This work was supported by Adelphi University faculty development grant and grant R15GM113156 from NIGMS awarded to EVC, grant R01GM067862 from NIGMS and grant R01AG027849 from NIA awarded to DMR.

1. الكواشف وحلول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الطعام ذبابة وسائل الإعلام <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حرارة المكونات الذبابة 11٪ سكر، 2٪ الخميرة autolyzed، 5.2٪ دقيق الذرة، أجار 0.79٪ ث / ت في الماء في موقد وضعت في 90 ° C. اثارة بانتظام حتى يتم الحصول على خليط متجانس كثيف قليلا. إعداد الحجم النهائي من 550 مل من ذبابة الغذائية لما مجموعه 100 قارورة مع 5 مل يطير الطعام في كل منهما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة من مصدر التدفئة، وإثارة أحيانا حتى الطعام يبرد إلى 80 درجة مئوية وإضافة 0.2٪ tegosept ميثيل 4-hydroxybenzoate الذائبة في الايثانول 95٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقسيم الطعام في مجلدين على قدم المساواة. إضافة 1.1 مل من 50 ملي rapamycin يذوب في الإيثانول إلى مجلد واحد و 1.1 مل من الايثانول لحجم الآخر. تحريك rapamycin والحلول الإيثانول إلى الطعام. مما لا شك فيه أن درجة الحرارة تنخفض إلى 50 درجة مئوية قبل إضافة المخدرات. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العزلة العازلة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 500 مل من العزلة العازلة [225 ملي المانيتول، 75 ملي السكروز، 10 مم 3- (N &lt;/ م&gt; -morpholino) حمض propanesulfonic (اجتماعات الأطراف) و1 ملم ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA)، و 2.5 ملغ / مل ألبومين المصل البقري (BSA)] في الماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط درجة الحموضة إلى 7.2 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم. إن الأس الهيدروجيني الأولية يكون الحمضية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام معقم زجاجات تخزين التصفية مع حجم المسام 0.22 ميكرون لتعقيم الحل وتخزينها في 4 درجات مئوية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل العازلة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 500 مل من غسل العازلة [225 ملي المانيتول، 75 ملي السكروز، 10 ملي بوكل، 10 ملي تريس حمض الهيدروكلوريك و 5 ملي KH 2 PO 4] في الماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط درجة الحموضة إلى 7.2 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم. إن الأس الهيدروجيني الأولية يكون الحمضية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام معقم زجاجات تخزين التصفية مع حجم المسام 0.22 ميكرون لتعقيم الحل وتخزينها في 4 درجات مئوية. </li></ol></li></ol> 2. تربية من سلالات ذبابة الفاكهة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للسيطرة على كثافة اليرقات خلال التنمية، وضع 25 زوجا من الآباء والأمهات في لزجاجة الثقافة والسماح لهم لوضع البيض لمدة 48 ساعة. </li> &lt;لى&gt; إزالة أولياء الأمور بعد 48 ساعة لتنظيم كثافة البيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 2.1 و 2.2 باستخدام ذرية F1 الناشئة، حتى يتم تحقيق جيلين من هذه السيطرة الكثافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لجمع الكبار، تخدير الذباب باستخدام ثاني أكسيد الكربون (CO 2) ومنفصلة حسب الجنس. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مرحلة منظم واحد لتسليم CO النقي 2 من خزان ضغوط عالية في تدفق مستمر من 5 رطل. لتجنب الكهرباء الساكنة، واستخدام أنابيب بلاستيكية لتحفيز CO 2 إلى 500 مل تصفية قارورة بالماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام سدادة مطاطية مع فتحة واحدة لاغلاق القارورة. استخدام أنابيب بلاستيكية لتوصيل الفتحة الجانبية للقارورة لوحة CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الذباب في لوحة لمدة لا تتجاوز 10-15 دقيقة. السماح للتعافي من التخدير لمدة 24 ساعة قبل وضعها في ظروف تجريبية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتوليد ما يكفي من نواتج الأيض لكسور المخصب الميتوكوندريا، استخدم 300 الذباب في العينة. هنا، استخدام الإناث، ولكن gendeص قد تختلف في تجارب أخرى. نقل 150 الذباب إلى محلية الصنع 1 L الديموغرافيا القفص. السماح بالوصول إلى 5 مل من ذبابة الطعام في قارورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 150 الذباب المتبقية إلى 1 L قفص آخر. لا overpopulate أقفاص مع أكثر من 150 الذباب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ست عينات تكرار في حالة تجريبية. منذ مقتطفات الحيوانية كلها تسفر عن مزيد من نواتج الأيض، لتوليد العزلات 1 عينة من الحيوان كله، ونقل 50 أنثى الذباب في قفص واحد. أما بالنسبة للعزلة الميتوكوندريا، استخدم ست عينات تكرار في حالة تجريبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان أقفاص عند 25 درجة مئوية مع دورة 12 ساعة ضوء و 12 ساعة الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توفير المواد الغذائية الطازجة كل 2 أو 3 أيام في قارورة مع 5 مل من المواد الغذائية للمحافظة على جودة الطعام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على الذباب على الطعام لمدة 10 يوما. هناك حاجة إلى هذه الخطوة لعلاج rapamycin 7. والعلاج أو غيره من الظروف تختلف. </li></ol> 3. عزل الميتوكوندريا الكسور <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفريغ الذباب من قفص واحد (150 الذباب) إلىالزجاج تفلون dounce الخالط مليئة 1 مل من العازلة عزل المبردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التجانس من خلال نقل ما يصل مدقة وهبوطا لمدة 15 السكتات الدماغية. إبقاء هاون على الجليد للحفاظ على الميتوكوندريا سليمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل جناسة لأنبوب 1.5 مل وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتخاذ طاف والطرد المركزي في 6000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية إلى إثراء للالميتوكوندريا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كما يحتوي على طاف الكسر عصاري خلوي، تجاهل طاف أو استخدامه لاجراء تجارب بديلة. Resuspend وبيليه في 300 ميكرولتر من غسل العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 3،1-3،5 لالقفص الثاني. الجمع بين الكريات معلق على حد سواء أقفاص في أنبوب microcentrifuge المبردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في 6000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف وفلاش تجميد بيليه في النيتروجين السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين الكسور المخصب الميتوكوندريا في -80 ° C أو انخفاض درجة الحرارة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدلا من ذلك، لمرحلة ما قبل الحيوان كلهparation، ضع البالغين في أنبوب microcentrifuge المبردة. فلاش تجميد القارورة في النيتروجين السائل ومخزن البالغين في -80 ° C أو انخفاض درجة الحرارة. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Scheffler, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mitochondria (Scheffler, Mitochondria). , 484 (2007).</li><li>Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria--a+nexus+for+aging,+calorie+restriction,+and+sirtuins.">Mitochondria--a nexus for aging, calorie restriction, and sirtuins.</a> Cell. 132 (2), 171-176 (2008).</li><li>Raimundo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+pathology:+stress+signals+from+the+energy+factory.">Mitochondrial pathology: stress signals from the energy factory.</a> Trends in molecular medicine. 20 (5), 282-292 (2014).