We thank Sue Lindquist, Aaron Gitler, and Martin Duennwald for kindly sharing reagents. Our studies were supported by: an American Heart Association Post-Doctoral Fellowship (M.E.J); NIH Director's New Innovator Award DP2OD002177, NIH grants R21NS067354, R21HD074510, and R01GM099836, a Muscular Dystrophy Association Research Award (MDA277268), Packard Center for ALS Research at Johns Hopkins University, Target ALS, and an Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging Award (J.S.).

1. مكتبة الجيل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لبناء مكتبات Hsp104 باستخدام نطاق محدد عرضة للخطأ PCR، أولا تضخيم مجال الاهتمام مع وجود خطأ DNA عرضة البلمرة 20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية المنتج PCR عن طريق استخراج الهلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء خطوة التمديد megaprimer باستخدام بروتوكول الطفرات موقع الموجه القياسية: الجمع بين 50 نانوغرام قالب البلازميد، 250 نانوغرام megaprimer، 200 ميكرومتر dNTPs، وعالية الدقة البلمرة DNA العازلة في PCR، وتمييع إلى 50 ميكرولتر الحجم الكلي مع PCR الصف المياه 20 . تشغيل برنامج PCR القياسية. ملاحظة: الاشعال المحددة المستخدمة سوف تختلف بناء على منطقة معينة من الجين الذي سيتم تضخيمها. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد PCR، هضم الحمض النووي قالب الوالدين مع 1 ميكرولتر DPN أنا انزيم التقييد لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل مكتبة بواسطة الصعق الكهربائي أو غيرها من الوسائل في ultracompetent E. القولونية وتنقية من قبل miniprep. ملاحظة: الجيل المكتبةيختلف تستند إلى حد كبير على أهداف تجربة معينة. Hsp104 هو بروتين كبير جدا، لذلك هو غير عملي بطريقة عشوائية الجين بأكمله، وهو ما يدفعنا إلى الاستفادة من الخطأ نطاق محدد عرضة PCR. بالإضافة إلى ذلك، فإن هيكل Hsp104 تزال غير مفهومة تماما، مما يجعل من تصميم المكتبات موجها تحدي 21. المكتبات يمكن بناؤها باستخدام نهج موجهة أو عشوائية لالطفرات، مع التقييد الوحيد هو أن القالب البلازميد العمود الفقري يجب أن يحتوي على الجين URA3 للسماح لمدة 5-FOA مكافحة الاختيار على وسائل الإعلام الدكستروز. </li></ol> 2. التحول من مكتبة Hsp104 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دمج الركيزة المصاحبة للمرض في W303aΔ hsp104 الخميرة باستخدام خلات الليثيوم القياسية / PEG التحول بروتوكول 22. حدد المستعمرات واحد وفحص لهم لسمية لعزل سلالة مع سمية عالية للمرض الركيزة 23 المرتبطة بها. ملاحظة: استخدم سلالة وايزولا متكاملةالشركة المصرية للاتصالات مستعمرة واحدة لضمان التعبير على قدم المساواة في جميع الخلايا. استنساخ الركيزة المرض إلى البلازميد السماح دمج الجين تحت أي علامة أخرى من اليوراسيل (نستخدم الحامض الاميني) ومكتبة Hsp104 في البلازميد pAG416GAL (اليوراسيل علامة) 24. للسماح لمدة 5-FOA counterselection، وضمان أن يتم التعبير عن مكتبة من البلازميد مع علامة اليوراسيل. ويمكن أيضا أن تستخدم سلالات الخميرة الأخرى. لاحظنا مماثل النمط الظاهري سمية قمع باستخدام W303a وBY4741 سلالات الخميرة في كل وزن وΔ الخلفيات hsp104 (MEJ وشبيبة، والملاحظات غير منشورة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل مكتبة Hsp104 إلى هذه السلالة باستخدام نفس الليثيوم خلات / PEG التحول بروتوكول 22. توسيع نطاق التحول مناسب للحفاظ على الفضاء تسلسل المكتبة والحفاظ على حجم مكتبة المتوقعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة الخليط التحول إلى noninducing، لوحات منتقاة (مثل SD-صاحب-أورا) باستخدام لوحات كافية لضمان نمو عدد كبير من المستعمرات. استخدام أطباق بتري كبير (150 ملم) للحد من عدد من لوحات الحاجة. يتعافى transformants يسمح باستخدام لوحات كفاءة التحول ليتم تقييمها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل Hsp104 WT والضوابط السلبية ناقلات بالتوازي. </li></ol> 3. فحص لقمع Proteotoxicity <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل المستعمرات من لوحات باستخدام رافينوز تستكمل وسائل الاعلام التسرب (مثل SRaff-صاحب-أورا). استخدام ماصة المصلية وتطبيقها خشبية معقمة لتخفيف المستعمرات من لوحات. نقل يغسل السائل إلى 50 مل أنبوب مخروطي ودوامة تماما لفصل أي كتل من الخلايا. تمييع إلى ثقافة غائم قليلا، OD 600 ~ 0.025. ملاحظة: هنا يخدم رافينوز لتخفيف الخلايا من القمع بوساطة الجلوكوز من الاستقراء، وبالتالي فتيلة الخلايا للبوساطة الحث الجلاكتوز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو ثقافة المخفف بين عشية وضحاها في وسائل الإعلام التسرب رافينوز مع اهتزاز عند 30 درجة مئوية. نمو Hsp104 WT والضوابط ناقلات بالتوازي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في صباح اليوم التالي، لوحة مجموعة من تركيزات على اللبن الفردية (مثل SGal-صاحب-أورا) لوحات (1 ميكرولتر إلى 2 مل تتركز ثقافة في 400 ميكرولتر إجمالي حجم). سوف تصفيح مجموعة واسعة من تركيزات ضمان أن طبق سيكون لها مستعمرات واحدة. التركيز الفعلي المطلوب يعتمد على سمية الركيزة المرض من الاهتمام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيع ناقلات والثقافات Hsp104 WT إلى OD 600 من مكتبة ولوحة أحجام متساوية لمقارنة نمو مكتبة نسبة إلى الضوابط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتقييم اختيار صرامة، لوحة المكتبة على الجلوكوز (قمع) وسائل الاعلام. احتضان لوحات لمدة 2-3 أيام عند 30 درجة مئوية، حتى تظهر مستعمرات (الشكل 2). تقييم المستعمرات الناتجة عنها، ومقارنتها مع الضوابط. ملاحظة: غالبا ما يتم الحصول على كل من المستعمرات الكبيرة والصغيرة، ولكن لا علاقة بين حجم مستعمرة والعملويلاحظ ivity. فحص هذه الضربات المحتملة باستخدام تقنية مكافحة اختيار 5-FOA (الخطوة 4) للحد من ايجابيات كاذبة ترحيلها إلى التسلسل. </li></ol> 4. 