Name: isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts.
Uploaded: 2015-05-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts. at JoVE.com

This work was supported by funding received from the National Institutes of Health (1R01AI083269).

تمت الموافقة على الدراسات الفئران من قبل لجنة المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) من جامعة نورث كارولينا تشابل هيل، وكان كل رعاية الحيوان وفقا للمبادئ التوجيهية IACUC. 1. إعداد الوليد والكبار التوتة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد جميع الكواشف والمعدات قبل القتل الرحيم الفئران المانحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم الأدوات الجراحية قبل التعقيم أو طرق أخرى مناسبة. يجب إجراء جميع العمليات الجراحية تحت غطاء تدفق الصفحي للحفاظ على ظروف معقمة وتجنب التلوث. تجميع الأدوات اللازمة لاستخراج التوتة من الفئران المانحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء طبق 60 ملم مع العقيمة برنامج تلفزيوني 1X (7.4 درجة الحموضة) ووضع على الجليد داخل غطاء محرك السيارة. وسوف تستخدم هذه لتخزين لفترة وجيزة التوتة رفعه من الفئران المانحة قبل الزرع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وفقا لمبادئ توجيهية أخلاقية، الموت ببطء الفئران حديثي الولادة المانحة بقطع الرأس والمانحين الكبار الفئران عن طريق CO 2 الخنق تليها خلع عنق الرحم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لصemoval من الغدة الصعترية: وضع الماوس في موقف الظهرية راقد على منشفة ورقية معقمة ماصة ورذاذ مع الايثانول 70٪ قبل اتخاذ شق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فضح تجويف البطن والصدر من خلال جعل شق خط الوسط من خلال الجلد. أضعاف الجلد فوق الصدر والأطراف الأمامية للكشف عن تجويف الصدر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل اثنين من الشقوق الجانبية من خلال الحجاب الحاجز والقفص الصدري لفضح المنصف العلوي والأمامي التجويف الصدري. يجب أن تكون الغدة الصعترية مرئية كما فصين البيضاء مباشرة فوق والمتاخمة للقلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ندف بصرف النظر الأنسجة الضامة المحيطة الغدة الصعترية مع ملقط غرامة، والتأكد من عدم تعطيل كبسولة. في حين تحجم القفص الصدري مع ملقط، واستخدام الزوج الثاني من ملقط لاستخراج اثنين من فصوص الغدة الصعترية عن طريق وضع ملقط المنحني تحت الجهاز وسحب عموديا. ويمكن القيام بذلك باستخدام نطاق تشريح لاستخراج التوتة من الفئران حديثي الولادة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الغدة الصعترية في 60 مم ديش تحتوي على العقيمة برنامج تلفزيوني 1X (7.4 درجة الحموضة) على الجليد وفصوص الغدة الصعترية منفصلة من خلال قطع البرزخ الضام. إزالة أي حطام من فصوص الغدة الصعترية التأكد من عدم تلف كبسولة، وقطع الغدة الصعترية إلى العدد المناسب من أقسام للزرع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لا تلاعب في التوتة تم الحصول عليها من الفئران حديثي الولادة. ملاحظة: يستخدم لمدة أقصاها اثنين من الفئران المتلقي (1 الفص في المتلقي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زرع التوتة تم الحصول عليها من فئران بالغة في مدة أقصاها 4-6 الفئران المتلقي. باستخدام زوج من الملقط، فهم بعناية شخص بالغ واحد فص الغدة الصعترية، كما هو مبين في الشكل رقم 1، وقطع الغدة الصعترية إلى ثلاثة أقسام متساوية باستخدام مقص جراحي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 1،3-1،4 لكل الماوس المانحة. من أجل أن يحدد الوقت الذي تتعرض التوتة، وإعداد الغدة الصعترية 1 المانحة في وقت واحد. </li></ol> 2. الغدة الصعترية زرع تحت كبسولة الكلى <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع المعدات المعقمة قبل المدرجة في الجدول 1. العقيم السليموينبغي الاستفادة من تقنية أثناء الإجراء لمنع تعريض الزرع المتلقين لأدوات أو الكواشف الملوثة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل الزرع، تزن كل وعلامة الماوس المتلقي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المجهر تشريح ودائرة التخدير في غطاء تدفق الصفحي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الحلاقة الكهربائية، حلق الجانب الأيسر من الفأرة المستفيدة وضمان عدم وجود الشعر يبقى في جميع أنحاء المنطقة التي استخدمت