</li><li>Embley, T. M., Martin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+evolution,+changes+and+challenges.">Eukaryotic evolution, changes and challenges.</a> Nature. 440 (7084), 623-630 (2006).</li><li>Lane, N., , <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the Meaning of Life. 368, (2006).</li><li>Montooth, K. L., Meiklejohn, C. D., Abt, D. N., Rand, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial-nuclear+epistasis+affects+fitness+within+species+but+does+not+contribute+to+fixed+incompatibilities+between+species+of+Drosophila.">Mitochondrial-nuclear epistasis affects fitness within species but does not contribute to fixed incompatibilities between species of Drosophila.</a> Evolution; international journal of organic evolution. 64 (12), 3364-3379 (2010).</li><li>Villa-Cuesta, E., Holmbeck, M. A., Rand, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapamycin+increases+mitochondrial+efficiency+by+mtDNA-dependent+reprogramming+of+mitochondrial+metabolism+in+Drosophila.">Rapamycin increases mitochondrial efficiency by mtDNA-dependent reprogramming of mitochondrial metabolism in Drosophila.</a> Journal of cell science. 127 (Pt 10), 2282-2290 (2014).</li><li>Zhu, C. -. T., Ingelmo, P., Rand, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G&#215;G&#215;E+for+Lifespan+in+Drosophila:+Mitochondrial,+Nuclear,+and+Dietary+Interactions+that+Modify+Longevity.">G&#215;G&#215;E for Lifespan in Drosophila: Mitochondrial, Nuclear, and Dietary Interactions that Modify Longevity.</a> PLoS genetics. 10 (5), e1004354 (2014).</li><li>Madala, N. E., Piater, L. A., Steenkamp, P. A., Dubery, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivariate+statistical+models+of+metabolomic+data+reveals+different+metabolite+distribution+patterns+in+isonitrosoacetophenone-elicited+Nicotiana+tabacum+and+Sorghum+bicolor+cells.">Multivariate statistical models of metabolomic data reveals different metabolite distribution patterns in isonitrosoacetophenone-elicited Nicotiana tabacum and Sorghum bicolor cells.</a> SpringerPlus. 3, 254 (2014).</li><li>Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochemical+Studies+Of+Mammalian+Tissues+I+.+Isolation+Of+Intact+Mitochondria+From+Rat+Liver+Some+Biochemical+Properties+Of+Mitochondria+And+Submicroscopic+Particulate+Material.">Cytochemical Studies Of Mammalian Tissues I . Isolation Of Intact Mitochondria From Rat Liver Some Biochemical Properties Of Mitochondria And Submicroscopic Particulate Material.</a> Journal of Biological Chemistry. 172, 619-635 (1948).</li><li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+isolation:+functional+mitochondria+from+mouse+liver,+muscle+and+cultured+fibroblasts.">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nature protocols. 2 (2), 287-295 (2007).</li><li>Corcelli, A., Saponetti, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+isolated+in+nearly+isotonic+KCl+buffer:+focus+on+cardiolipin+and+organelle+morphology.">Mitochondria isolated in nearly isotonic KCl buffer: focus on cardiolipin and organelle morphology.</a> Biochimica et biophysica acta. 1798 (3), 681-687 (2010).</li><li>Roede, J. R., Park, Y., Li, S., Strobel, F. H., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detailed+mitochondrial+phenotyping+by+high+resolution+metabolomics.">Detailed mitochondrial phenotyping by high resolution metabolomics.</a> PloS one. 7 (3), e33020 (2012).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

