This work was supported in part by grants from the National Multiple Sclerosis Society (RG 5001-A-3 to S.J.C.), the National Institutes of Health (NS065808 to E.R.B.; NS078392 to S.J.C.), start-up funds from the UConn Health Center (to SJC) and the Kim Family Fund (UCHC in support of K.I.C.).

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على الحيوانات وفقا للسياسة على الرعاية الإنسانية واستخدام الحيوانات المختبرية التي وضعها مكتب مختبر رعاية الحيوان (NIH) وفقط بموافقة من اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) من جامعة مركز الصحة كونيتيكت. 1. إعداد الثقافات المختلطة الدبقية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم جميع الأدوات قبل استخدامها. إضافة 3 مل من محلول معقم الجليد الباردة هانك متوازن الملح (HBSS) التي لا تحتوي على الكاتيونات (المغنيسيوم أو الكالسيوم 2+ 2+) إلى ثلاثة العقيمة 60 ملم أطباق بتري الحفاظ على الجليد للحفاظ على برودة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل القشور من الجراء بعد الولادة الماوس P0-P2، 17،18 كما هو موضح سابقا. ملاحظة: هياكل تحت القشرية، مثل الحصين، ليست مدرجة في هذه الثقافات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية السحايا ومن ثم نقل إلى عزل القشور HBSS الطازجة وفصل الأنسجة إنزيمي، وذلك باستخدام نيالاورال عدة تشريح الأنسجة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة الخلايا في العقيمة T-175 قوارير واحتضان بين عشية وضحاها في وسائل الإعلام [Dulbecco لتعديل النسر المتوسط ​​(DMEM) مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) التي تحتوي على 1X البنسلين / الستربتومايسين]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال جميع وسائل الإعلام في اليوم التالي مع وسائل الإعلام الطازجة. الاستمرار في احتضان الثقافات، مع التغييرات الوسائط العادية، لحوالي 3 أسابيع أو حتى يتم تأسيس أحادي الطبقة الخلوية. ملاحظة: سيتم يتألف هذا أحادي الطبقة من الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة مع ما يقرب من 10: 1 نسبة 19. </li></ol> 2. الكروي التعريفي الخلايا الدبقية في الثقافات المختلطة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد لل coverslips المغلفة ECM. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقع coverslips دائرية مع معقم 1 N حمض الهيدروكلوريك (حمض الهيدروكلوريك) في طبق بتري معقمة لمدة 30 دقيقة. غسل coverslips مع 3X المياه المعقمة ومن ثم نقع في ETOH 95٪ لمدة 20 دقيقة على الأقل. ومن ثم السماح الهواء الجاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان قطرات من MATR خارج الخلية المخففالمواد التاسع (ECM) البروتين طلاء على ورقة من parafilm (على سبيل المثال 150-250 ميكرولتر / قطرة من laminin 10 ميكروغرام / مل في حل عقيم حل العازلة الفوسفات [PBS]). توزيع قطرات بحيث coverslips لن تلمس عند وضعها على هذه القطرات. ضع بلطف كل ساترة المجففة على قطرات باستخدام ملقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك لل coverslips على قطرات تقريبا. 4-6 ساعة داخل الثقافة هود مع وشاح مغلقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لل coverslips المغلفة ECM (ECM المغلفة الجانب متابعة) في كل من الآبار من 24 لوحة جيدا. غسل كل بئر مع برنامج تلفزيوني العقيمة 3X والحفاظ على 4 درجات مئوية لحين الحاجة إليها. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الخلايا الدبقية لطلاء على coverslips. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح وسائل الإعلام من الثقافات الدبقية وغسل بلطف 3X أحادي الطبقة الدبقية مع 10 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة. المقبل، إضافة 8-10 مل التربسين-EDTA حل لT-175، واحتضان لمدة 5-10 دقيقة عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما تم فصل أكثر من أحادي الطبقة، إضافة 20 مل من وسائل الإعلام كاملةإلى القارورة لوقف trypsinization. جمع وسائل الإعلام التي تحتوي على خلايا منفصلة في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل وتدور لمدة 10 دقيقة في 300 XG في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح طاف دون الإخلال بيليه، ومن ثم اعادة تعليق الخلايا في 2 مل من وسائل الإعلام كاملة جديدة من قبل pipetting بلطف الحل باستخدام الماصة P1000. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد عدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات ثم اعادة تعليق الخلايا في المتوسط ​​كاملة في الكثافة المطلوبة (على سبيل المثال 10 5 خلية / مل). لوحة الخلايا على لل coverslips المغلفة ECM (على سبيل المثال 500 ميكرولتر في كل بئر من 24 لوحة جيدا). إضافة وسائط جديدة كاملة إضافية إلى كل بئر لمدة 3-5 أيام من الحضانة عند 37 درجة مئوية، أو حتى تنمو الخلايا لالتقاء البصري المطلوب. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العلاج مع سيكوزين. