البحوث علامة التقاط النفس. وفي وقت لاحق، تم تطوير الجيل الثاني من ELISAs كشف عن البروتين للبروتينات الموجودة في بياض البيض الدجاج (الزلال)، حليب البقر (الكازين) وحليب الصويا (التربسين البروتين المانع). كل فحص حساس جدا ومحددة، وأكثرالأهم من ذلك، يستخدم البروتينات التي هي أقل تكلفة بكثير من البروتينات مفتش / IGY 11. وقد أثبتت هذه البروتينات الفعال لMRR، علامة التقاط، والبحوث علامة التقاط النفس (انظر المناقشة). في هذه المقالة، وصفنا وشرح كيفية إجراء علامة البروتين الدراسات الاحتفاظ المختبر. مثل هذه الدراسات هي المرحلة الأولى من الأبحاث اللازمة لأي نوع من الدراسة تشتت المجال. على وجه التحديد، فمن الأهمية بمكان أن المحققين أعرف كم من الوقت سيتم الاحتفاظ علامة على الأنواع المفصلية المستهدفة قبل الشروع في دراسات تشتت المجال. هنا، وصفنا وشرح كيفية داخليا وخارجيا بمناسبة الحشرات لMRR، علامة التقاط، وعلامة التقاط النفس دراسات نوع الحقل. نحن بعد ذلك شرح كيفية الكشف عن وجود علامات مع ELISAs غير المباشرة وشطيرة.

<table><tbody><tr><td>Food storage container (for insect rearing)</td><td>Rubbermaid/Tupperware</td><td>Various sizes</td><td>Various manufacturers &amp;amp; vendors. Mesh fabric is glued in a window</td></tr><tr><td>Small volume nebulizer (Micro Mist)</td><td>Teleflex-Hudson RCI</td><td>1881</td><td>Available online and in medical supply shops. Other brands will work as well.</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes, 1.6 ml w/cap</td><td>Continental Lab Products</td><td>4445.X</td><td>Any similar type will work. We prefer brands that have easy to open lids.</td></tr><tr><td>Styrofoam storage box for microcentrifuge tubes (5x20 grid)</td><td>RPI Corp.</td><td>145746</td><td>This design is nice because it doesn&#039;t crowd the tubes.</td></tr><tr><td>Dispenser, repeater</td><td>Eppendorf</td><td>4982000322</td><td>Anything similar will help speed up the dispensing.</td></tr><tr><td>Pestles, plastic disposable tissue grinders, 1.5 ml</td><td>Kimble Chase</td><td>749521-1500</td><td>Available with various vendors. Pestles can be cleaned and autoclaved for reuse.</td></tr><tr><td>BD Falcon ELISA plates, 96-well (flat bottom)</td><td>BD</td><td>351172</td><td></td></tr><tr><td>Ovation pipette, manual (20-200 &amp;micro;l)</td><td>VistaLab</td><td>1057-0200 or 1070-0200</td><td>Any similar type will work. This model is ergonomic.</td></tr><tr><td>Reservoirs, sterile reagent</td><td>VistaLab</td><td>4054-1000</td><td>Anything similar will work.</td></tr><tr><td>Electronic pipette, 8-channel (50-1,200 &amp;micro;l) (Biohit eLine)</td><td>Sartorius</td><td>730391</td><td>If you had to pick one electronic model, this size is most useful.</td></tr><tr><td>Electronic pipette, 8-channel (10-300 &amp;micro;l) (Biohit eLine)</td><td>Sartorius</td><td>730361</td><td>Anything similar will work.</td></tr><tr><td>Manifold, multiwell plate washer (8-position, straight)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z369802&amp;nbsp;</td><td>Anything similar will work for manual plate washing.</td></tr><tr><td>Microplate reader with absorbance detection</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax 250</td><td>Anything similar will work.</td></tr><tr><td>Chicken IgG/IgY</td><td>United States Biological</td><td>I1903-15R</td><td>Also available from other sources</td></tr><tr><td>Egg whites</td><td>Grocery store</td><td>&amp;ldquo;All Whites&amp;rdquo;, &amp;ldquo;Egg Beaters&amp;rdquo;, &lt;em&gt;etc.&lt;/em&gt;</td><td>Mix 5 ml with 95 ml dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O for 5% solution</td></tr><tr><td>Tris (Trizma Base)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>2.42 g/L to make TBS</td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>29.22 g/L to make TBS and 8.0&amp;nbsp;g&amp;#8288;/&amp;#8288;L for PBS</td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876</td><td>1.14 g/L for PBS</td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>0.2 g/L for PBS</td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>0.2 g/L for PBS</td></tr><tr><td>Tween 20, EIA grade</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>Add 0.5 ml per L to PBS after salts are dissolved.</td></tr><tr><td>PBS with 1% BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3688</td><td>Mix 1 packet in 1 L dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule) antibody produced in rabbit (1:500)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6409</td><td>Mix 100 &amp;micro;l in 50 ml TBS</td></tr><tr><td>Dry Milk, Powdered or Fresh Milk (1%)</td><td>Grocery store</td><td></td><td>Mix 10 g with 1 L dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O for 1% solution</td></tr><tr><td>Anti-Chicken IgY (IgG) (whole molecule)-Peroxidase antibody produced in rabbit (1:10,000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9046</td><td>Mix 100 &amp;micro;l in 1 L of 1% milk</td></tr><tr><td>Anti-Chicken Egg Albumin antibody produced in rabbit (1:8,000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6534</td><td>Dilute 125 &amp;micro;l in 1 L PBS-BSA</td></tr><tr><td>Goat Anti-Rabbit IgG Peroxidase Conjugate (1:2,000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6154</td><td>Dilute 0.5 ml in 1 L PBS-BSA, then add 1.3&amp;nbsp;ml Silwet</td></tr><tr><td>Vac-In-Stuff (Silwet L-77) silicon-polyether copolymer</td><td>Lehle Seeds</td><td>VIS-01</td><td>Add as last ingredient</td></tr><tr><td>TMB Microwell One Component Peroxidase Substrate</td><td>SurModics</td><td>TMBW-1000-01</td><td></td></tr></tbody></table>