الخطوات الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هي: 1) تربية كافية الذباب في الفضاء وفيرة. من المهم جدا أن لا overpopulate الأقفاص الديموغرافيا مع أكثر من 150 الذباب لكل منهما؛ 2) تغيير الغذائي للأقفاص في كثير من الأحيان لتجنب المنافسة المواد الغذائية والنقص الغذائي. و3) الحفاظ على جمي?...

الهدف من هذا الإجراء هو تطوير الكسور الميتوكوندريا المخصب التي تحقق ما يكفي من نواتج الأيض الميتوكوندريا لالايض الدراسات باستخدام ذبابة الفاكهة السوداء البطن. في تجربتنا، والايض التحليل باستخدام أساليب الاستخراج الخلوية كلها غير قادرة على اكتشاف التغيرات الطفيفة الأيض الميتوكوندريا في ذبابة الفاكهة. ومع ذلك، تجزئة الميتوكوندريا قبل التحليل الايض يزيد من حساسية لتحديد التحولات الأيض الميتوكوندريا. الميتوكوندريا هي العضيات الخلوية مسؤولة عن توفير 90٪ من الطاقة التي الخلايا بحاجة لوظيفة عادية 1. في السنوات الأخيرة تم الاعتراف بأن الميتوكوندريا تلعب دورا أكثر نشاطا في وظيفة الخلوية والعضوي من مجرد إنتاج أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP)، ويتم الاعتراف الآن كمراكز لتنظيم التمثيل الغذائي التوازن 2،3. الميتوكوندريا هي نتيجة لعملية endosymbiotic التي ديساندمجت الأنساب الميكروبية صبغة ~ 1.5 مليار سنة مضت 4. كما الميتوكوندريا تطورت إلى العضيات الحقيقية، وأدرجت الجينات من معايش جواني في الجينوم النووي الناشئة. في الحيوانات اليوم، ما يقرب من 1500 بروتينات الميتوكوندريا هي المشفرة النووية، بينما لا تزال 37 الجينات في الحمض النووي المتقدري، 13 منها ترميز البروتينات الميتوكوندريا التي هي مفارز من المجمعات انزيم الفسفرة التأكسدية 5. هناك حاجة إلى التنسيق بين الميتوكوندريا ومقصورات النووية للحفاظ على وظيفة الميتوكوندريا سليمة. باستخدام الأساليب المذكورة هنا كنا قادرين على اكتشاف التغيرات الأيضية الميتوكوندريا في ذبابة الفاكهة التي تنتج عن التلاعب في التنسيق بين جينوم الميتوكوندريا والنووية. كنا سلالة من ذبابة الفاكهة التي و mtDNA من الأنواع الشقيقة D. وضعت simulans على D. واحد البطن خلفية النووية 6. هذا mitonuclear &#39;عطلت&#39;ومقارنة التركيب الوراثي إلى التركيب الوراثي mitonuclear &quot;الأصلي&quot;، أو تطورت المشارك لD. البطن تحمل نفس الجينوم النووي مع D. شعبه الأصيل البطن و mtDNA. وD. البطن وD. simulans mtDNAs تختلف باختلاف ~ 100 الأحماض الأمينية و&gt; 500 بدائل مرادفة التي تؤثر mitonuclear 7،8 الاتصالات. ولدت لنا مقتطفات ذبابة كاملة ومقتطفات المخصب الميتوكوندريا لدراسة التحولات الأيض ردا على الإجهاد الدوائي. نحن هنا تظهر أنه عند استخدام الميتوكوندريا المخصب الكسور نكتشف التحولات وضوحا في الأيض الميتوكوندريا بين الأصلي،-تطورت شارك الوراثي تحمل D. mtDNAs البطن وراثى تعطلت تحمل D. simulans و mtDNA. في المقابل، فإن التغييرات الأيض بين هذه الأنماط الجينية هما خفية باستخدام أساليب العادية التي تستخدم كله استخراج الطاير. ولذلك، قدمت هذه الطريقة مسار لفهم كيفية mtDNAs توسط التغييرات في الميتوكوندريااستجابة إلى أدوية مختلفة.

<table><tbody><tr><td>0.2% tegosept-methyl 4-hydroxybenzoate</td><td>VWR</td><td>AAA14289</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>792799</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>3-(&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>38057&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RES3098T-B7</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1551139</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; pads to anesthetize flies</td><td>Tritech Research</td><td>MINJ-DROS-FP</td><td></td></tr><tr><td>1 L cage</td><td>Web Restaurant Store</td><td>999RD32</td><td></td></tr><tr><td>1 L cage lid</td><td>Web Restaurant Store</td><td>999LRD</td><td></td></tr><tr><td>a glass-teflon dounce homogenizer&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9661231</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>rapamycin&amp;nbsp;</td><td>LC Laboratories&amp;nbsp;</td><td>R-5000</td><td></td></tr><tr><td>anti-porin</td><td>MitoSciences</td><td>MSA03</td><td></td></tr><tr><td>anti-alpha tubulin</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>12G10</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; pad</td><td>Tritech Research, Inc</td><td>MINJ-DROS-FP</td><td></td></tr><tr><td>filter flask</td><td>enasco</td><td>SB08184M</td><td></td></tr><tr><td>rubber stopper</td><td>enasco</td><td>S08512M</td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of mitochondrial enriched fractions for metabolic analysis in drosophila