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تشكيل سيكوزين إلى تركيز الأسهم (108.3 ملم) في سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO). تمييع هذه الأسهم في ETOH 100٪ لجعل مخزون العمل التي يمكن للن أن يضاف إلى كل بئر من 24 لوحة جيدا لتحقيق تركيز النهائي من 10 ميكرومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند إضافة سيكوزين، دوامة بلطف لوحة الثقافة لخلط سيكوزين إلى وسائل الإعلام الثقافة. تكملة سيكوزين بإضافة ما يعادل 10 ميكرومتر كل يوم لمدة أسبوع واحد. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 7 أيام من العلاج سيكوزين، وجمع وسائل الإعلام والماصة 500 ميكرولتر من البرد بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) في كل بئر. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة لإصلاح الخلايا. ثم، وغسل كل 3X بشكل جيد مع برنامج تلفزيوني ومن ثم الحفاظ وحات في 4 درجات مئوية حتى المجهزة للمناعية (انظر أدناه). ملاحظة: خلية الإعلام الثقافة يمكن جمع لالأنزيمية أو فحص ELISA في هذه المرحلة اذا شئت. </li></ol> 3. كيمياء سيتولوجية مناعية (ICC) لتصور خلايا الكروي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال برنامج تلفزيوني مع عرقلة العازلة [PBS + 0.3٪ توين 20 + 5٪ مصل الماعز العادي (خ ع)]، واحتضان الخلايا لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فيcubate الخلايا الثابتة في أمصال مضادة ضد الأساسي إيبا-1 [(1: 1،000) المخفف في برنامج تلفزيوني + 0.3٪ توين 20 + 2٪ NGS] لا يقل عن 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة، ثم يغسل جيدا مع كل برنامج تلفزيوني 3X 5 دقيقة / يغسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة مضان مترافق الضد الثانوية المناسب للتعرف على العلامات الأولية للأجسام المضادة ومكافحة وصمة عار مع 4 &#39;، 6 diamidino-2-phenylindole (دابي، 1: 1،000) لتحديد نوى. احتضان في حل الضد الثانوية لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة، ويغسل مع PBS 3X 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كل جبل ساترة لشرائح المجهر باستخدام المتوسطة المتزايدة. عرض الشرائح على المجهر الفلورسنت للتحليلات البصرية والكمية. </li></ol> 4. تحليل وتوصيف الخلايا الكروي في الثقافة الأولية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ثلاثة معايير المورفولوجية التالية لتحديد خلية الكروي في الثقافة: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الخلايا الكروي باستخدام المجهر الفلورسنت من وضع العلامات immunopositive للعلامة دبقية صغيرة، إيبا-1 +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديدخلايا الكروي ومتعدد النوى (أي التي تحتوي على اثنين أو أكثر من نوى دابي إيجابية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الخلايا الكروي من قبل مورفولوجيا مستدير متميزة من مظهر تشعبت للغاية من خلايا يستريح دبيقي. ملاحظة: يمكن أيضا أن تجمع الخلايا لتحليل علامة سطح الخلية وتقدير التدفق الخلوي من هذه الثقافات. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس تفعيل البلعمة من الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا الكروي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتقييم نشاط البلعمة من المعالجة سيكوزين الخلايا الدبقية الصغيرة، إضافة حبات اللاتكس FITC المسمى إلى الآبار وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. إضافة حبات اللاتكس الفلورسنت مترافق 48 ساعة قبل تثبيت مع PFA. إصلاح الخلايا تعامل مع الخرز (كما هو مذكور في القسم 2.4)، وعملية مناعية (كما هو موضح في القسم 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الأجسام المضادة الثانوية مترافق fluorophore بحيث لا تتداخل أطياف الانبعاث فلوري من fluorophore المسمى الخرز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يحلله لمحات من بلعمية إيبا-1 + الخلايا الدبقية الصغيرة من خلال تحديد تلك الخلايا التي تشارك في توطين مع حبات fluorescently المسمى. ملاحظة: سوف سيكوزين تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة. وسيتم تحديد الخرز المبتلعة داخل mononucleated ومتعددة النوى إيبا-1 + الخلايا في هذا الإعداد الثقافة. </li></ol></li></ol> 5. تحريض الخلايا الكروي من الثقافات تنقية دبقية ملاحظة: نهج بديل فك الإشارات بين الخلايا بين نجمية والخلايا الدبقية الصغيرة هي ميزة أخرى لهذا في المختبر نموذج كروي الشكل الخلية. ويمكن تحقيق تنقية خلايا دبقية الأولية للreplating أو زملاء زراعة بانخفاض الملكية تمسكهم في الثقافة، كما هو موضح في الخطوات التالية (انظر القسم 5.2). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع وسائل الإعلام من ثقافات مختلطة الدبقية متكدسة في أنبوب مخروطي 50 مل والحفاظ عليه عند 37 درجة مئوية في الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل دبقية صغيرة من الثقافات المختلطة الدبقية الأولية.