لصنع شق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على المرذاذ isofluorane وتخدير الماوس باستخدام جرعة بين 1-2٪. تأكد التخدير المناسب قبل البدء في إجراء العمليات الجراحية عن طريق التحقق من عدم وجود رد الفعل التالية قرصة أخمص قدميه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد تخدير الماوس بشكل صحيح، وتطبيق مرهم البيطرية للعيون من الماوس لمنع جفاف وإعداد الماوس لزرع على النحو التالي: </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الماوس تحت المجهر تشريح في وضعية الاضطجاع الجانبي الأيمن بحيث الجانب حلق يكون مواجها لها. Startiنانوغرام في وسط منطقة العمليات الجراحية، موزعة بشكل دائري باستخدام ماصة نقل القابل للتصرف 70٪ من الإيثانول، تليها بوفيدون اليود (betadine). تكرار العلاج الايثانول / betadine 3 مرات قبل اتخاذ شق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مقص تشريح جعل 1-2 سم الجناح شق مباشرة فوق الكلى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط المتوسطة فهم النسيج الضام المتاخمة للالكلى ورفع بلطف الكلى بحيث انها تقع على قمة الجهاز العضلي. للحفاظ على الكلى المكشوفة وفي مكان على الجهاز العضلي، إدراج ذراع واحدة من الملقط المتوسطة تحت الكلى، مع إيلاء اهتمام خاص عدم تعطيل إليوم الكلوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل منع جفاف الأنسجة، ري الكلى العقيمة مع برنامج تلفزيوني 1X (7.4 درجة الحموضة) خلال كل خطوة حتى التلاعب في الكلى والكلى كبسولة كاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط غرامة قرصة ورفع الكبسولة بالقرب من حافة الكلى الأكثر القاصي إلى الغدد الكظرية لفصلها عن الكلى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مقياس 18الإبرة إلى إجراء شق كبير بما فيه الكفاية لادخال قطعة استعداد لالغدة الصعترية المانحة (الشكل 2A). تأكد للحفاظ على شق المحفظة صغيرة قدر الإمكان لمنع الخلع من الكسب غير المشروع مع مرور الوقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع الحفاظ على كبسولة ابتعد من الكلى، واستخدام الزوج الثاني من ملقط غرامة لإدراج الكسب غير المشروع تحت الكبسولة ودفع الغدة الصعترية بقدر إلى الأمام من شق المحفظة ممكن (الشكل 2B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة ملقط من تحت الكلى، والعودة برفق الكلى مرة أخرى إلى مكان من خلال شق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إغلاق الجهاز العضلي من قبل خياطة الجدار البريتوني وتطبيق betadine مرة واحدة مغلقة. بعد خياطة كاملة، وتطبيق مقاطع الجرح لإغلاق الأدمة وتطبيق betadine إلى المنطقة المحيطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عودة الماوس إلى القفص الذي تم تسخينه باستخدام مصباح الحرارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رصد كل فأر بعد العملية حتى يستعيد وعيه الكامل والتنقل وعدم وضع الفئران ثاور لم يشف بعد التخدير في قفص مع غيرها من الحيوانات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج الفئران مع أدوية علاج الألم بعد العمليات الجراحية حسب الحاجة. توفير الفئران مع المسكنات بعد الجراحة مثل اسيتامينوفين في مياه الشرب بتركيز 1.6 ملغ / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 2،3-2،9 لكل الماوس المستفيدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضمان عودة الفئران إلى النشاط العادي في حدود 1 ساعة بعد الجراحة. مراقبة الوزن بعد الجراحة، المهارات الحركية، وكذلك الشرب والتغذية نشاط كل الماوس لتحديد المضاعفات التي تنشأ نتيجة لإجراء عملية زرع. ملاحظة: فقدان الوزن بعد العملية، بالمقارنة مع الوزن قبل العملية، وكذلك التنقل تغييرها أو عدم تناول الطعام أو الشراب قد يشير مضاعفات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة T إعادة الخلايا في الدم المحيطي النزيف الفئران عن طريق الذيل نيك يليه فصل الخلايا اللمفية باستخدام Lympholyte وسائل الاعلام فصل الخلايا وفقا لمواصفات الشركة المصنعة. إنجاز T خلية characterizaنشوئها قبل تلطيخ الخلايا الليمفاوية الأجسام المضادة مترافق fluorescently محددة للعلامات الخلايا التائية CD3، CD4، وCD8، فضلا عن الممي ميت يعيش مثل succinimidyl استر تنشيط fluorescently 8. التحليل كما هو مبين في الشكل (3) ويمكن تحقيق ذلك عن طريق النابضة على singlets، والخلايا الحية، وخلايا إيجابية CD3. </li></ol>