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often compromise the lives of those who suffer from these complex diseases. Detecting mitochondrial metabolic changes is vital to the understanding of mitochondrial disorders and mitochondrial responses to pharmacological agents. Although mitochondrial metabolism is at the core of metabolic regulation, the detection of subtle changes in mitochondrial metabolism may be hindered by the overrepresentation of other cytosolic metabolites obtained using whole organism or whole tissue extractions. 
Here we describe an isolation method that detected pronounced mitochondrial metabolic changes in Drosophila that were distinct between whole-fly and mitochondrial enriched preparations. To illustrate the sensitivity of this method, we used a set of Drosophila harboring genetically diverse mitochondrial DNAs (mtDNA) and exposed them to the drug rapamycin. Using this method we showed that rapamycin modifies mitochondrial metabolism in a mitochondrial-genotype-dependent manner. However, these changes are much more distinct in metabolomics studies when metabolites were extracted from mitochondrial enriched fractions. In contrast, whole tissue extracts only detected metabolic changes mediated by the drug rapamycin independently of mtDNAs.

عن طريق شرح بروتوكول أعلاه، أجرينا تحليل metabolomic على الكسور المخصب الميتوكوندريا ومقتطفات الحيوانية كلها لاختبار تأثير المخدرات rapamycin على mtDNAs المتباينة 7. لقد نجينا 200 ميكرومتر من rapamycin عن طريق إذابة الدواء في الغذاء الطاير. تعرضت الذباب إلى ...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila at JoVE.com

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Mitochondria play central roles in the regulation of metabolism and homeostasis. Subtle changes in mitochondrial metabolism that affect organismal physiology could be difficult to detect in whole organism metabolomics studies. Here we describe an isolation method that enhances the detection of subtle metabolic shifts in Drosophila melanogaster.

إعداد الميتوكوندريا المخصب الكسور لتحليل التمثيل الغذائي في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often ...

preparation-mitochondrial-enriched-fractions-for-metabolic-analysis

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

9.5K Views.  Adelphi University. Mitochondria play central roles in the regulation of metabolism and homeostasis. Subtle changes in mitochondrial metabolism that affect organismal physiology could be difficult to detect in whole organism metabolomics studies. Here we describe an isolation method that enhances the detection of subtle metabolic shifts in Drosophila melanogaster. 

Video: Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human organs, possess highly conserved metabolic pathways and have a relatively short lifespan that allows the study of different fundamental mechanisms in a short period of time. It is, however, surprising that one of the mechanisms essential for cellular metabolism, the mitochondrial respiration, has not been thoroughly investigated in this model. It is likely because the measure of the mitochondrial respiration in Drosophila usually requires a very large number of individuals and the results obtained are not highly reproducible. Here, a method allowing the precise measurement of mitochondrial oxygen consumption using minimal amounts of tissue from Drosophila is described. In this method, the thoraxes are dissected and permeabilized both mechanically with sharp forceps and chemically with saponin, allowing different compounds to cross the cell membrane and modulate the mitochondrial respiration. After permeabilization, a protocol is performed to evaluate the capacity of the different complexes of the electron transport system (ETS) to oxidize different substrates, as well as their response to an uncoupler and to several inhibitors. This method presents many advantages compared to methods using mitochondrial isolations, as it is more physiologically relevant because the mitochondria are still interacting with the other cellular components and the mitochondrial morphology is conserved. Moreover, sample preparations are faster, and the results obtained are highly reproducible. By combining the advantages of Drosophila as a model for the study of metabolism with the evaluation of mitochondrial respiration, important new insights can be unveiled, especially when the flies are experiencing different environmental or pathophysiological conditions.

In this paper, a method to measure oxygen consumption using high-resolution respirometry in permeabilized thoraxes of Drosophila is described. This technique requires a minimal amount of tissue compared to the classic mitochondrial isolation technique and the results obtained are more physiologically relevant.