<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد إزالة وسائل الإعلام من متكدسة مختلطة الثقافة الدبقية T175 قارورة، إضافة وسائط اهتزاز الدافئة [تتألف من وسائل الإعلام كاملة + 25 ملي 4- (2 هيدروكسي إيثيل) حامض -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) + 25 ملي بيكربونات الصوديوم (سيغما)]. يهز قوارير لمدة 3-4 ساعة في شاكر المداري في 100 دورة في الدقيقة (37 ° C). جمع وسائل الإعلام من هذه قوارير اهتزت في 50 مل أنابيب مخروطية. ملاحظة: وسوف تشمل هذه الوسائط على الخلايا الدبقية الصغيرة ملتصقة أقل من قوارير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور في وسائل الإعلام في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. نضح طاف ثم اعادة تعليق الخلايا في 2 مل من وسائل الإعلام مكيفة نجمية (تم جمعها في الخطوة 5.1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد عدد الخلايا المكتسبة باستخدام عدادة الكريات ثم لوحة الخلايا دبقية صغيرة على coverslips المغلفة الركيزة (انظر القسم 2.1) للمناعية، أو لوحة على لوحات فائقة الانخفاض تمسك جيدا لجمع الخلايا في المستقبل الكروي للثقافة مشتركة مع أنواع الخلايا الأخرى، مثل الخلايا قليلة التغصن (كما تنازلياribed في القسم التالي). ملاحظة: مطلي مرة واحدة يمكن التعامل مع الخلايا الدبقية الصغيرة مع سيكوزين (10 ميكرومتر) كما هو موضح أعلاه (انظر القسم 2.3). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شارك في الثقافة مع الخلايا قليلة التغصن الابتدائية للتحليل السمسة. ملاحظة: مجموعة من الخلايا الدبقية الصغيرة المعالجة سيكوزين من لوحات التقيد منخفضة لاحقة شارك في ثقافة على الثقافات الأولية من الخلايا قليلة التغصن، أو خلايا دبقية قليلة التغصن السلف، ويمكن استخدامها لدراسة وظيفة السامة المحتملة لمثل هذه الخلايا في المختبر كروي الشكل. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطوير ثقافات قليلة التغصن الأولية باستخدام أساليب أنشئت 18،20. لجمع الخلايا الدبقية الصغيرة المعالجة سيكوزين، الماصة بلطف لفصل الخلايا الملتصقة فضفاضة من أسفل الآبار. جمع الخلايا، وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة، وresuspend ثم بعناية في وسائل الإعلام دبقية قليلة التغصن التمايز [مكونة من Neurobasal وسائل الإعلام، L-الجلوتامين (1X)، B-27 ملحق (1X)، و triiodothyronine (T3، 10 نانوغرام / مل )]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب عدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات ثم بذر الخلايا الدبقية الصغيرة على ثقافة دبقية قليلة التغصن في 1 × 10 5 خلية / مل، مما أدى إلى تقارب 1: 2 الخلايا الدبقية الصغيرة / نسبة دبقية قليلة التغصن. احتضان باعتباره الثقافة المشتركة لمدة تصل إلى 3 أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح خلايا مناعية ل(انظر القسم 2.4). جمع وسائل الإعلام ثقافة الخلية لELISA أو التحاليل الكيميائية حسب الحاجة. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Rafi, M. A., Luzi, P., Chen, Y. Q., Wenger, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+deletion+together+with+a+point+mutation+in+the+GALC+gene+is+a+common+mutant+allele+in+patients+with+infantile+Krabbe+disease.">A large deletion together with a point mutation in the GALC gene is a common mutant allele in patients with infantile Krabbe disease.</a> Hum Mol Genet. 4, 1285-1289 (1995).</li><li>Duffner, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long-term+outcomes+of+presymptomatic+infants+transplanted+for+Krabbe+disease:+report+of+the+workshop+held+on+July+11+and+12.">The long-term outcomes of presymptomatic infants transplanted for Krabbe disease: report of the workshop held on July 11 and 12.</a> Genet Med. 11, 450-454 (2008).</li><li>Duffner, P. K., Jalal, K., Carter, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hunter's+Hope+Krabbe+family+database.">The Hunter's Hope Krabbe family database.</a> Pediatr Neurol. 40, 13-18 (2009).</li><li>Duffner, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newborn+screening+for+Krabbe+disease:+the+New+York+State+model.">Newborn screening for Krabbe disease: the New York State model.</a> Pediatr Neurol. 40, 245-252 (2009).</li><li>Krabbe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+familial,+infantile+form+of+brain+sclerosis.">A new familial, infantile form of brain sclerosis.</a> Brain. 39, 74-114 (1916).</li><li>Percy, A. K., Odrezin, G. T., Knowles, P. D., Rouah, E., Armstrong, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Globoid+cell+leukodystrophy:+comparison+of+neuropathology+with+magnetic+resonance+imaging.">Globoid cell leukodystrophy: comparison of neuropathology with magnetic resonance imaging.</a> Acta Neuropathol. 88, 26-32 (1994).</li><li>Itoh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistological+study+of+globoid+cell+leukodystrophy.">Immunohistological study of globoid cell leukodystrophy.