administering and detecting protein marks on arthropods for dispersal research

وغالبا ما يتطلب مراقبة الحركة المفصلية إلى فهم أفضل لديناميات المرتبطة السكاني وأنماط النثر، وتفضيلات النبات المضيف، والتفاعلات البيئية الأخرى. وعادة ما تعقب المفصليات في الطبيعة عن طريق وضع علامات عليها مع علامة فريدة من نوعها ومن ثم إعادة جمعها عبر الزمان والمكان لتحديد قدرات تشتتهم. بالإضافة إلى علامات المادية الفعلية، مثل الغبار الملون أو الطلاء، وأثبتت أنواع مختلفة من البروتينات فعالة جدا لوسم المفصليات للبحث البيئي. البروتينات يمكن أن تدار داخليا و / أو خارجيا. ويمكن بعد ذلك يتم الكشف عن البروتينات على المفصليات استعادت مع انزيم مرتبط المناعي فحص بروتين معين (ELISA). نحن هنا وصف بروتوكولات للخارجيا وداخليا علامات المفصليات مع البروتين. وأظهرت مثالين تجريبية بسيطة: (1) علامة البروتين الداخلية التي أدخلت على حشرة من خلال توفير نظام غذائي التخصيب من البروتين و (2) علامة البروتين الخارجية موضعيا لpplied لحشرة باستخدام البخاخات الطبية. نحن ثم تتصل دليل خطوة بخطوة من الساندويتش وطرق ELISA غير المباشرة المستخدمة للكشف عن علامات البروتين على الحشرات. في هذه المظاهرة، وتناقش مختلف جوانب اقتناء وكشف عن علامات البروتين على المفصليات للعلامة الافراج عن الاستيلاء، علامة التقاط، وأنواع علامة التقاط النفس من البحوث، جنبا إلى جنب مع مختلف الطرق التي كان الإجراء immunomarking تكييفها لتلائم مجموعة واسعة من أهداف البحث.