قياس استهلاك الأوكسجين المتقدرية في ألياف بيرميبيليزيد من المورفولوجية استخدام كميات ضئيلة من الأنسجة

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

Biochemistry

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of physiological processes. Mitochondrial dysfunction is a primary cause of a number of metabolic and neurodegenerative diseases. Intact mitochondria are critical for their proper functioning. The enzyme citrate synthase is localized in the mitochondrial matrix and thus can be used as a quantitative enzyme marker of intact mitochondrial mass. Given that many molecules and pathways that have important functions in mitochondria are highly conserved between humans and Drosophila, and that an array of powerful genetic tools are available in Drosophila, Drosophila serves as a good model system for studying mitochondrial function. Here, we present a protocol for fast and simple measurement of citrate synthase activity in tissue homogenate from adult flies without isolating mitochondria. This protocol is also suitable for measuring citrate synthase activity in larvae, cultured cells, and mammalian tissues.

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

We present a protocol for a colorimetric assay of citrate synthase activity for quantification of intact mitochondrial mass in Drosophila tissue homogenates.

الفحص اللوني لنشاط سينثاز السيترات في دروفيميلا ميلنوغاستر

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of ...

Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS)-based Metabolomics

Recent advances in the field of metabolomics have established the fruit fly Drosophila melanogaster as a powerful genetic model for studying animal metabolism. By combining the vast array of Drosophila genetic tools with the ability to survey large swaths of intermediary metabolism, a metabolomics approach can reveal complex interactions between diet, genotype, life-history events, and environmental cues. In addition, metabolomics studies can discover novel enzymatic mechanisms and uncover previously unknown connections between seemingly disparate metabolic pathways. In order to facilitate more widespread use of this technology among the Drosophila community, here we provide a detailed protocol that describes how to prepare Drosophila larval samples for gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)-based metabolomic analysis. Our protocol includes descriptions of larval sample collection, metabolite extraction, chemical derivatization, and GC-MS analysis. Successful completion of this protocol will allow users to measure the relative abundance of small polar metabolites, including amino acids, sugars, and organic acids involved in glycolysis and the TCA cycles.

Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry GC-MS-based Metabolomics

This protocol describes how to prepare Drosophila larvae for GC-MS-based metabolomic analysis.

إعداد عينات اليرقات المورفولوجية للفصل اللوني للغاز-الكتلي (GC-MS)-على أساس جميع

Recent advances in the field of metabolomics have established the fruit fly Drosophila melanogaster as a powerful genetic model for studying animal ...

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play essential roles in apoptotic cell death2, cell survival3, mammalian development4, neuronal development and function4, intracellular signalling5, and longevity regulation6. Our understanding of these complex biological processes controlled by mitochondria relies on robust methods for assessing their morphology, their protein and lipid composition, the integrity of their DNA, and their numerous vital functions. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and well-defined proteome, is a valuable model for studying the molecular and cellular mechanisms underlying essential biological functions of mitochondria. For these types of studies, it is crucial to have highly pure mitochondria. Here we present a detailed description of a rapid and effective method for purification of yeast mitochondria. This method enables the isolation of highly pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification. Mitochondria purified by this method are suitable for cell-free reconstitution of essential mitochondrial processes and can be used for the analysis of mitochondrial structure and functions, mitochondrial proteome and lipidome, and mitochondrial DNA.

We describe a rapid and effective method for purification of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. This method enables the high-yield isolation of pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification.

تنقية الميتوكوندريا من خلايا الخميرة

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Biology

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, Drosophila research lacks popularity in developing countries, possibly due to the misinformed idea that establishing a lab and performing relevant experiments with such tiny insects is difficult and requires expensive, specialized apparatuses. Here, we describe how to build an affordable flylab to quantitatively analyze a myriad of behavioral parameters in D. melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We provide protocols to build in-house vial racks, courtship arenas, apparatuses for locomotor assays, etc., to be used for general fly maintenance and to perform behavioral experiments using adult flies and larvae. We also provide protocols on how to use more sophisticated systems, such as a high resolution oxygraph, to measure mitochondrial oxygen consumption in larval samples, and show its association with behavioral changes in the larvae upon the xenotopic expression of the mitochondrial alternative oxidase (AOX). AOX increases larval activity and mitochondrial leak respiration, and accelerates development at low temperatures, which is consistent with a thermogenic role for the enzyme. We hope these protocols will inspire researchers, especially from developing countries, to use Drosophila to easily combine behavior and mitochondrial metabolism data, which may lead to information on genes and/or environmental conditions that may also regulate human physiology and disease states.