</a> Brain Dev. 24, 284-290 (2002).</li><li>Reddy, A. S., Patel, J. R., Vogler, C., Klein, R. S., Sands, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+nervous+system+pathology+progresses+independently+of+KC+and+CXCR2+in+globoid-cell+leukodystrophy.">Central nervous system pathology progresses independently of KC and CXCR2 in globoid-cell leukodystrophy.</a> PLoS One. 8, (2013).</li><li>McNally, A. K., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+fusion+and+multinucleated+giant+cells+of+inflammation.">Macrophage fusion and multinucleated giant cells of inflammation.</a> Adv Exp Med Biol. 713, 97-111 (2011).</li><li>Kaneko, Y., Kitamoto, T., Tateishi, J., Yamaguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ferritin+immunohistochemistry+as+a+marker+for+microglia.">Ferritin immunohistochemistry as a marker for microglia.</a> Acta Neuropathol. 79, 129-136 (1989).</li><li>Graeber, M. B., Streit, W. J., Kreutzberg, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microglial+cytoskeleton:+vimentin+is+localized+within+activated+cells+in+situ.">The microglial cytoskeleton: vimentin is localized within activated cells in situ.</a> J Neurocytol. 17, 573-580 (1988).</li><li>Kondo, Y., Adams, J. M., Vanier, M. T., Duncan, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+counteract+demyelination+in+a+mouse+model+of+globoid+cell+leukodystrophy.">Macrophages counteract demyelination in a mouse model of globoid cell leukodystrophy.</a> J Neurosci. 31, 3610-3624 (2011).</li><li>Pollanen, M. S., Brody, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+globoid+cell+leukodystrophy.">Fetal globoid cell leukodystrophy.</a> Arch Pathol Lab Med. 114, 213-216 (1990).</li><li>Martin, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+Krabbe+leukodystrophy.+A+morphologic+study+of+two+cases.">Fetal Krabbe leukodystrophy. A morphologic study of two cases.</a> Acta Neuropathol. 53, 87-91 (1981).</li><li>Ijichi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MMP-3+mediates+psychosine-induced+globoid+cell+formation:+Implications+for+leukodystrophy+pathology.">MMP-3 mediates psychosine-induced globoid cell formation: Implications for leukodystrophy pathology.</a> Glia. , (2013).</li><li>Pellegatta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+therapeutic+potential+of+neural+stem/progenitor+cells+in+murine+globoid+cell+leukodystrophy+is+conditioned+by+macrophage/microglia+activation.">The therapeutic potential of neural stem/progenitor cells in murine globoid cell leukodystrophy is conditioned by macrophage/microglia activation.</a> Neurobiol Dis. 21, 314-323 (2006).</li><li>Crocker, S. J., Milner, R., Pham-Mitchell, N., Campbell, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+agonist-specific+regulation+of+genes+for+matrix+metalloproteinases+and+their+tissue+inhibitors+by+primary+glial+cells.">Cell and agonist-specific regulation of genes for matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors by primary glial cells.</a> Journal of Neurochemistry. 98, 812-823 (2006).</li><li>Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+mouse+cortical+astrocytes.">Isolation and culture of mouse cortical astrocytes.</a> J Vis Exp. , (2013).</li><li>Crocker, S. J., Frausto, R. F., Whitton, J. L., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+to+establish+microglia-free+astrocyte+cultures:+comparison+of+matrix+metalloproteinase+expression+profiles+in+pure+cultures+of+astrocytes+and+microglia.">A novel method to establish microglia-free astrocyte cultures: comparison of matrix metalloproteinase expression profiles in pure cultures of astrocytes and microglia.</a> Glia. 56, 1187-1198 (2008).</li><li>Moore, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+Tissue+Inhibitor+of+Metalloproteinase-1+(TIMP-1)+Promotes+Oligodendrocyte+Differentiation+and+Enhances+CNS+Myelination.">Astrocytic Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1 (TIMP-1) Promotes Oligodendrocyte Differentiation and Enhances CNS Myelination.</a> J Neurosci. 31, 6247-6254 (2011).</li><li>Im, D. S., Heise, C. E., Nguyen, T., O'Dowd, B. F., Lynch, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+molecular+target+of+psychosine+and+its+role+in+globoid+cell+formation.">Identification of a molecular target of psychosine and its role in globoid cell formation.</a> J Cell Biol. 153, 429-434 (2001).</li></ol>