5-FOA Counterselection والإكتشاف للقضاء على ايجابيات كاذبة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسحة من المستعمرات واحدة من نسختين على مزدوج واحد وسائل الاعلام التسرب (مثل SD-صاحب-SD-أورا وصاحب لوحات) وتنمو بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية. كرر مع النواقل وHsp104 WT الضوابط. طلي على SD-صاحب قبل 5 FOA يزيد من كفاءة الخطوة 5 FOA عن طريق زيادة احتمال أن الخلايا ستكون قد فقدت البلازميد Hsp104 عندما ومطلي انهم على 5 FOA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحيلولة دون لوحات من الجفاف، والتفاف على لوحات في بارافيلم صاحب أورا-SD-وتخزينها في 4 درجات مئوية أثناء أداء الشاشة 5-FOA. في نهاية المطاف يمكن استخدام هذه اللوحات لتسلسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خط المستعمرات من لوحات لالمستعمرات واحد على لوحات 5 FOA (YPD وسائل الاعلام + 1G / L 5-FOA)، واحتضان لمدة 1-2 أيام في 30 و صاحب SD-# 186؛ C حتى تظهر المستعمرات واحد. هنا، يتم تحويل 5 FOA إلى منتج سام (5 fluorodeoxyuridine) في الخلايا التي تحتوي على الجين URA3. وبالتالي، فإن أي خلايا لا تزال تؤوي البلازميد Hsp104 يموت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خط المستعمرات واحدة من لوحات 5 FOA في نسختين على SD-SD-أورا وصاحب لوحات. بلغت اختبار 3 مستعمرات لكل لزيادة احتمال أن مستعمرة واحدة على الأقل لكل ضرب سيكون قد خسر البلازميد Hsp104. احتضان لمدة 1-2 أيام عند 30 درجة مئوية. المستعمرات التي فقدت البلازميد Hsp104 سوف تنمو على SD-صاحب لوحات ولكن ليس SD-أورا لوحات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زراعة السلالات التي فقدت البلازميدات Hsp104 لاكتشاف المقايسات. زراعة سلالات من التشبع في رافينوز التسرب وسائل الإعلام (على سبيل المثال، صاحب SRaff) في 96 DeepWell 2 مل لوحات بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية مع اهتزاز. تأكد من تضمين سلالات السيطرة 5-FOA المعالجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد لوحات لاكتشاف الفحص. باستخدام ماصة الأقنية، قسامة 200 ميكرولتر رافينوز التسرب وسائل الإعلام (على سبيل المثال، صاحب SRaff) للبئر من 96 لوحة جيدا، حجز الأعمدة 1 و 7 للثقافات أنيق. قسامة 250 ميكرولتر من كل واحد من 16 الثقافات المشبعة في الأعمدة 1 و 7 من لوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متسلسل تمييع الثقافات 5 أضعاف في كل عمود من لوحة، والخلط تماما مع ماصة الأقنية. إزالة 50 ميكرولتر من ثقافة المخفف من أعمدة 6 و 12 لضمان الحجم النهائي من كل بئر 200 ميكرولتر. هذا أمر ضروري لضمان حتى بقع دم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام أداة المكرر 96-الترباس (FROGGER)، بقعة الثقافات في نسختين على SD-صاحب وSGal-صاحب وحات. احتضان لوحات عند 30 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحديد تسلسل السلالات التي تظهر سمية على SGal-صاحب لوحات مماثلة لتلك الضوابط. تجاهل ايجابيات كاذبة سلالات كما أن ليست كما سامة مثل الضوابط. 5-FOA هي أيضا في كثير من الأحيان السامة من تلقاء نفسها، لذلك تجاهل السلالات التي تظهر وجود خلل في النمو SD-صاحب لوحات أو أن المعرض أكبر بكثير من سمية الركيزة المرض وحده ( <stronز&gt; الشكل 3). </li></ol> 5. تسلسل Hsp104 المتغيرات التي كتبها مستعمرة PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كشط ~ 10 ميكرولتر من الخميرة لوحات SD-صاحب-أورا في 3 ميكرولتر 20 ملي هيدروكسيد الصوديوم في أنابيب الشريط PCR وليز الخلايا عن طريق تجميد ذوبان الجليد. وضع أنابيب الشريط في الفريزر -80 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة أو في النيتروجين السائل، ثم احتضان عند 99 درجة مئوية في thermocycler لمدة 10 دقيقة. تخفيف الضغوط على 100 ميكرولتر مع PCR المياه الصف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد ردود الفعل PCR: قالب PCR 5 ميكرولتر 0.5 ميكرولتر من 100 ميكرومتر لكل التمهيدي، 0.5 ميكرولتر dNTPs 10MM، 0.25 البلمرة DNA ميكرولتر العازلة في PCR، وجعل ما يصل إلى 25 ميكرولتر الحجم الكلي مع PCR المياه الصف. تصميم الاشعال لتضخيم المنطقة العشوائية بالإضافة إلى ما يقرب من 100 شركة بريتيش بتروليوم على حد سواء. تقليل حجم المنطقة تضخيمها إلى زيادة احتمالات التضخيم ناجحة. تشغيل برنامج PCR القياسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل العينات بواسطة الاغاروز الكهربائي للهلام لتأكيد التضخيم للمنتج PCR من الاحجام المناسبةه. تكرار PCR إذا أي منتج موجود. ملاحظة: فشل PCR هو عادة بسبب الكثير من الخميرة المستخدمة في الخطوة 5.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير عينات للتسلسل الحمض النووي. إزالة الاشعال PCR إما عن طريق PCR تنقية أو استخدام منتج PCR تنظيف كاشف مثل نوكلياز خارجية الأول والروبيان إنزيم الفوسفاتيز القلوية (ExoSAP-IT) للحط من الحمض النووي واحد الذين تقطعت بهم السبل. هذا كاشف يحط إنزيمي الاشعال الفردية وdNTPs، والسماح لأعلى إنتاجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسلسل المنتجات PCR. تأكد من تحليل دقيق الاستشرابية تسلسل للطفرات. يمكن ملاحظة تحولات على شكل مزيج من اثنين من النيوكليوتيدات في موقع معين (الشكل 4)، والخميرة غالبا ما تؤوي البلازميدات متعددة. </li></ol>