الداخلية بمناسبة: وأظهرت نتائج الاختبار الداخلي الاحتفاظ علامة في الشكل 2A. كانت محسوبة ELISA قيمة العتبة الحرجة 0.054. عموما (جميع التواريخ عينة أربعة مجتمعة)، والحشرات علاجها بد?...

Watch this Scientific Journal Video about Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research at JoVE.com

Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research

Proteins are often used to mark arthropods for dispersal research. Methods for administering internal and external protein marks on arthropods are demonstrated. Protein mark detection techniques, either through indirect or sandwich enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), are also illustrated.

إدارة والكشف عن علامات البروتين على المفصليات للبحوث تشتت

Monitoring arthropod movement is often required to better understand associated population dynamics, dispersal patterns, host plant preferences, and other ...

administering-detecting-protein-marks-on-arthropods-for-dispersal

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Environment

7.3K Views.  Arid-Land Agricultural Research Center. Proteins are often used to mark arthropods for dispersal research. Methods for administering internal and external protein marks on arthropods are demonstrated. Protein mark detection techniques, either through indirect or sandwich enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), are also illustrated. 

Video: Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes. The majority of them belong to the superfamily of G protein-coupled receptors (GPCRs). We have focused on characterizing arthropod kinin receptors from the tick and mosquito. Arthropod kinins are multifunctional neuropeptides with myotropic, diuretic, and neurotransmitter function. Here, a method for systematic analyses of structure-activity relationships of insect kinins on two heterologous kinin receptor-expressing systems is described. We provide important information relevant to the development of biostable kinin analogs with the potential to disrupt the diuretic, myotropic, and/or digestive processes in ticks and mosquitoes.
The kinin receptors from the southern cattle tick, Boophilus microplus (Canestrini), and the mosquito Aedes aegypti (Linnaeus), were stably expressed in the mammalian cell line CHO-K1. Functional analyses of these receptors were completed using a calcium bioluminescence plate assay that measures intracellular bioluminescence to determine cytoplasmic calcium levels upon peptide application to these recombinant cells. This method takes advantage of the aequorin protein, a photoprotein isolated from luminescent jellyfish. We transiently transfected the aequorin plasmid (mtAEQ/pcDNA1) in cell lines that stably expressed the kinin receptors. These cells were then treated with the cofactor coelenterazine, which complexes with intracellular aequorin. This bond breaks in the presence of calcium, emitting luminescence levels indicative of the calcium concentration. As the kinin receptor signals through the release of intracellular calcium, the intensity of the signal is related to the potency of the peptide.
This protocol is a synthesis of several previously described protocols with modifications; it presents step-by-step instructions for the stable expression of GPCRs in a mammalian cell line through functional plate assays (Staubly et al., 2002 and Stables et al., 1997). Using this methodology, we were able to establish stable cell lines expressing the mosquito and the tick kinin receptors, compare the potency of three mosquito kinins, identify critical amino acid positions for the ligand-receptor interaction, and perform semi-throughput screening of a peptide library. Because insect kinins are susceptible to fast enzymatic degradation by endogenous peptidases, they are severely limited in use as tools for pest control or endocrinological studies. Therefore, we also tested kinin analogs containing amino isobutyric acid (Aib) to enhance their potency and biostability. This peptidase-resistant analog represents an important lead in the development of biostable insect kinin analogs and may aid in the development of neuropeptide-based arthropod control strategies.

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

This protocol provides instructions for clonal-cell line selection and a calcium bioluminescence assay to analyze the structure-activity relationships of synthesized arthropod neuropeptides on their cognate GPCRs. This assay can be used for receptor deorphanization and structure-activity relationship studies for synthetic analog design and peptide/drug-lead discovery.