The authors declare no conflicts of interest.

بروتوكول الموصوفة هنا يوفر النظام نموذج جديد للدراسة تطوير وتوصيف وظيفي لتنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا الكروي. العمل مسبق من ايم وآخرون. باستخدام خط الخلية HEK293 قدمت نموذجا لتطوير هذا البروتوكول لدراسة تشكيل خلية الكروي 21. ومن المهم أيضا أن نشير ?...

حثل المادة البيضاء الكروي الخلية (GLD)، المعروف أيضا باسم مرض كرابه، هو مرض قاتل المزيل الناتجة عن فقدان وظيفة الطفرات في galatocerebrosidase (galc) الجين 1. الشكل الأكثر شيوعا من GLD هو البديل الطفولي الذي تمثله في بداية مرحلة الطفولة المبكرة وتتميز نمطا سريريا من السيارات والتدهور المعرفي يؤدي إلى الوفاة المبكرة غالبا قبل سن الخامسة 2،3. وتستخدم الاختبارات الجينية للتحقق من تشخيص GLD 4. أمراض الأعصاب من GLD يكشف إزالة الميالين على نطاق واسع، وضمور الخلايا العصبية، دباق النجمي وجود محتقن الخلايا الدبقية الصغيرة متعددة الأنوية تسمى خلايا كروي الشكل 5-7. تحديد خلايا كروي الشكل، وغالبا ما تحتوي على شوائب نبيبي في السيتوبلازم بها، لقد كان السمة المميزة لشعبة الشؤون القانونية العامة على مدى السنوات 97 الماضية، على الرغم من أن ظلت وظيفة معينة من هذه الخلايا واضحة بعيد المنال. مشاركة غير myel-منذ فترة طويلة تعتبر inating الدبقية (الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا النجمية) في التسبب في GLD استجابة الثانوية إلى إزالة الميالين عميق في هذا المرض 8. ومن المثير للاهتمام، وأول وصف لهذا المرض، الذي أدلى به كنود كرابه 5 في عام 1916، وتشكيل ذكرت من البالعات متعددة النوى التي تحتوي على الدهون الحطام التي تم اسمه &#39;الكروي الخلايا وهي السمة المميزة لهذا المرض. خلايا الكروي هي سمة مميزة لGLD علم الأمراض، على الرغم منذ فترة طويلة تجاهل دورها في GLD. ومن المثير للاهتمام، وهذه الخلايا هي من بين أولى التغييرات المميزة في أنسجة الجهاز العصبي المركزي GLD. هذا النقص في المعرفة قد يكون بسبب افتراض أن تشكيل البالعات متعددة النوى، تسمى الخلايا العملاقة في أمراض أخرى، تعتبر عادة نتيجة للأمراض المسببة للأمراض بدلا من القوة الدافعة الأولية 9. ولذلك، كانت هناك دراسات قليلة للتحقق من الآلية التي كتبها مبادرة الخوذ البيضاءتتشكل خلايا الكروي CH من البالعات، وخاصة في الجهاز العصبي المركزي من GLD. الإجراء الموضح في هذا التقرير يركز على أهمية تشكيل الكروي الخلايا في الجهاز العصبي المركزي ومظاهرة لدينا السابقة التي يسببها سيكوزين الانوية من الخلايا الدبقية الصغيرة في المختبر، وعرضت هذه الخلايا مستويات أعلى من النشاط البلعمة. واتساقا مع هذه الملاحظات، والخلايا في أدمغة الكروي twitcher كثيرا ما تحتوي-PAS إيجابي الحطام، مما يشير إلى ارتفاع مستويات نشاط البلعمة. تم العثور على خلايا كروي الشكل أيضا أن يكون immunopositive لالفيريتين (علامة الخلايا الدبقية الصغيرة) 10، KP-1 / CD68 (علامة الوحيدات)، وبعضها أيضا إيجابية لvimentin (بروتين خيوط وسيطة وعلامة من الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة تفعيلها) 11، HLA-DRA (وهي مستقبلات سطح MHCII)، و TNF-α 7، وإيبا-1 (بروتين ملزمة الكالسيوم المستخدمة لتحديد الخلايا الدبقية الصغيرة) 12. وبناء على هذه المجموعة من علامات، وخلايا الكروي تنشأ من الخلايا الدبقية الصغيرة التي تنميالنمط الظاهري فريدة من نوعها. على الرغم من طابعها الفريد، تم التغاضي عن وظيفة محددة ومساهمة GCS إلى GLD المرضية إلى حد كبير. كان يظن خلايا الكروي لتكون نتيجة ثانوية للإزالة الميالين المزمن. ومع ذلك، فقد حددت دراسات سابقة دراسة جمعية الزمنية للخلايا الكروي لعلم الأمراض المسألة الأبيض من GLD وجود خلايا الكروي في أواخر الجنينية لفترة ما بعد الولادة في وقت مبكر؛ الأوقات التي سبقت موت الخلايا المبرمج دبقية قليلة التغصن وإزالة الميالين العلني 13. وهكذا، فإن التسلسل الزمني لتطور أمراض الأعصاب في GLD تشير إلى أن الخلايا الكروي تتشكل في وقت مبكر من إزالة الميالين في هذا المرض 14. وأدى ذلك إلى فرضيتنا أن تشكيل المبكر للخلايا الكروي في GLD قد تمثل حدثا الممرضة تحديد بدلا من الثانوية، والاستجابة التفاعلية للتلف دبقية قليلة التغصن 15. بالإضافة إلى ذلك، فقد اعتبر ديسريغولاتيون النشاط دبقية في GLD والواقعص تحد من فعالية على المدى الطويل hematopeotic العلاج بالخلايا الجذعية لعلاج هذا المرض 16. وهكذا، والتحقيق في الوظائف الخلوية وتنظيم الخلايا الدبقية الصغيرة، وخلايا الكروي، ردا على سيكوزين من المتوقع أن توفر رؤى جديدة في التسبب في GLD. حتى وقت قريب، كان عدم وجود نموذج مناسب للدراسة تشكيل خلية الكروي محدودة فهم وظيفة محددة ومساهمة هذه الخلايا للأمراض من GLD. في الدراسات الحديثة، تقرر أن الخلايا الكروي مثل يمكن تشكيلها في استجابة مباشرة لسيكوزين، وهو توكسين الدهون التي تتراكم العدوى في GLD. وجدنا أن الخلايا الدبقية الصغيرة، ولكن ليس الضامة، يتم تنشيط وتحويلها إلى خلايا الكروي في الثقافات الدبقية الأولية ردا على سيكوزين 15. تم العثور على هذا التحول إلى خلايا الكروي أن بوساطة البروتيني خارج الخلية، الفلزي مصفوفة (MMP) -3 15. وفي الآونة الأخيرة، فإنناقمنا بمد هذه النتائج وقرر أن الخلايا الدبقية الصغيرة وتنشيط خلايا الكروي سيكوزين المتقدمة في هذا المختبر في نظام نموذجي هي أكثر قدرة سامة للخلايا والخلايا قليلة التغصن دبقية قليلة التغصن السلف. وبالتالي، عندما اعتبر في سياق GLD، وتراكم في وقت مبكر من سيكوزين وتشكيل خلايا الكروي قبل إزالة الميالين ستدعم دورا الابتدائي وربما العدوى الناشئة عن الخلايا الدبقية الصغيرة في هذا المرض. نقترح دراسة تشكيل خلية الكروي سوف تكشف معلومات جديدة عن التسبب في GLD من شأنها أن تسهم في فهمنا لهذا المرض. وعلاوة على ذلك، هذا النموذج الخلوي الجديد من GLD قد توفر شكلا جديدا من النهج الذي علاجية جديدة لمعالجة يمكن اختبارها تغيرات مرضية في هذا المرض. وبالتالي، في هذا التقرير نقدم بروتوكول مفصلة لتطوير في المختبر من خلايا كروي الشكل الناجم عن سيكوزين من الثقافات الأولية من غير myelinating الدبقية.