<ol>
	<li>Kappler, J. W., Roehm, N., Marrack, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+tolerance+by+clonal+elimination+in+the+thymus.">T cell tolerance by clonal elimination in the thymus.</a> Cell. 49 (2), 273-280 (1987).</li><li>Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Journey+through+the+thymus:+stromal+guides+for+T-cell+development+and+selection.">Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection.</a> Nat. Rev. Immunol. 6, 127-135 (2006).</li><li>Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+and+negative+selection+of+the+T+cell+repertoire:+what+thymocytes+see+(and+don&#8217;t+see).">Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don&#8217;t see).</a> Nat. Rev. Immunol. 14 (6), 377-391 (2014).</li><li>Schwartz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquisition+of+immunologic+self-tolerance.">Acquisition of immunologic self-tolerance.</a> Cell. 57 (7), 1073-1081 (1989).</li><li>Kishimoto, H., Sprent, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+defect+in+central+tolerance+in+NOD+mice.">A defect in central tolerance in NOD mice.</a> Nat. Immunol. 2 (11), 1025-1031 (2001).</li><li>Anderson, G., Jenkinson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+central+tolerance+with+reaggregate+thymus+organ+cultures.">Investigating central tolerance with reaggregate thymus organ cultures.</a> Methods. Mol. Biol. 380, 185-196 (2007).</li><li>He, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymic+development+of+autoreactive+T+cells+in+NOD+mice+is+regulated+in+an+age-dependent+manner.">Thymic development of autoreactive T cells in NOD mice is regulated in an age-dependent manner.</a> J. Immunol. 191 (12), 5858-5866 (2013).</li><li>Stewart, C. C., Stewart, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+6.+Immunophenotyping.">Chapter 6. Immunophenotyping.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2001).</li><li>Rice, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymic+transplantation+for+complete+DiGeorge+syndrome:+medical+and+surgical+considerations.">Thymic transplantation for complete DiGeorge syndrome: medical and surgical considerations.</a> J. Pediatr. Surg. 39 (11), 1607-1615 (2004).</li><li>Markert, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+thymus+tissue+in+complete+DiGeorge+Syndrome.">Transplantation of thymus tissue in complete DiGeorge Syndrome.</a> N. Engl. J. Med. 341, 1180-1189 (1999).</li><li>Market, M. L., Devlin, B. H., McCarthy, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymus+transplantation.">Thymus transplantation.</a> Clin. Immunol. 135 (2), 236-246 (2010).</li><li>Wells, A. D., Li, X., Strom, T. B., Turka, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+peripheral+T-cell+depletion+in+transplantation+tolerance.">The role of peripheral T-cell depletion in transplantation tolerance.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 356 (1409), 617-623 (2001).</li><li>Albuquerque, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+FOXN1-Deficiency+is+associated+with+ab+double-negative+and+FoxP3++T-cell+expansions+that+are+distinctly+modulated+upon+thymic+transplantation.">Human FOXN1-Deficiency is associated with ab double-negative and FoxP3+ T-cell expansions that are distinctly modulated upon thymic transplantation.</a> PLoS One. 7 (5), e37042 (2012).</li><li>Chinn, I. K., Milner, J. D., Scheinberg, P., Douek, D. C., Markert, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymus+transplantation+restores+the+repertoires+of+forkhead+box+protein+3+(FoxP3)++and+FoxP3-+T+cells+in+complete+DiGeorge+anomaly.">Thymus transplantation restores the repertoires of forkhead box protein 3 (FoxP3)+ and FoxP3- T cells in complete DiGeorge anomaly.</a> Clin Exp Immunol. 173 (1), 140-149 (2013).</li><li>Savino, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+thymus+is+a+common+target+organ+in+infectious+diseases.">The thymus is a common target organ in infectious diseases.</a> PLoS Pathog. 2 (6), e62 (2006).</li></ol>