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

We provide protocols for anyone with a "maker culture" mind to start building a flylab for quantitative analysis of a myriad of behavioral parameters in Drosophila melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We also describe a high resolution respirometry protocol using larvae to combine behavioral and mitochondrial metabolism data.

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, ...

Behavior

تحليل فسيولوجيا الميتوكوندريا والطاقة الحيوية في ذباب الفاكهة

Analyzing Mitochondrial Function in a Drosophila melanogaster PINK1B9-Null Mutant Using High-resolution Respirometry

Neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s Disease (PD), and cellular disturbances such as cancer are some of the disorders that disrupt energy metabolism with impairment of mitochondrial functions. Mitochondria are organelles that control both energy metabolism and cellular processes involved in cell survival and death. For this reason, approaches to evaluate mitochondrial function can offer important insights into cellular conditions in pathological and physiological processes. In this regard, high-resolution respirometry (HRR) protocols allow evaluation of the whole mitochondrial respiratory chain function or the activity of specific mitochondrial complexes. Furthermore, studying mitochondrial physiology and bioenergetics requires genetically and experimentally tractable models such as Drosophila melanogaster.
This model presents several advantages, such as its similarity to human physiology, its rapid life cycle, easy maintenance, cost-effectiveness, high throughput capabilities, and a minimized number of ethical concerns. These attributes collectively establish it as an invaluable tool for dissecting complex cellular processes. The present work explains how to analyze mitochondrial function using the Drosophila melanogaster PINK1B9-null mutant. The pink1 gene is responsible for encoding PTEN-induced putative kinase 1, through a process recognized as mitophagy, which is crucial for the removal of dysfunctional mitochondria from the mitochondrial network. Mutations in this gene have been associated with an autosomal recessive early-onset familial form of PD. This model can be used to study mitochondrial dysfunction involved in the pathophysiology of PD.

تسليط الضوء على المؤلف: استكشاف وظيفة الميتوكوندريا والسمية الكيميائية باستخدام ذبابة الفاكهة الميلانية 

Here we present a high-resolution respirometry protocol to analyze bioenergetics in PINK1B9-null mutant fruit flies. The method uses the Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT) protocol.

تحليل وظيفة الميتوكوندريا في ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر PINK1B9-null الطافرة باستخدام قياس التنفس عالي الدقة

Neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s Disease (PD), and cellular disturbances such as cancer are some of the disorders that disrupt energy ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

التحليل الأيضي اليرقات melanogaster المورفولوجية و "العقول الكبار"

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

Neuroscience

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

تنقية النصوص والأيضات من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; رؤساء

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

إعداد الميتوكوندريا المخصب الكسور لتحليل التمثيل الغذائي في

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

قياس استهلاك الأوكسجين المتقدرية في ألياف بيرميبيليزيد من المورفولوجية استخدام كميات ضئيلة من الأنسجة

الفحص اللوني لنشاط سينثاز السيترات في دروفيميلا ميلنوغاستر

إعداد عينات اليرقات المورفولوجية للفصل اللوني للغاز-الكتلي (GC-MS)-على أساس جميع

تنقية الميتوكوندريا من خلايا الخميرة

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

تحليل وظيفة الميتوكوندريا في ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر PINK1^B9-null الطافرة باستخدام قياس التنفس عالي الدقة

تحليل وظيفة الميتوكوندريا في ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر PINK1^B9-null الطافرة باستخدام قياس التنفس عالي الدقة

تحليل وظيفة الميتوكوندريا في ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر PINK1^B9-null الطافرة باستخدام قياس التنفس عالي الدقة

التحليل الأيضي اليرقات melanogaster المورفولوجية و "العقول الكبار"

تنقية النصوص والأيضات من