والفحص ضوء بارد الكالسيوم عن التحليل الوظيفي من البعوض ( الزاعجة المصرية) والقراد ( مروحية الرأس المتثني) G - يقترن بروتين المستقبلات

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

Immunology and Infection

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, organism development, and disease. It is often desirable to obtain PPI information using in vivo material, to gain the most natural and unbiased view of the interaction networks. The fruit fly Drosophila melanogaster is an excellent platform to study PPIs in vivo, and lends itself to straightforward approaches to isolating material for biochemical experiments. In particular, fruit fly embryos represent a convenient type of tissue to study PPIs, due to the ease of collecting animals at this developmental stage and the fact that the majority of proteins are expressed in embryogenesis, thus providing a relevant environment to reveal most PPIs. Here we present a protocol for collection of Drosophila embryos at medium scale (0.5-1 g), which is an ideal amount for a wide range of proteomic applications, including analysis of PPIs by affinity purification-mass spectrometry (AP-MS). We describe our designs for 1 L and 5 L cages for embryo collections that can be easily and inexpensively set up in any laboratory. We also provide a general protocol for embryo collection and protein extraction to generate lysates that can be directly used in downstream applications such as AP-MS. Our goal is to provide an accessible means for all researchers to carry out the analyses of PPIs in vivo.

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

The goal of this protocol is to provide a straightforward and inexpensive approach to collecting Drosophila embryos at medium scale (0.5-1 g) and preparing protein extracts that can be used in downstream proteomic applications, such as affinity purification-mass spectrometry (AP-MS).

إعداد على نطاق متوسط ​​من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; مقتطفات الجنين للتجارب بروتيوميك

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, ...

Developmental Biology

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells named wing imaginal discs formed during embryonic development. In the larval stages the imaginal discs grow, increasing its number of cells and forming monolayered epithelial&#160;structures. Inside the pupal case, the imaginal discs bud out and fold into bilayers along a line that becomes the future margin of the wing. During this process, the longitudinal primodia veins originate vein cells on the prospective dorsal and ventral surfaces of the wing. During the pupal stage the stripes of vein cells of each surface communicate in order to generate tight tubes; at the same time, the cross-veins begin their formation.
With the help of appropriate molecular markers, it is possible to identify the major elements composing the wing during its development. For this reason, the ability to accurately detect transcripts or proteins in this structure is critical for studying their abundance and localization related to the development process of the wing.
The procedure described here focuses on manipulating pupal wings, providing detailed instructions on how to dissect the wing during the pupal stage. The dissection of pupal tissue is more difficult to perform than their counterparts in third instar larvae. This is why this approach was developed, to obtain rapid and efficient high quality samples. Details of how to immunostain and mount these wing samples, to allow the visualization of proteins or cell components, are provided in the protocol. With little expertise it is possible to collect 8-10 high quality pupal wings in a short amount of time.

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

The ability to accurately detect transcripts or proteins in Drosophila tissues is critical for studying their abundance and localization related to the development process. Here is the description of a straightforward procedure to dissect pupal wings. These wings can be used as samples in several techniques (immunohistochemistry, PCR assay, etc.).

طريقة سريعة وفعالة لتشريح أجنحة المورفولوجية مناسبة إيمونوديتيكشنز أو فحوصات بكر الخوادر

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells ...