The authors do not have any competing financial interests to disclose.

Events regulating thymic selection are poorly understood. Recent studies have demonstrated ontogenic changes in the efficiency of selection. Coupling this approach with different transgenic thymus donor and recipient mice will further facilitate studies to identify the events and parameters that regulate thymic selection. Notably, thymic transplantation is used for the treatment and management of T cell and thymic disorders seen for instance in athymic infants lacking functional T cells and in patients with DiGeorge synd...

الغدة الصعترية هي الجهاز الذي الأحداث الهامة في تطوير الخلايا T تحدث 1. thymocytes المقيمين، على إعادة ترتيب الخلايا التائية مستقبلات (TCR) α و β الجينات، الخضوع لسلسلة من التفاعلات مع الخلايا lymphostromal ومقدمة للمستضد (APC) في المناطق القشرية والنخاعية من الغدة الصعترية 2. وتتوسط التوتة اختيار إيجابية من الخلايا الظهارية الغدة الصعترية القشرية (TEC) لإنتاج thymocytes التي تعترف الببتيدات المستضدات في سياق المضيفة الرئيسية معقد التوافق النسيجي (MHC) الصف الأول والثاني جزيئات 2-3. اللاحقة اختيار السلبية الغدة الصعترية تستلزم تطهير thymocytes autoreactive، يقودها التفاعل مع TEC النخاع أو الخلايا الجذعية (DC) أن الببتيدات الحالية المستمدة من البروتينات الذاتي ملزمة MHC من الدرجة الأولى والثانية الجزيئات 3. النتيجة النهائية لهذه العمليات هو إنشاء مجموعة من خلايا CD4 + ناضجة وCD8 + T قادرة على الرد على طيف واسعمن المستضدات الأجنبية، وفى نفس الوقت الحد الأدنى من التفاعل للبروتينات الذاتي 4. ويتأثر كفاءة أحداث اختيار الغدة الصعترية من قبل مجموعة من العوامل، بما في ذلك نضج الغدة الصعترية، وتواتر النخاع وTEC القشرية، وتكوين فرعية من الغدة الصعترية DC، ومصدر السلائف الغدة الصعترية 3. والجدير بالذكر، أن اختيار الغدة الصعترية الشاذة يؤدي في المناعة الذاتية 5 أو العوز المناعي الأمراض التي تنشأ من ضعف اختيار سلبية أو إيجابية، على التوالي. الأحداث الجزيئية التي تنظم اختيار الغدة الصعترية، ومع ذلك، غير مفهومة. في المختبر النهج مثل reaggregate الثقافات الجهاز الغدة الصعترية (RTOC) 6، وقد ثبت أن تكون مفيدة لتحليل الأحداث الأساسية المرتبطة اختيار الغدة الصعترية، لكنه يفشل في ألخص تماما ديناميكية مستمرة في أحداث الجسم الحي. ونتيجة لذلك، تم إنشاء هذا النهج القائم على زرع الغدة الصعترية إلى أفضل الأحداث الدراسة اختيار خلية توتية في الجسم الحي 7 </sتصل&gt;. يصف هذا البروتوكول زرع التوتة من الفئران المانحة حديثي الولادة وتعليم الكبار في الفئران المتلقي SCID العوز المناعي. تسمح هذه التقنية على دراسة الآليات التي تنظم اختيار الغدة الصعترية الإيجابية والسلبية، وكذلك انتاج الغدة الصعترية من مختلف مجموعات فرعية الخلايا T أثناء تطور الجنين. وفي الآونة الأخيرة، وقد استخدم هذا النهج لإثبات أن كفاءة اختيار الغدة الصعترية يقتصر في وقت مبكر بعد الولادة لدى الفئران مما يؤدي إلى زيادة نمو الخلايا T autoreactive، وانخفاض الخلايا التائية ذخيرة محددة لمستضدات الخارجية 7.