<ol>
	<li>Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+TDP-43+proteinopathy+model:+Exploring+the+molecular+determinants+of+TDP-43+aggregation+and+cellular+toxicity.">A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105 (17), 6439-6444 (2008).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Determinants+and+Genetic+Modifiers+of+Aggregation+and+Toxicity+for+the+ALS+Disease+Protein+FUS/TLS.">Molecular Determinants and Genetic Modifiers of Aggregation and Toxicity for the ALS Disease Protein FUS/TLS.</a> PLoS Biol. 9 (4), (2011).</li><li>Outeiro, T. F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+Cells+Provide+Insight+into+Alpha-Synuclein+Biology+and+Pathobiology.">Yeast Cells Provide Insight into Alpha-Synuclein Biology and Pathobiology.</a> Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).</li><li>Forman, M. S., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegenerative+diseases:+a+decade+of+discoveries+paves+the+way+for+therapeutic+breakthroughs.">Neurodegenerative diseases: a decade of discoveries paves the way for therapeutic breakthroughs.</a> Nat Med. 10 (10), 1055-1063 (2004).</li><li>Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress,+aging,+and+neurodegenerative+disease.">Stress, aging, and neurodegenerative disease.</a> N Engl J Med. 355 (21), 2254-2255 (2006).</li><li>Elden, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ataxin-2+intermediate-length+polyglutamine+expansions+are+associated+with+increased+risk+for+ALS.">Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS.</a> Nature. 466 (7310), 1069-1075 (2010).</li><li>Cooper, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+blocks+ER-Golgi+traffic+and+Rab1+rescues+neuron+loss+in+Parkinson's+models.">Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models.</a> Science. 313 (5785), 324-328 (2006).</li><li>Gitler, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+is+part+of+a+diverse+and+highly+conserved+interaction+network+that+includes+PARK9+and+manganese+toxicity.">Alpha-synuclein is part of a diverse and highly conserved interaction network that includes PARK9 and manganese toxicity.</a> Nature genetics. 41 (3), 308-315 (2009).</li><li>Su, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+from+an+unbiased+chemical+screen+reverse+both+ER-to-Golgi+trafficking+defects+and+mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson's+disease+models.">Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models.</a> Disease models &amp; mechanisms. (3-4), 194-208 (2010).</li><li>Tardiff, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+reveal+a+'druggable'+Rsp5/Nedd4+network+that+ameliorates+alpha-synuclein+toxicity+in+neurons.">Yeast reveal a 'druggable' Rsp5/Nedd4 network that ameliorates alpha-synuclein toxicity in neurons.</a> Science. 342 (6161), 979-983 (2013).</li><li>Tardiff, D. F., Tucci, M. L., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+8-hydroxyquinolines+protect+models+of+TDP-43+protein,+alpha-synuclein,+and+polyglutamine+proteotoxicity+through+distinct+mechanisms.">Different 8-hydroxyquinolines protect models of TDP-43 protein, alpha-synuclein, and polyglutamine proteotoxicity through distinct mechanisms.</a> The Journal of biological chemistry. 287 (6), 4107-4120 (2012).</li><li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+modulation+of+eIF2alpha+phosphorylation+rescues+TDP-43+toxicity+in+amyotrophic+lateral+sclerosis+disease+models.">Therapeutic modulation of eIF2alpha phosphorylation rescues TDP-43 toxicity in amyotrophic lateral sclerosis disease models.</a> Nature. 46 (2), 152-160 (2014).</li><li>Ju, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+model+of+FUS/TLS-dependent+cytotoxicity.">A yeast model of FUS/TLS-dependent cytotoxicity.</a> PLoS Biol. 9 (4), (2011).</li><li>Shorter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp104:+a+weapon+to+combat+diverse+neurodegenerative+disorders.">Hsp104: a weapon to combat diverse neurodegenerative disorders.</a> Neurosignals. 16 (1), 63-74 (2008).</li><li>Vashist, S., Cushman, M., Shorter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+Hsp104+to+protein-misfolding+disorders.">Applying Hsp104 to protein-misfolding disorders.</a> Biochem Cell Biol. 88 (1), 1-13 (2010).</li><li>DeSantis, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Operational+Plasticity+Enables+Hsp104+to+Disaggregate+Diverse+Amyloid+and+Nonamyloid+Clients.">Operational Plasticity Enables Hsp104 to Disaggregate Diverse Amyloid and Nonamyloid Clients.</a> Cell. 151 (4), 778-793 (2012).</li><li>Jackrel, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentiated+Hsp104+Variants+Antagonize+Diverse+Proteotoxic+Misfolding+Events.">Potentiated Hsp104 Variants Antagonize Diverse Proteotoxic Misfolding Events.</a> Cell. 156 (1-2), 170-182 (2014).</li><li>Wittrup, K. D., Verdine, G. L., Wittrup, K. D., Verdine, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 503, 13-14 (2012).</li><li>Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 154, 164-175 (1987).</li><li>Miyazaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+Random+Mutagenesis+Libraries+by+Megaprimer+PCR+of+Whole+Plasmid+(MEGAWHOP).+Directed+Evolution+Library+Creation:+Methods+in+Molecular+Biology.">Creating Random Mutagenesis Libraries by Megaprimer PCR of Whole Plasmid (MEGAWHOP). Directed Evolution Library Creation: Methods in Molecular Biology.</a> eds FrancesH Arnold &amp; George Georgiou. 231, 23-28 (2003).</li><li>Saibil, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone+machines+for+protein+folding,+unfolding+and+disaggregation.">Chaperone machines for protein folding, unfolding and disaggregation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (10), 630-642 (2013).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+yeast+transformation+using+the+LiAc/SS+carrier+DNA/PEG+method.">High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).</li><li>Armakola, M., Hart, M. P., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+toxicity+in+yeast.">TDP-43 toxicity in yeast.</a> Methods. 53 (3), 238-245 (2011).</li><li>Alberti, S., Gitler, A. D., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+suite+of+Gateway&#174;+cloning+vectors+for+high-throughput+genetic+analysis+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A suite of Gateway&#174; cloning vectors for high-throughput genetic analysis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 24 (10), 913-919 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