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology, which all influence muscle development and myofibrillogenesis. Omics data, such as those generated by mass spectrometry or deep sequencing, can provide important mechanistic insights into these biological processes. For such approaches, it is beneficial to analyze tissue-specific samples to increase both selectivity and specificity of the omics fingerprints. Here we present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched muscle samples for omics applications. We first describe how to dissect flight muscles at early pupal stages (&#60;48 h after puparium formation [APF]), when the muscles are discernable by green fluorescent protein (GFP) labeling. We then describe how to dissect muscles from late pupae (&#62;48 h APF) or adults, when muscles are distinguishable under a dissecting microscope. The accompanying video protocol will make these technically demanding dissections more widely accessible to the muscle and Drosophila research communities. For RNA applications, we assay the quantity and quality of RNA that can be isolated at different time points and with different approaches. We further show that Bruno1 (Bru1) is necessary for a temporal shift in myosin heavy chain (Mhc) splicing, demonstrating that dissected muscles can be used for mRNA-Seq, mass spectrometry, and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) applications. This dissection protocol will help promote tissue-specific omics analyses and can be generally applied to study multiple biological aspects of myogenesis.

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology. We present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched samples ideal for proteomics and deep-sequencing. These samples can offer important mechanistic insights into diverse aspects of muscle development.

تشريح العضلات الطائرة الصباغية لنهج الomics

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and ...

Genetics

A Method for Quantifying Foliage-Dwelling Arthropods

Terrestrial arthropods play an important role in our environment. Quantifying arthropods in a way that allows for a precise index or estimates of density requires a method with high detection probability and a known sampling area. While most described methods provide a qualitative or semi-quantitative estimate adequate for describing species presence, richness, and diversity, few provide an adequately consistent detection probability and known or consistent sampling areas to provide an index or estimate with adequate precision to detect differences in abundance across environmental, spatial, or temporal variables. We describe how to quantify leaf-dwelling arthropods by sealing the leaves and end of branches in a bag, clipping and freezing the bagged material, and rinsing the previously frozen material in water to separate arthropods from the substrate and quantify them. As we demonstrate, this method can be used at a landscape scale to quantify leaf-dwelling arthropods with adequate precision to test for and describe how spatial, temporal, environmental, and ecological variables influence arthropod richness and abundance. This method allowed us to detect differences in density, richness, and diversity of leaf-dwelling arthropods among 5 genera of trees commonly found in southeastern deciduous forests.

We describe how to quantify leaf dwelling arthropods by sealing the leaves and end of branches in a bag, clipping and freezing the bagged material, and rinsing the previously frozen material in water to separate arthropods from the substrate for quantification.

طريقه لقياس المفصليات المسكنة لأوراق الشجر

Terrestrial arthropods play an important role in our environment. Quantifying arthropods in a way that allows for a precise index or estimates of density ...

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila express gustatory receptors1,2, ion channels3-6, and ionotropic receptors7 that are involved in the detection of volatile and non-volatile sensory cues. These neurons directly contact tastants such as food, noxious substances and pheromones and therefore influence many complex behaviors such as feeding, egg-laying and mating. Electrode recordings and calcium imaging have been widely used in insects to quantify the neuronal responses evoked by these tastants. However, electrophysiology requires specialized equipment and obtaining measurements from a single taste sensillum can be technically challenging depending on the cell-type, size, and position. In addition, single neuron resolution in Drosophila can be difficult to achieve since taste sensilla house more than one type of chemosensory neuron. The live calcium imaging method described here allows responses of single gustatory neurons in live flies to be measured. This method is especially suitable for imaging neuronal responses to lipid pheromones and other ligand types that have low solubility in water-based solvents.

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone.

قياس الاستجابات الفسيولوجية لل<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الخلايا العصبية الحسية إلى الدهن الفيرومونات عن طريق لايف التصوير الكالسيوم

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

SwarmSight: Real-time Tracking of Insect Antenna Movements and Proboscis Extension Reflex Using a Common Preparation and Conventional Hardware