<table><tbody><tr><td>Hank&amp;rsquo;s balanced salt solution (HBSS) containing no cations (Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; and Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;).</td><td>Life technologies</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Neural Tissue Dissociation Kit</td><td>Miltenyi</td><td>130-092-628</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;#956;m cell-strainer</td><td>Fisherbrand</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s balanced salt solution (HBSS) containing cations (Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; and Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;).</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s modified eagle medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>fetal bovine serum (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin/Streptomycin</td><td>Life technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA solution</td><td>Life technologies</td><td>25299-056</td><td></td></tr><tr><td>Psychosine</td><td>Sigma</td><td>P9256</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>19208</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum (NGS)</td><td>Invitrogen</td><td>PCN5000</td><td></td></tr><tr><td>Iba-1</td><td>WAKO</td><td>019-19741</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor conjugated antisera</td><td>Life Technologies</td><td>Various</td><td></td></tr><tr><td>Mounting Media</td><td>Southern Biotech</td><td>OB100-01</td><td></td></tr><tr><td>Phagocytic Assay Kit</td><td>Cayman Chemicals</td><td>500290</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>BP310-500</td><td></td></tr></tbody></table>

an in vitro model for the study of cellular pathophysiology in globoid cell leukodystrophy

وظيفة محددة من الخلايا الدبقية الصغيرة متعددة الأنوية، تسمى خلايا الكروي، التي هي وفيرة فريد في النظام العصبي المركزي من حثل المادة البيضاء الكروي الخلايا (GLD) غير واضحة. وقد أعاقت هذه الفجوة في المعرفة من خلال عدم وجود الاقتضاء في النموذج المختبر للدراسة. هنا، نحن تصف الفئران نظام الثقافة الدبقية الأساسي في العلاج مع النتائج التي سيكوزين في الانوية من الخلايا الدبقية الصغيرة تشبه الخلايا كروي الشكل المميزة وجدت في شعبة الشؤون القانونية العامة. باستخدام هذا النظام المبتكر، حددنا شروط وطرق التحليل للدراسة الخلايا الكروي. تم التحقق من صحة الاستخدام المحتمل لهذا النظام نموذجا في دراستنا السابقة، والتي حددت دور محتمل للمصفوفة الفلزي (MMP) -3 في شعبة الشؤون القانونية العامة. هذه الرواية في نظام المختبر قد تكون نموذجا مفيدا للدراسة تشكيل وظيفة، ولكن أيضا التلاعب العلاجية المحتملة، من هذه الخلايا الفريدة من نوعها.

هذا البروتوكول، كما هو مكتوب، ومن المتوقع أن تستغرق نحو 36 يوما لاستكمال من البداية الى النهاية (انظر الشكل 1: مخطط سير العمل التجريبية). فقد كان من تجربتنا أن تطوير الخلايا مثل كروي الشكل &#39;في هذا النظام الأساسي الثقافة على حد سواء موثوقة وقابلة للتكرار: لوحظ...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy at JoVE.com

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells.

و<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج لدراسة الفيزيولوجيا المرضية الخلوي في الخلية حثل المادة البيضاء الكروي

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

an-vitro-model-for-study-cellular-pathophysiology-globoid-cell

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

7.8K Views.  University of Connecticut Health Center. Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells. 

Video: An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and Schwann cells in the peripheral nervous system (PNS). We use an in vitro myelination assay, an established model for studying CNS myelination in vitro. To do this, oligodendrocyte precursor cells (OPCs) are added to the purified primary rodent dorsal root ganglion (DRG) neurons to form myelinating co-cultures. In order to specifically interrogate the roles that particular proteins expressed by oligodendrocytes exert upon myelination we have developed protocols that selectively transduce OPCs using the lentivirus overexpressing wild type, constitutively active or dominant negative proteins before being seeded onto the DRG neurons. This allows us to specifically interrogate the roles of these oligodendroglial proteins in regulating myelination. The protocols can also be applied in the study of other cell types, thus providing an approach that allows selective manipulation of proteins expressed by a desired cell type, such as oligodendrocytes for the targeted study of signaling and compensation mechanisms. In conclusion, combining the in vitro myelination assay with lentiviral infected OPCs provides a strategic tool for the analysis of molecular mechanisms involved in myelination.

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Here we present protocols that offer a flexible and strategic foundation for virally manipulating oligodendrocyte precursor cells to overexpress proteins of interest in order to specifically interrogate their role in oligodendrocytes via the in vitro model of central nervous system myelination.