هنا نقدم نهجنا لعزل potentiated Hsp104 المتغيرات التي تقمع سمية ركائز المرتبط المرض باستخدام نماذج الخميرة proteinopathy. باستخدام هذا النهج، مكتبات كبيرة من المتغيرات يمكن عرضه في إنتاجية عالية، والحد الوحيد هو في عدد من المتغيرات التي تمر على الشاشة الثانوية 5-FOA. قبل تنفيذ هذه ا?...

وقد تم تطوير نماذج proteinopathy الخميرة للاضطرابات misfolding البروتين بما في ذلك التصلب الضموري الجانبي (ALS) ومرض باركنسون (PD) 1-3. التعبير عن البروتينات TDP-43 والفتح الرباطي، الذي misfold في مرضى ALS، هي سامة وmislocalize لتشكيل المجاميع حشوية في الخميرة 1،2. وبالمثل، فإن التعبير عن α-synuclein (α-SYN)، والذي تورط في PD، غير سامة وmislocalizes لتشكيل المجاميع حشوية في الخميرة 3. هذه الميزات ألخص الظواهر في المرضى الذين يعانون من هذه الاضطرابات 4،5. وبالتالي، نماذج الخميرة توفر منبرا مفيدا لفحص للبروتينات أو الجزيئات الصغيرة التي منع أو عكس هذه الظواهر 2،6-13. ونحن مهتمون في تطوير بروتينات قادرة على عكس التجميع وسمية بسبب TDP-43، الفتح، وα-SYN. ونحن نركز على Hsp104، وهو AAA + البروتين من الخميرة قادرة فريد من تجزئة البروتينات سواء الابالمجاميع غير متبلور أوم واميلويد في الخميرة، إلا أنه لا يوجد لديه نديد البشري 14،15. يتم ضبطها بدقة Hsp104 إلى تفصيل البريونات الخميرة الذاتية وليس لديها سوى قدرة محدودة على تفصيل ركائز المتورطين في أمراض الاعصاب الإنسان، وهو ما لم يصادف عادة 16،17. وبالتالي، فإننا نهدف إلى مهندس إصدارات محسنة من Hsp104 التي تكون قادرة على تفصيل هذه ركائز الإنسان بشكل فعال. للقيام بذلك، ونحن بناء مكتبات كبيرة من Hsp104 المتغيرات باستخدام عرضة للخطأ PCR. هذه المكتبات يمكن عرضه باستخدام نماذج الخميرة proteinopathy 17. اعتمدنا نهجا المستهدفة المجال إلى بناء وفحص والمكتبات، كما Hsp104 هي كبيرة جدا 17. ركزنا في البداية على المجال المتوسط ​​(MD) من Hsp104 17، على الرغم من نهج مماثلة يمكن استخدامها لفحص المجالات الأخرى. هذه النماذج تمكين الكشف عن النشاط disaggregase مباشرة، بدلا من تقنيات بديلة مثل سطح الشاشة، والتي هي بقيةricted لاستخدامها لمراقبة ملزمة 18. ويستند بروتوكول لدينا على خطوتين الفرز (الشكل 1). أولا، يتم اختيار المتغيرات Hsp104 التي تقمع سمية الركيزة المرض في الخميرة. للقيام بذلك، وHsp104 المتغيرات وcotransformed من الأمراض المرتبطة الركيزة في Δ hsp104 الخميرة. نحن توظيف Δ hsp104 الخميرة لاستكشاف الفضاء تسلسل Hsp104 في غياب البرية من نوع (WT) Hsp104 17. الأهم من ذلك، حذف Hsp104 لا يؤثر α-SYN، الفتح، أو TDP-43 سمية في الخميرة، والتعبير عن Hsp104 WT يوفر الحد الأدنى الإنقاذ 1،13،17. ثم يتم مطلي الخميرة على حمل وسائل الإعلام للحث على التعبير عن كل من البروتينات. الخميرة إيواء Hsp104 المتغيرات التي تقمع سمية النمو الركيزة تتداول المرتبط المرض للمستعمرة. ويتم اختيار هذه المتغيرات لمزيد من التحليل، في حين أن المستعمرات الحفاظ على المتغيرات التي لا قمع سمية يموت. ومع ذلك،ايجابيات كاذبة هي مشكلة كبيرة في هذه الشاشة. التعبير عن TDP-43، الفتح، وα-SYN شديدة السمية، مما يخلق ضغط انتقائي قوي لظهور المكثفات الوراثية عفوية سمية لا علاقة لها البديل Hsp104 يجري التعبير عنها. وبالتالي، فإننا قد استخدمت شاشة الثانوية التي هي أيضا إنتاجية عالية نسبيا للقضاء على هذه المكثفات سمية غير محددة 17. في هذه الشاشة الثانوية، ويتم التعامل مع الخميرة اختيار 5-Fluorootic حمض (5 FOA) لمواجهة حدد لالبلازميد Hsp104 19. ثم يتم تقييم السلالات لالركيزة (TDP-43، الفتح، أو α-SYN) سمية عن طريق اكتشاف فحص للتأكد من أن يتم استعادة سمية الركيزة بعد فقدان البلازميد Hsp104. وبالتالي، الخميرة التي يتم استعادة سمية في هذه شاشة عرض ثانوية يفترض أصلا سمية قمع بسبب وجود البديل Hsp104. وتتم تسمية هذه الخميرة باسم &#39;يضرب&#39; ويجب أن يكون البلازميد ثم Hsp104تعافى والتسلسل لتحديد الطفرات في الجين Hsp104 17 (الشكل 1). وينبغي بعد ذلك إعادة تأكيد أي إصابات عن طريق بناء الطفرة بشكل مستقل باستخدام الطفرات موقع الموجه ثم إعادة الاختبار لقمع سمية. التطبيقات المحتملة لهذا البروتوكول واسعة. باستخدام هذه الأساليب، يمكن فرزهم المكتبات من أي نوع من البروتين للمتغيرات التي تقمع سمية من أي بروتين الركيزة التي هي سامة في الخميرة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="766">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:320px;">Table of Specific Materials/Equipment</td>