<table><tbody><tr><td>Ethanol&amp;nbsp;</td><td>Decon Laboratories</td><td>2705HC</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>GIBCO</td><td>14190-144</td><td>pH 7.4</td></tr><tr><td>Betadine Solution</td><td>Purdue Products</td><td>67618-150-17</td><td></td></tr><tr><td>18 gauge needle</td><td>BD</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>Sutures (1.0 metric)</td><td>Ethicon</td><td>J493G</td><td>18&quot; (45cm)</td></tr><tr><td>AUTOCLIP Wound Clips (9mm)</td><td>Clay Adams&amp;reg; Brand</td><td>427631</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-20</td><td>Sterile, disposable</td></tr><tr><td>Mouse anti-CD3 Ab</td><td>eBioscience</td><td>11-0031-85</td><td>Clone: 1452C11</td></tr><tr><td>Mouse anti-CD4 Ab</td><td>eBioscience</td><td>48-0042-82</td><td>Clone: RM4-5</td></tr><tr><td>Mouse anti-CD8 Ab</td><td>eBioscience</td><td>25-0081-82</td><td>Clone: 53-6.7</td></tr><tr><td>Lancet</td><td>Medipoint</td><td>Goldenrod 4mm</td><td></td></tr><tr><td>Pacific Orange Succinimidyl Ester, Triethylammonium Salt</td><td>Invitrogen</td><td>P30253</td><td></td></tr><tr><td>96-well round botton polypropylene plates</td><td>Corning</td><td>3365</td><td></td></tr><tr><td>1.2 ml polypropylene cluster tubes</td><td>Corning</td><td>4401</td><td></td></tr><tr><td>5 ml polypropylene round-bottom tubes</td><td>BD</td><td>352002</td><td></td></tr><tr><td>40uM Nylon Cell Strainer</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde Solution, EM Grade</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>15710</td><td>Hazardous</td></tr><tr><td>Puralube Optical Ointment</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0138063</td><td></td></tr><tr><td>Lympholyte</td><td>Cedarlane</td><td>CL5030</td><td></td></tr><tr><td>60 mm cell culture dish</td><td>Corning</td><td>430196</td><td>60 mm x 15 mm, Sterile</td></tr></tbody></table>

isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts.

ولا تزال الآليات التي تنظم فعالية اختيار الغدة الصعترية سيئة التحديد. الطريقة المعروضة هنا يسمح في التحليلات المجراة من تطوير واختيار خلايا T معينة للدفاع عن النفس والمستضدات الأجنبية. النهج ينطوي زرع الطعوم الغدة الصعترية المستمدة من مختلف الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين المستفيدين في SCID العوز المناعي. خلال فترة قصيرة نسبيا من الزمن وأعيد المستلمين تماما مع خلايا T المستمدة من الكسب غير المشروع الغدة الصعترية مزروع. بذر thymocytes فقط الغدة الصعترية في وقت العزلة الخضوع اختيار وتتطور إلى خلايا T الناضجة. على هذا النحو، يمكن تقييم التغيرات في طبيعة وخصوصية الخلايا T المغروسة بوصفها وظيفة من الأحداث الغدة الصعترية التي تعتمد على العمر. على الرغم من الخبرة الفنية اللازمة لزرع الغدة الصعترية ناجحة، وهذه الطريقة توفر استراتيجية فريدة من نوعها للدراسة في الجسم الحي مجموعة واسعة من الأمراض التي ترجع إلى نتيجة أو وظيفة و / أو homeostas الغدة الصعترية الشاذةهو.