Many scientifically and agriculturally important insects use antennae to detect the presence of volatile chemical compounds and extend their proboscis during feeding. The ability to rapidly obtain high-resolution measurements of natural antenna and proboscis movements and assess how they change in response to chemical, developmental, and genetic manipulations can aid the understanding of insect behavior. By extending our previous work on assessing aggregate insect swarm or animal group movements from natural and laboratory videos using the video analysis software SwarmSight, we developed a novel, free, and open-source software module, SwarmSight Appendage Tracking (SwarmSight.org) for frame-by-frame tracking of insect antenna and proboscis positions from conventional web camera videos using conventional computers. The software processes frames about 120 times faster than humans, performs at better than human accuracy, and, using 30 frames per second (fps) videos, can capture antennal dynamics up to 15 Hz. The software was used to track the antennal response of honey bees to two odors and found significant mean antennal retractions away from the odor source about 1 s after odor presentation. We observed antenna position density heat map cluster formation and cluster and mean angle dependence on odor concentration.

This protocol describes steps for using the novel software, SwarmSight, for frame-by-frame tracking of insect antenna and proboscis positions from conventional web camera videos using conventional computers. The free, open-source software processes frames about 120 times faster than humans and performs at better than human accuracy.

سوارمسايت: تتبع في الوقت الحقيقي الحركات هوائي الحشرات ومنعكس ملحق ململه باستخدام الإعداد المشترك والأجهزة التقليدية

Many scientifically and agriculturally important insects use antennae to detect the presence of volatile chemical compounds and extend their proboscis ...

Neuroscience

Monitoring On-Target Signaling Responses in Larval Zebrafish - Z-REX Unmasks Precise Mechanisms of Electrophilic Drugs and Metabolites

Reactive metabolites and related electrophilic drugs are among the most challenging small molecules to study. Conventional approaches to deconstruct the mode of action (MOA) of such molecules leverage bulk treatment of experimental specimens with an excess of a specific reactive species. In this approach, the high reactivity of electrophiles renders non-discriminate labeling of the proteome in a time- and context-dependent manner; redox-sensitive proteins and processes can also be indirectly and often irreversibly affected. Against such a backdrop of innumerable potential targets and indirect secondary effects, linking phenotype to specific target engagement remains a complex task. Zebrafish targeting reactive electrophiles and oxidants (Z-REX)-an on-demand reactive-electrophile delivery platform adapted for use in larval zebrafish-is designed to deliver electrophiles to a specific protein of interest (POI) in otherwise unperturbed live fish embryos. Key features of this technique include a low level of invasiveness, along with dosage-, chemotype-, and spatiotemporally-controlled precision electrophile delivery. Thus, in conjunction with a unique suite of controls, this technique sidesteps off-target effects and systemic toxicity, otherwise observed following uncontrolled bulk exposure of animals to reactive electrophiles and pleiotropic electrophilic drugs. Leveraging Z-REX, researchers can establish a foothold in the understanding of how individual stress responses and signaling outputs are altered as a result of specific reactive ligand engagement with a specific POI, under near-physiologic conditions in intact living animals.

Zebrafish targeting reactive electrophiles and oxidants (Z-REX) is a chemical biology-based method for the investigation of reactive small-molecule signaling. This technique can be applied to live fish of different developmental stages. Here, we couple standard assays in zebrafish with Z-REX for signaling pathway analysis.

رصد استجابات الإشارات على الهدف في يرقات الزرد - يكشف Z-REX عن آليات دقيقة للأدوية والمستقلبات المحبة للكهرباء

Reactive metabolites and related electrophilic drugs are among the most challenging small molecules to study. Conventional approaches to deconstruct the ...

Biology

<meta charset="utf8"></head><body>تصوير وتحليل عالي الدقة لعيوب ذبابة الفاكهة في العين

A Rapid, Simple Workflow for Quantification of External Adult Drosophila Structures