			<td style="width:227px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td style="width:87px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GeneMorphII EZClone Domain Mutagenesis Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">150mm Petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5-Fluorootic Acid</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>f10501-5.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96-DeepWell 2mL Plates</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 502.302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96 bold replicator tool</td>
			<td>V&#38;P Scientific</td>
			<td>vp-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ExoSAP-IT</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>78200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating potentiated hsp104 variants using yeast proteinopathy models

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic lateral sclerosis, and &#945;-synuclein, implicated in Parkinson&#8217;s disease, are toxic and form cytoplasmic aggregates in yeast. These features recapitulate protein pathologies observed in patients with these disorders. Thus, yeast are an ideal platform for isolating toxicity suppressors from libraries of protein variants. We are interested in applying protein disaggregases to eliminate misfolded toxic protein conformers. Specifically, we are engineering Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast that is uniquely capable of solubilizing both disordered aggregates and amyloid and returning the proteins to their native conformations. While Hsp104 is highly conserved in eukaryotes and eubacteria, it has no known metazoan homologue. Hsp104 has only limited ability to eliminate disordered aggregates and amyloid fibers implicated in human disease. Thus, we aim to engineer Hsp104 variants to reverse the protein misfolding implicated in neurodegenerative disorders. We have developed methods to screen large libraries of Hsp104 variants for suppression of proteotoxicity in yeast. As yeast are prone to spontaneous nonspecific suppression of toxicity, a two-step screening process has been developed to eliminate false positives. Using these methods, we have identified a series of potentiated Hsp104 variants that potently suppress the toxicity and aggregation of TDP-43, FUS, and &#945;-synuclein. Here, we describe this optimized protocol, which could be adapted to screen libraries constructed using any protein backbone for suppression of toxicity of any protein that is toxic in yeast.

لقد شيدت مكتبة من المتغيرات العشوائية Hsp104 في المجال المتوسط ​​وذلك لفحص قمع TDP-43 سمية. تحولت المكتبة ومطلي على الجلوكوز والجلاكتوز لوحات (الشكل 2) لتقييم صرامة من الشاشة. وقد تم اختيار المستعمرات واحد وتم اختيار السلالات مضادة باستخدام 5-FOA للقضاء على البلاز?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models at JoVE.com

Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models

Yeast proteinopathy models are valuable tools to assess the toxicity and aggregation of proteins implicated in disease. Here, we present methods for screening Hsp104 variant libraries for toxicity suppressors. This protocol could be adapted to screen any protein library for toxicity suppressors of any protein that is toxic in yeast.