إنتاج واستخدام الفيروسة البطيئة إلى خلايا انتقائي تنبيغ الابتدائية دبقية قليلة التغصن السلائف ل<em&gt; في المختبر</em&gt; فحوصات تكون الميالين

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

Developmental Biology

Preparation of Rat Oligodendrocyte Progenitor Cultures and Quantification of Oligodendrogenesis Using Dual-infrared Fluorescence Scanning

Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating diseases such as multiple sclerosis and transverse myelitis. Myelination is required to not only facilitate rapid impulse propagation within the central nervous system, but also to provide trophic support to underlying axons. Oligodendrocyte progenitor cells (OPCs) can be studied in vitro to help identify factors that may promote or inhibit oligodendrocyte differentiation. To date, many of the methods available to evaluate this process have either required large numbers of cells, thus limiting the number of conditions that can be investigated at any one time, or labor-intensive methods of quantification. Herein, we describe a protocol for the isolation of large numbers of highly pure OPCs together with a fast and reliable method to determine oligodendrogenesis from multiple conditions simultaneously. OPCs are isolated from P5-P7 neonatal rat cortices and grown in vitro for three days prior to differentiation. Four days after differentiation, oligodendrogenesis is evaluated using a dual-infrared fluorescence-scanning assay to determine expression of the myelin protein.

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. This protocol describes a method for the isolation and culture of their precursors, oligodendrocyte progenitor cells, from rat cortices, as well as a fast and reliable quantitative method to evaluate oligodendrogenesis in vitro in response to experimental factors.

التحضير للثقافات الجرذ دبقية قليلة التغصن السلف والكمي لOligodendrogenesis عن طريق ثنائي الأشعة تحت الحمراء الضوئي الإسفار

Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating ...

Derivation of Glial Restricted Precursors from E13 mice

This is a protocol for derivation of glial restricted precursor (GRP) cells from the spinal cord of E13 mouse fetuses. These cells are early precursors within the oligodendrocytic cell lineage. Recently, these cells have been studied as potential source for restorative therapies in white matter diseases. Periventricular leukomalacia (PVL) is the leading cause of non-genetic white matter disease in childhood and affects up to 50% of extremely premature infants. The data suggest a heightened susceptibility of the developing brain to hypoxia-ischemia, oxidative stress and excitotoxicity that selectively targets nascent white matter. Glial restricted precursors (GRP), oligodendrocyte progenitor cells (OPC) and immature oligodendrocytes (preOL) seem to be key players in the development of PVL and are the subject of continuing studies. Furthermore, previous studies have identified a subset of CNS tissue that has increased susceptibility to glutamate excitotoxicity as well as a developmental pattern to this susceptibility. Our laboratory is currently investigating the role of oligodendrocyte progenitors in PVL and use cells at the GRP stage of development. We utilize these derived GRP cells in several experimental paradigms to test their response to select stresses consistent with PVL. GRP cells can be manipulated in vitro into OPCs and preOL for transplantation experiments with mouse PVL models and in vitro models of PVL-like insults including hypoxia-ischemia. By using cultured cells and in vitro studies there would be reduced variability between experiments which facilitates interpretation of the data. Cultured cells also allows for enrichment of the GRP population while minimizing the impact of contaminating cells of non-GRP phenotype.

This protocol outlines the derivation of Glial Restricted Precursors from fetal spinal cords and maintained in vitro either for transplantation or for the study of oligodendrocytic lineage.

الاشتقاق من السلائف المقيد الغروية من E13 الفئران

This is a protocol for derivation of glial restricted precursor (GRP) cells from the spinal cord of E13 mouse fetuses. These cells are early precursors ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of &#8216;&#8216;collateral&#8217;&#8217; neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

ل<em&gt; السابقين فيفو</em&gt; نموذج لهجوم T-خلية الموجه دبقية قليلة التغصن في الدماغ الحادة شرائح

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Immunology and Infection

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

تحليل الخلايا الليمفاوية التسرب باستخدام<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج من الدم في الدماغ الإنسان الحاجز

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Modeling Myotonic Dystrophy 1 in C2C12 Myoblast Cells

Myotonic dystrophy 1 (DM1) is a common form of muscular dystrophy. Although several animal models have been established for DM1, myoblast cell models are still important because they offer an efficient cellular alternative for studying cellular and molecular events. Though C2C12 myoblast cells have been widely used to study myogenesis, resistance to gene transfection, or viral transduction, hinders research in C2C12 cells. Here, we describe an optimized protocol that includes daily maintenance, transfection and transduction procedures to introduce genes into C2C12 myoblasts and the induction of myocyte differentiation. Collectively, these procedures enable best transfection/transduction efficiencies, as well as consistent differentiation outcomes. The protocol described in establishing DM1 myoblast cell models would benefit the study of myotonic dystrophy, as well as other muscular diseases.

In this protocol, we present the procedures in establishing myotonic dystrophy 1 myoblast models, including optimized C2C12 cell maintenance, gene transfection/transduction, and myocyte differentiation.

نمذجة العضلي الضمور 1 في خلايا C2C12 بالخلايا العضلية الجذعية

Myotonic dystrophy 1 (DM1) is a common form of muscular dystrophy. Although several animal models have been established for DM1, myoblast cell models are ...