The Drosophila compound eye is a precisely patterned tissue that has revealed molecular mechanisms and biological processes that drive morphogenesis. It is a simple structure of repeating unit eyes, termed ommatidia, that is used to characterize genetic interactions and gene functions. Mutations that affect eye architecture can be easily detected and analyzed; hence, this system is frequently used in under-resourced institutions. Further phenotypic analysis often includes a Scanning Electron Microscope (SEM) to generate high-magnification images suitable for quantitative analysis. However, SEMs are expensive and require costly reagents; sample preparation spans days; and, often, they need full-time staff for sample preparation and instrument maintenance. This limits their utility at under-resourced institutions or during budgetary austerity. In entomology, the use of high-resolution digital imaging technology is a common practice for the identification and characterization of species. This paper describes a method that combines strategies and allows for high-resolution digital imaging of adult Drosophila structures and quantitative analysis using the open software ImageJ. The workflow is a rapid and student-friendly alternative that remedies the limitations of underfunded and under-resourced research facilities with a cost-effective and rapid approach to quantitative phenotypic analysis.

<meta charset="utf8"></head><body>سير عمل سريع وبسيط للقياس الكمي لهياكل ذبابة الفاكهة الخارجية للبالغين

Here, we present a rapid, low-cost, workflow for high-resolution imaging of adult Drosophila eyes to quantify patterning and growth defects. We describe our protocol for sample preparation by point-mounting, high-resolution image acquisition, and image analysis.

سير عمل سريع وبسيط للقياس الكمي لهياكل ذبابة الفاكهة الخارجية للبالغين

The Drosophila compound eye is a precisely patterned tissue that has revealed molecular mechanisms and biological processes that drive morphogenesis. It ...

إدارة والكشف عن علامات البروتين على المفصليات للبحوث تشتت

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

والفحص ضوء بارد الكالسيوم عن التحليل الوظيفي من البعوض ( الزاعجة المصرية) والقراد ( مروحية الرأس المتثني) G - يقترن بروتين المستقبلات

إعداد على نطاق متوسط من

طريقة سريعة وفعالة لتشريح أجنحة المورفولوجية مناسبة إيمونوديتيكشنز أو فحوصات بكر الخوادر

تشريح العضلات الطائرة الصباغية لنهج الomics

طريقه لقياس المفصليات المسكنة لأوراق الشجر

قياس الاستجابات الفسيولوجية لل

سوارمسايت: تتبع في الوقت الحقيقي الحركات هوائي الحشرات ومنعكس ملحق ململه باستخدام الإعداد المشترك والأجهزة التقليدية

رصد استجابات الإشارات على الهدف في يرقات الزرد - يكشف Z-REX عن آليات دقيقة للأدوية والمستقلبات المحبة للكهرباء

سير عمل سريع وبسيط للقياس الكمي لهياكل ذبابة الفاكهة الخارجية للبالغين

سير عمل سريع وبسيط للقياس الكمي لهياكل ذبابة الفاكهة الخارجية للبالغين

إدارة والكشف عن علامات البروتين على المفصليات للبحوث تشتت

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

والفحص ضوء بارد الكالسيوم عن التحليل الوظيفي من البعوض ( الزاعجة المصرية) والقراد ( مروحية الرأس المتثني) G - يقترن بروتين المستقبلات

إعداد على نطاق متوسط ​​من

طريقة سريعة وفعالة لتشريح أجنحة المورفولوجية مناسبة إيمونوديتيكشنز أو فحوصات بكر الخوادر

تشريح العضلات الطائرة الصباغية لنهج الomics

طريقه لقياس المفصليات المسكنة لأوراق الشجر

قياس الاستجابات الفسيولوجية لل

سوارمسايت: تتبع في الوقت الحقيقي الحركات هوائي الحشرات ومنعكس ملحق ململه باستخدام الإعداد المشترك والأجهزة التقليدية

رصد استجابات الإشارات على الهدف في يرقات الزرد - يكشف Z-REX عن آليات دقيقة للأدوية والمستقلبات المحبة للكهرباء

سير عمل سريع وبسيط للقياس الكمي لهياكل ذبابة الفاكهة الخارجية للبالغين

سير عمل سريع وبسيط للقياس الكمي لهياكل ذبابة الفاكهة الخارجية للبالغين

إعداد على نطاق متوسط من