عزل Potentiated Hsp104 المتغيرات عن طريق الخميرة Proteinopathy نماذج

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic ...

isolating-potentiated-hsp104-variants-using-yeast-proteinopathy-models

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

8.1K Views.  Perelman School of Medicine at the University of Pennsylvania. Yeast proteinopathy models are valuable tools to assess the toxicity and aggregation of proteins implicated in disease. Here, we present methods for screening Hsp104 variant libraries for toxicity suppressors. This protocol could be adapted to screen any protein library for toxicity suppressors of any protein that is toxic in yeast.

Video: Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models

A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and very simple lipidome, is a valuable model for studying biological functions of various lipid species in multicellular eukaryotes2,3,5. S. cerevisiae has 10 major classes of lipids with chain lengths mainly of 16 or 18 carbon atoms and either zero or one degree of unsaturation6,7. Existing methods for lipid identification and quantification - such as high performance liquid chromatography, thin-layer chromatography, fluorescence microscopy, and gas chromatography followed by MS - are well established but have low sensitivity, insufficiently separate various molecular forms of lipids, require lipid derivitization prior to analysis, or can be quite time consuming. Here we present a detailed description of our experimental approach to solve these inherent limitations by using survey-scan ESI/MS for the identification and quantification of the entire complement of lipids in yeast cells. The described method does not require chromatographic separation of complex lipid mixtures recovered from yeast cells, thereby greatly accelerating the process of data acquisition. This method enables lipid identification and quantification at the concentrations as low as g/ml and has been successfully applied to assessing lipidomes of whole yeast cells and their purified organelles. Lipids extraction from whole yeast cells for using this method of lipid analysis takes two to three hours. It takes only five to ten minutes to run each sample of extracted and dried lipids on a Q-TOF mass spectrometer equipped with a nano-electrospray source.

We describe a new quantitative lipidomics method for identifying numerous lipid species in yeast using survey-scan electrospray ionization mass spectrometry (ESI/MS). This method exceeds currently available methods for lipid identification and quantification in the ability to resolve various molecular forms of lipids, sensitivity, and speed.

والتقييم الكمي لاستخدام الطيف Lipidome الخميرة Electrospray قداس التأين

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast ...

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers. Genetic studies in mammalian systems have been limited due to the lack of readily available tools including defined mutant genetic cell lines, regulatory expression systems, and appropriate selectable markers. To circumvent these difficulties, model genetic systems in lower eukaryotes have become an attractive choice for the study of functionally conserved DNA repair proteins and pathways. We have developed a model yeast system to study the poorly defined genetic functions of the Werner syndrome helicase-nuclease (WRN) in nucleic acid metabolism. Cellular phenotypes associated with defined genetic mutant backgrounds can be investigated to clarify the cellular and molecular functions of WRN through its catalytic activities and protein interactions. The human WRN gene and associated variants, cloned into DNA plasmids for expression in yeast, can be placed under the control of a regulatory plasmid element. The expression construct can then be transformed into the appropriate yeast mutant background, and genetic function assayed by a variety of methodologies. Using this approach, we determined that WRN, like its related RecQ family members BLM and Sgs1, operates in a Top3-dependent pathway that is likely to be important for genomic stability. This is described in our recent publication [1] at <a href="http://www.impactaging.com">www.impactaging.com</a>. Detailed methods of specific assays for genetic complementation studies in yeast are provided in this paper.

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System

Genetic studies in yeast can be employed to investigate the molecular and cellular functions of human genes in cellular DNA metabolism. Methods are described for the genetic characterization of the human WRN gene product defective in the premature aging disorder Werner syndrome in functionally conserved pathways using yeast as a tractable model system.

الدراسات الجينية البشرية البروتينات إصلاح الحمض النووي باستخدام خميرة كنظام النموذجي

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Yeast Colony Embedding Method

Patterning of different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms also display patterns of cell types. For example, in the yeast S. cerevisiae, sporulated cells and pseudohyphal cells are not uniformly distributed in colonies. The functional importance of patterning and the molecular mechanisms that underlie these patterns are still poorly understood.
One challenge with respect to investigating patterns of cell types in fungal colonies is that unlike metazoan tissue, cells in colonies are relatively weakly attached to one another. In particular, fungal colonies do not contain the same extensive level of extracellular matrix found in most tissues . Here we report on a method for embedding and sectioning yeast colonies that reveals the interior patterns of cell types in these colonies. The method can be used to prepare thick sections (0.5 &mu;) useful for light microscopy and thin sections (0.1 &mu;) suitable for transmission electron microscopy. Asci and pseudohyphal cells can easily be distinguished from ovoid yeast cells by light microscopy , while the interior structure of these cells can be visualized by EM.
The method is based on surrounding colonies with agar, infiltrating them with Spurr's medium, and then sectioning. Colonies with a diameter in the range of 1-2 mm are suitable for this protocol. In addition to visualizing the interior of colonies, the method allows visualization of the region of the colony that invades the underlying agar.

A method for embedding yeast colonies allowing sectioning for light and electron microscopy. This protocol allows determination of the distribution of sporulated cells and pseudohyphal cells within colonies providing a new tool toward understanding the organization of cell types within a fungal community.