نجاح هذا الإجراء يعتمد على الحد الأدنى من الصدمة الجراحية فضلا عن دقة تحديد المواقع من الكسب غير المشروع تحت كبسولة الكلى. يجب أن تقطع الكسب غير المشروع الغدة الصعترية لضمان الحجم أقسام الغدة الصعترية لزرع احقا بشكل مناسب كما هو مبين في الشكل 1. وبعد التخطيط?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts. at JoVE.com

Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.

This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo.

العزل وزرع مختلفة المسنين الفئران التوتة الطعوم.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and ...

isolation-and-transplantation-of-different-aged-murine-thymic-grafts

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.7K Views.  University of North Carolina at Chapel Hill. This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo. 

Video: Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T cell replacement in lymphopenic patients. We studied thymic settling progenitors from murine embryonic day 13 and 18 thymi by two complementary in vitro and in vivo techniques, both based on the &#8220;hanging drop&#8221; method. This method allowed colonizing irradiated fetal thymic lobes with E13 and/or E18 thymic progenitors distinguished by CD45 allotypic markers and thus following their progeny. Colonization with mixed populations allows analyzing cell autonomous differences in biologic properties of the progenitors while colonization with either population removes possible competitive selective pressures. The colonized thymic lobes can also be grafted in immunodeficient male recipient mice allowing the analysis of the mature T cell progeny in vivo, such as population dynamics of the peripheral immune system and colonization of different tissues and organs. Fetal thymic organ cultures revealed that E13 progenitors developed rapidly into all mature CD3+ cells and gave rise to the canonical &#947;&#948; T cell subset, known as dendritic epithelial T cells. In comparison, E18 progenitors have a delayed differentiation and were unable to generate dendritic epithelial T cells. The monitoring of peripheral blood of thymus-grafted CD3-/- mice further showed that E18 thymic settling progenitors generate, with time, larger numbers of mature T cells than their E13 counterparts, a feature that could not be appreciated in the short term fetal thymic organ cultures.

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

توصيف التوتة تسوية الأسلاف في جنين الفأر عن طريق<em&gt; في فيفو</em&gt; و<em&gt; في المختبر</em&gt; فحوصات

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Developmental Biology

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

Intravital تصوير الغدة الصعترية باستخدام الماوس 2 فوتون الميكروسكوب

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

تحريض الطعم ضد المضيف المرض و<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; مراقبة الخلايا T باستخدام نموذج MHC المطابقة الفئران

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and host T cells, to easily monitor the graft, and to adapt the system in order to answer different immunological questions. Medawar and colleagues established allogeneic tail-skin transplantation in mice in 1955. Since then, the skin transplantation model has been continuously modified and adapted to answer specific questions. The use of tail-skin renders this model easy to score for graft rejection, requires neither extensive preparation nor deep anesthesia, is applicable to animals of all genetic background, discourages ischemic necrosis, and permits chemical and biological intervention. 
In general, both CD4+ and CD8+ allogeneic T cells are responsible for the rejection of allografts since they recognize mismatched major histocompatibility antigens from different mouse strains. Several models have been described for activating allogeneic T cells in skin-transplanted mice. The identification of major histocompatibility complex (MHC) class I and II molecules in different mouse strains including C57BL/6 mice was an important step toward understanding and studying T cell-mediated alloresponses. In the tail-skin transplantation model described here, a three-point mutation (I-Abm12) in the antigen-presenting groove of the MHC-class II (I-Ab) molecule is sufficient to induce strong allogeneic CD4+ T cell activation in C57BL/6 mice. Skin grafts from I-Abm12 mice on C57BL/6 mice are rejected within 12-15 days, while syngeneic grafts are accepted for up to 100 days. The absence of T cells (CD3-/- and Rag2-/- mice) allows skin graft acceptance up to 100 days, which can be overcome by transferring 2 x 104 wild type or transgenic T cells. Adoptively transferred T cells proliferate and produce IFN-&#947; in I-Abm12-transplanted Rag2-/- mice.