أسلوب الخميرة مستعمرة التضمين

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon

For both scientific and animal welfare reasons, training in basic surgical concepts and techniques should be undertaken before ever seeking to perform surgery on a rodent. Students, post-doctoral scholars, and others interested in performing surgery on rodents as part of a research protocol may not have had formal surgical training as part of their required coursework. Surgery itself is a technical skill, and one that will improve with practice. The principles of aseptic technique, however, often remain unexplained or untaught. For most new surgeons, this vital information is presented in piecemeal fashion or learned on the job, neither of which is ideal. It may also make learning how to perform a particular surgery difficult, as the new surgeon is learning both a surgical technique and the principles of asepsis at the same time. This article summarizes and makes recommendations for basic surgical skills and techniques necessary for successful rodent surgery. This article is designed to supplement hands-on training by the user's institution.

Before attempting surgery, a new surgeon should have training in basic surgical techniques and concepts. This article will present basic surgical considerations with an emphasis on rodents.

مبادئ الجراحة القوارض لجراحة جديدة

For both scientific and animal welfare reasons, training in basic surgical concepts and techniques should be undertaken before ever seeking to perform ...

Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats

Being able to safely and effectively restrain mice and rats is an important part of conducting research. Working confidently and humanely with mice and rats requires a basic competency in handling and restraint methods. This article will present the basic principles required to safely handle animals. One-handed, two-handed, and restraint with specially designed restraint objects will be illustrated. Often, another part of the research or testing use of animals is the effective administration of compounds to mice and rats. Although there are a large number of possible administration routes (limited only by the size and organs of the animal), most are not used regularly in research. This video will illustrate several of the more common routes, including intravenous, intramuscular, subcutaneous, and oral gavage. The goal of this article is to expose a viewer unfamiliar with these techniques to basic restraint and substance administration routes. This video does not replace required hands-on training at your facility, but is meant to augment and supplement that training.

Working safely and humanely with research rodents requires a core competency in handling and restraint methods. This article will present the basic principles required to safely handle and effectively administer compounds to mice and rats.

دليل ضبط النفس وطرق الإدارة المشتركة في مجمع الفئران والجرذان

Being able to safely and effectively restrain mice and rats is an important part of conducting research.  Working confidently and humanely with mice and ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

شاشة عالية الإنتاجية الخميرة Overexpression البلازميد

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key selective advantages. First, renaturation of disordered aggregates by Hsp104 empowers yeast survival after various protein-misfolding stresses, including heat shock3,5,11,12. Second, remodeling of cross-beta amyloid fibrils by Hsp104 enables yeast to exploit myriad prions (infectious amyloids) as a reservoir of beneficial and heritable phenotypic variation13-22. Remarkably, Hsp104 directly remodels preamyloid oligomers and amyloid fibrils, including those comprised of the yeast prion proteins Sup35 and Ure223-30. This amyloid-remodeling functionality is a specialized facet of yeast Hsp104. The E. coli orthologue, ClpB, fails to remodel preamyloid oligomers or amyloid fibrils26,31,32.
Hsp104 orthologues are found in all kingdoms of life except, perplexingly, animals. Indeed, whether animal cells possess any enzymatic system that couples protein disaggregation to renaturation (rather than degradation) remains unknown33-35. Thus, we and others have proposed that Hsp104 might be developed as a therapeutic agent for various neurodegenerative diseases connected with the misfolding of specific proteins into toxic preamyloid oligomers and amyloid fibrils4,7,23,36-38. There are no treatments that directly target the aggregated species associated with these diseases. Yet, Hsp104 dissolves toxic oligomers and amyloid fibrils composed of alpha-synuclein, which are connected with Parkinson's Disease23 as well as amyloid forms of PrP39. Importantly, Hsp104 reduces protein aggregation and ameliorates neurodegeneration in rodent models of Parkinson's Disease23 and Huntington's disease38. Ideally, to optimize therapy and minimize side effects, Hsp104 would be engineered and potentiated to selectively remodel specific aggregates central to the disease in question4,7. However, the limited structural and mechanistic understanding of how Hsp104 disaggregates such a diverse repertoire of aggregated structures and unrelated proteins frustrates these endeavors30,40-42.
To understand the structure and mechanism of Hsp104, it is essential to study the pure protein and reconstitute its disaggregase activity with minimal components. Hsp104 is a 102kDa protein with a pI of ~5.3, which hexamerizes in the presence of ADP or ATP, or at high protein concentrations in the absence of nucleotide43-46. Here, we describe an optimized protocol for the purification of highly active, stable Hsp104 from E. coli. The use of E. coli allows simplified large-scale production and our method can be performed quickly and reliably for numerous Hsp104 variants. Our protocol increases Hsp104 purity and simplifies His6-tag removal compared to a previous purification method from E. coli47. Moreover, our protocol is more facile and convenient than two more recent protocols26,48.

Here, we describe a protocol for the purification of highly active Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation. This scheme exploits a His6-tagged construct for affinity purification from E. coli followed by anion-exchange chromatography, His6-tag removal with TEV protease, and size-exclusion chromatography.

تنقية Hsp104 ، وهو بروتين Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies. Many of these valuable animals exist only as live animals, with no backup plan in case of emergency. Cryopreservation of embryos can provide this backup, but is costly, can be a lengthy procedure, and generally requires a large number of animals for success. Since the discovery that mouse sperm can be successfully cryopreserved with a basic cryoprotective agent (CPA) consisting of 18&#37; raffinose and 3&#37; skim milk, sperm cryopreservation has become an acceptable and cost-effective procedure for archiving, distributing and recovery of these valuable strains.
 Here we demonstrate a newly developed I&bull;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Sperm from five commonly-used strains of inbred mice were frozen using this kit and then recovered. Higher protection ratios of sperm motility (&gt; 60&#37;) and rapid progressive motility (&gt; 45&#37;) compared to the control (basic CPA) were seen for sperm frozen with this kit in 5 inbred mouse strains. Two cell stage embryo development after IVF with the recovered sperm was improved consistently in all 5 mouse strains examined. Over a 1.5 year period, 49 GM mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&bull;Cryo kit and later recovered by IVF.