Tail-skin transplantation is a powerful model for studying T cell-dependent rejection and tolerance induction during allogeneic immune responses in mice. The advantages of this protocol are minor invasive surgery, and ease of monitoring with no need to sacrifice the recipient mouse.

زرع الجلد الذيل لدراسة خيفي CD4 T الردود الخليوي في الفئران

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple stages of T cell development: T cell commitment, positive selection and negative selection. However, the function of TECs in the thymus remains incompletely understood. In the article, we provide a method to isolate TEC subsets from fresh mouse thymus using a combination of mechanical disruption and enzymatic digestion. The method allows thymic stromal cells and thymocytes to be efficiently released from cell-cell and cell-extracellular matrix connections and to form a single-cell suspension. Using the isolated cells, multiparameter flow cytometry can be applied to identification and characterization of TECs and dendritic cells. Because TECs are a rare cell population in the thymus, we also describe an effective way to enrich and purify TECs by depleting thymocytes, the most abundant cell type in the thymus. Following the enrichment, cell sorting time can be decreased so that loss of cell viability can be minimized during purification of TECs. Purified cells are suitable for various downstream analyses like Real Time-PCR, Western blot and gene expression profiling. The protocol will promote research of TEC function and as well as the development of in vitro T cell reconstitution.

Here we describe an efficient method for isolation, identification, and purification of mouse thymic epithelial cells (TECs). The protocol can be utilized for studies of thymus function for normal T cell development, thymus dysfunction, and T cell reconstitution.

العزلة، تحديد الهوية، وتنقية خلايا الفئران التوتة طلائي

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Murine Full-thickness Skin Transplantation

Murine full-thickness skin transplantation is a well-established in vivo model to study alloimmune response and graft rejection. Despite its limited application to humans, skin transplantation in mice has been widely employed for transplantation research. The procedure is easy to learn and perform, and it does not require delicate microsurgical techniques nor extensive training. Moreover, graft rejection in this model occurs in a very reproducible immunological reaction and is easily monitored by direct inspection and palpation. In addition, secondary skin transplantation with donor-matched or third-party skin grafts can be performed on more complex transplant models as an alternative and uncomplicated method to assess donor-specific tolerance. The complications are low and are in general limited to anesthesia overdose or respiratory distress after the procedure. Graft failure, on the other hand, occurs commonly as a result of poor preparation of the graft, incorrect positioning in the graft bed, or inappropriate placement of the bandage. In this article, we present a protocol for full-thickness skin transplantation in mice and describe the important steps necessary for a successful procedure.

Murine full-thickness skin transplantation is a well-established model to study rejection in an alloimmune setting. Here, we provide a tutorial of each step involved in performing a BALB/c--&#62;C57BL/6 full-thickness skin transplant.

الفئران كامل سماكة الجلد زراعة

Murine full-thickness skin transplantation is a well-established in vivo model to study alloimmune response and graft rejection. Despite its limited ...

A Novel Microsurgical Model for Heterotopic, En Bloc Chest Wall, Thymus, and Heart Transplantation in Mice

Exploration of novel strategies in organ transplantation to prolong allograft survival and minimizing the need for long-term maintenance immunosuppression must be pursued. Employing vascularized bone marrow transplantation and co-transplantation of the thymus have shown promise in this regard in various animal models.1-11 Vascularized bone marrow transplantation allows for the uninterrupted transfer of donor bone marrow cells within the preserved donor microenvironment, and the incorporation of thymus tissue with vascularized bone marrow transplantation has shown to increase T-cell chimerism ultimately playing a supportive role in the induction of immune regulation. The combination of solid organ and vascularized composite allotransplantation can uniquely combine these strategies in the form of a novel transplant model. Murine models serve as an excellent paradigm to explore the mechanisms of acute and chronic rejection, chimerism, and tolerance induction, thus providing the foundation to propagate superior allograft survival strategies for larger animal models and future clinical application. Herein, we developed a novel heterotopic en bloc chest wall, thymus, and heart transplant model in mice using a cervical non-suture cuff technique. The experience in syngeneic and allogeneic transplant settings is described for future broader immunological investigations via an instructional manuscript and video supplement.