Here we demonstrate the newly developed I&#x2022;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Two-cell stage embryo development with frozen-thawed sperm was improved consistently in 5 mouse strains with the use of this kit. Over a 1.5 year period, 49 genetically modified mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&#x2022;Cryo kit and later successfully recovered by IVF.

الماوس حفظ بالبرودة والانتعاش الحيوانات المنوية باستخدام · لقد كرو كيت

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Detection of Rare Genomic Variants from Pooled Sequencing Using SPLINTER

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any two individuals is greater than previously thought3. In contrast, array-based genotyping has failed to identify a significant contribution of common sequence variants to the phenotypic variability of common disease4,5. Taken together, these observations have led to the evolution of the Common Disease / Rare Variant hypothesis suggesting that the majority of the "missing heritability" in common and complex phenotypes is instead due to an individual's personal profile of rare or private DNA variants6-8. However, characterizing how rare variation impacts complex phenotypes requires the analysis of many affected individuals at many genomic loci, and is ideally compared to a similar survey in an unaffected cohort. Despite the sequencing power offered by today's platforms, a population-based survey of many genomic loci and the subsequent computational analysis required remains prohibitive for many investigators.
To address this need, we have developed a pooled sequencing approach1,9 and a novel software package1 for highly accurate rare variant detection from the resulting data. The ability to pool genomes from entire populations of affected individuals and survey the degree of genetic variation at multiple targeted regions in a single sequencing library provides excellent cost and time savings to traditional single-sample sequencing methodology. With a mean sequencing coverage per allele of 25-fold, our custom algorithm, SPLINTER, uses an internal variant calling control strategy to call insertions, deletions and substitutions up to four base pairs in length with high sensitivity and specificity from pools of up to 1 mutant allele in 500 individuals. Here we describe the method for preparing the pooled sequencing library followed by step-by-step instructions on how to use the SPLINTER package for pooled sequencing analysis (<a href="http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter" target="_blank">http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter</a>). We show a comparison between pooled sequencing of 947 individuals, all of whom also underwent genome-wide array, at over 20kb of sequencing per person. Concordance between genotyping of tagged and novel variants called in the pooled sample were excellent. This method can be easily scaled up to any number of genomic loci and any number of individuals. By incorporating the internal positive and negative amplicon controls at ratios that mimic the population under study, the algorithm can be calibrated for optimal performance. This strategy can also be modified for use with hybridization capture or individual-specific barcodes and can be applied to the sequencing of naturally heterogeneous samples, such as tumor DNA.

Pooled DNA sequencing is a fast and cost-effective strategy to detect rare variants associated with complex phenotypes in large cohorts. Here we describe the computational analysis of pooled, next-generation sequencing of 32 cancer-related genes using the SPLINTER software package. This method is scalable, and applicable to any phenotype of interest.

الكشف عن المتغيرات الجينية النادرة من تسلسل المجمعة عن طريق سبلينتر

As DNA sequencing technology has markedly advanced in recent years2, it has become increasingly evident that the amount of genetic variation between any ...

Screening for Functional Non-coding Genetic Variants Using Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) and DNA-affinity Precipitation Assay (DAPA)

Population and family-based genetic studies typically result in the identification of genetic variants that are statistically associated with a clinical disease or phenotype. For many diseases and traits, most variants are non-coding, and are thus likely to act by impacting subtle, comparatively hard to predict mechanisms controlling gene expression. Here, we describe a general strategic approach to prioritize non-coding variants, and screen them for their function. This approach involves computational prioritization using functional genomic databases followed by experimental analysis of differential binding of transcription factors (TFs) to risk and non-risk alleles. For both electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and DNA affinity precipitation assay (DAPA) analysis of genetic variants, a synthetic DNA oligonucleotide (oligo) is used to identify factors in the nuclear lysate of disease or phenotype-relevant cells. For EMSA, the oligonucleotides with or without bound nuclear factors (often TFs) are analyzed by non-denaturing electrophoresis on a tris-borate-EDTA (TBE) polyacrylamide gel. For DAPA, the oligonucleotides are bound to a magnetic column and the nuclear factors that specifically bind the DNA sequence are eluted and analyzed through mass spectrometry or with a reducing sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) followed by Western blot analysis. This general approach can be widely used to study the function of non-coding genetic variants associated with any disease, trait, or phenotype.

Screening for Functional Non-coding Genetic Variants Using Electrophoretic Mobility Shift Assay EMSA and DNA-affinity Precipitation Assay DAPA

We present a strategic plan and protocol for identifying non-coding genetic variants affecting transcription factor (TF) DNA binding. A detailed experimental protocol is provided for electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and DNA affinity precipitation assay (DAPA) analysis of genotype-dependent TF DNA binding.

الكشف عن وظيفية غير الترميز المتغيرات الوراثية عن طريق الكهربي التنقل التحول الفحص (EMSA) والحمض النووي تقارب الهطول الفحص (ضبا)

Population and family-based genetic studies typically result in the identification of genetic variants that are statistically associated with a clinical ...