To study combined solid organ and vascularized composite allotransplantation, we describe a novel heterotopic en bloc chest wall, thymus, and heart transplant model in mice using a cervical non-suture cuff technique.

A المجهرية نموذج رواية لمنتبذ، جناح كتلة جدار الصدر، الغدة الصعترية، وزرع القلب في الفئران

Exploration of novel strategies in organ transplantation to prolong allograft survival and minimizing the need for long-term maintenance immunosuppression ...

Medicine

Renal Subcapsular Transplantation of 2'-Deoxyguanosine-Treated Murine Embryonic Thymus in Nude Mice

The thymus is an important central immune organ, which plays an essential role in the development and differentiation of T cells. Thymus transplantation is an important method for investigating thymic epithelial cell function and T cells maturation in vivo. Here we will describe the experimental methods used within our laboratory to transplant 2&#8217;-deoxyguanosine (to deplete donor&#8217;s lymphocytes) treated embryonic thymus into the renal capsule of an athymic nude mouse. This method is both simple and efficient and does not require special skills or devices. The results obtained via this simple method showed that transplanted thymus can effectively support the recipient&#8217;s T cells production. Additionally, several key points with regards to the protocol will be further elucidated.

We provide a simple and efficient method to transplant 2&#8217;-deoxyguanosine treated E18.5 thymus into the renal capsule of a nude mouse. This method should aide in the study of both thymic epithelial cells function and T cells maturation.

زرع تحت القبعات الكلوية من الغدة الصعترية الجنينية Murine المعالجة 2'-ديوكسيغوانوسين في الفئران عارية

The thymus is an important central immune organ, which plays an essential role in the development and differentiation of T cells. Thymus transplantation ...

تحسين عزل الخلايا اللحمية من الغدة الصعترية ونخاع العظام

Stromal Cell Isolation From Hematopoietic Organs

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens through which to study previously unresolved heterogeneity at steady state, as well as changes in cell type representation induced by extrinsic stresses or during aging. Here, we present step-wise protocols for the isolation of high-quality stromal cell populations from murine and human thymus, as well as murine bone and bone marrow. Cells isolated through these protocols are suitable for generating high-quality single-cell multiomics datasets. The impacts of sample digestion, hematopoietic lineage depletion, FACS analysis/sorting, and how these factors influence compatibility with single-cell sequencing are discussed here. With examples of FACS profiles indicating successful and inefficient dissociation and downstream stromal cell yields in post-sequencing analysis, recognizable pointers for users are provided. Considering the specific requirements of stromal cells is crucial for acquiring high-quality and reproducible results that can advance knowledge in the field.

تسليط الضوء على المؤلف: تطوير أبحاث المكونة للدم باستخدام عزل الخلايا اللحمية لتسلسل الخلية المفردة

Here we present protocols that enable isolation of stromal cells from murine bone, bone marrow, thymus and human thymic tissue compatible with single-cell multiomics.

عزل الخلايا اللحمية من أعضاء المكونة للدم

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens ...

العزل وزرع مختلفة المسنين الفئران التوتة الطعوم.

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

توصيف التوتة تسوية الأسلاف في جنين الفأر عن طريق

Intravital تصوير الغدة الصعترية باستخدام الماوس 2 فوتون الميكروسكوب

تحريض الطعم ضد المضيف المرض و

زرع الجلد الذيل لدراسة خيفي CD4 T الردود الخليوي في الفئران

العزلة، تحديد الهوية، وتنقية خلايا الفئران التوتة طلائي

الفئران كامل سماكة الجلد زراعة

A المجهرية نموذج رواية لمنتبذ، جناح كتلة جدار الصدر، الغدة الصعترية، وزرع القلب في الفئران

زرع تحت القبعات الكلوية من الغدة الصعترية الجنينية Murine المعالجة 2'-ديوكسيغوانوسين في الفئران عارية

عزل الخلايا اللحمية من أعضاء المكونة للدم

عزل الخلايا اللحمية من أعضاء المكونة للدم