Medicine

Adult Mouse DRG Explant and Dissociated Cell Models to Investigate Neuroplasticity and Responses to Environmental Insults Including Viral Infection

This protocol describes an ex vivo model of mouse-derived dorsal root ganglia (DRG) explant and in vitro DRG-derived co-culture of dissociated sensory neurons and glial satellite cells. These are useful and versatile models to investigate a variety of biological responses associated with physiological and pathological conditions of the peripheral nervous system (PNS) ranging from neuron-glial interaction, neuroplasticity, neuroinflammation, and viral infection. The usage of DRG explant is scientifically advantageous compared to simplistic single cells models for multiple reasons. For instance, as an organotypic culture, the DRG explant allows ex vivo transfer of an entire neuronal network including the extracellular microenvironment that play a significant role in all the neuronal and glial functions. Further, DRG explants can also be maintained ex vivo for several days and the culture conditions can be perturbed as desired. In addition, the harvested DRG can be further dissociated into an in vitro co-culture of primary sensory neurons and satellite glial cells to investigate neuronal-glial interaction, neuritogenesis, axonal cone interaction with the extracellular microenvironment, and more general, any aspect associated with the neuronal metabolism. Therefore, the DRG-explant system offers a great deal of flexibility to study a wide array of events related to biological, physiological, and pathological conditions in a cost-effective manner.

In this report, the advantages of organotypic cultures and dissociated primary cultures of mouse-derived dorsal root ganglia are highlighted to investigate a wide range of mechanisms associated with neuron-glial interaction, neuroplasticity, neuroinflammation, and response to viral infection.

الكبار الماوس DRG Explant ونأت بنماذج الخلية للتحقيق في أعصاب والردود على الإهانات البيئية بما في ذلك العدوى الفيروسية

This protocol describes an ex vivo model of mouse-derived dorsal root ganglia (DRG) explant and in vitro DRG-derived co-culture of dissociated sensory ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present methods for the development of assays to query potentially clinically significant nonsynonymous changes using in vivo complementation in zebrafish. Zebrafish (Danio rerio) are a useful animal system due to their experimental tractability; embryos are transparent to enable facile viewing, undergo rapid development ex vivo, and can be genetically manipulated.1 These aspects have allowed for significant advances in the analysis of embryogenesis, molecular processes, and morphogenetic signaling. Taken together, the advantages of this vertebrate model make zebrafish highly amenable to modeling the developmental defects in pediatric disease, and in some cases, adult-onset disorders. Because the zebrafish genome is highly conserved with that of humans (~70% orthologous), it is possible to recapitulate human disease states in zebrafish. This is accomplished either through the injection of mutant human mRNA to induce dominant negative or gain of function alleles, or utilization of morpholino (MO) antisense oligonucleotides to suppress genes to mimic loss of function variants. Through complementation of MO-induced phenotypes with capped human mRNA, our approach enables the interpretation of the deleterious effect of mutations on human protein sequence based on the ability of mutant mRNA to rescue a measurable, physiologically relevant phenotype. Modeling of the human disease alleles occurs through microinjection of zebrafish embryos with MO and/or human mRNA at the 1-4 cell stage, and phenotyping up to seven days post fertilization (dpf). This general strategy can be extended to a wide range of disease phenotypes, as demonstrated in the following protocol. We present our established models for morphogenetic signaling, craniofacial, cardiac, vascular integrity, renal function, and skeletal muscle disorder phenotypes, as well as others.

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present a systematic approach for developing physiologically relevant, sensitive and specific in vivo assays for interpreting variation in human pathology. Transient genetic manipulation via microinjection of WT and mutant human mRNA and morpholino (MO) antisense oligonucleotides harness the tractability of the developing zebrafish embryo to rapidly assay pathogenic mutations, especially, but not exclusively, in the context of human developmental disorders.

في النمذجة فيفو من المهووسين الجينوم البشري باستخدام دانيو rerio

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

Biology

Ex Vivo Myelination and Remyelination in Cerebellar Slice Cultures as a Quantitative Model for Developmental and Disease-Relevant Manipulations

Studying myelination&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo poses numerous challenges. The differentiation of oligodendrocyte precursor cells (OPCs)&#160;in vitro, although scalable,&#160;does not recapitulate axonal myelination. OPC-neuron cocultures and OPC-fiber cultures allow for the examination of in vitro myelination, but they lack additional cell types that are present in vivo, such as astrocytes and microglia. In vivo&#160;mouse models, however, are less amenable to chemical, environmental, and genetic manipulation and are much more labor intensive. Here, we describe&#160;an&#160;ex vivo mouse cerebellar slice culture (CSC) quantitative system that is useful for: 1) studying developmental myelination, 2) modeling demyelination and remyelination, and 3) conducting translational research. Sagittal sections of the cerebellum and hindbrain are isolated from postnatal day (P) 0&#8211;2 mice, after which they myelinate&#160;ex vivo&#160;for 12 days. During this period, slices can be manipulated in various ways, including the addition of compounds to test for an effect on developmental myelination. In addition, tissue can be fixed for electron microscopy to assess myelin ultrastructure and compaction. To model disease, CSC can be subjected to acute hypoxia to induce hypomyelination. Demyelination in these explants can also be induced by lysolecithin, which allows for the identification of factors that promote remyelination. Aside from chemical and environmental modifications, CSC can be isolated from transgenic mice and are responsive to genetic manipulation induced with Ad-Cre adenoviruses and tamoxifen. Thus, cerebellar slice cultures are a fast, reproducible, and quantifiable model for recapitulating myelination.

Presented is a protocol for an ex vivo quantitative model of demyelination and remyelination using mouse cerebellar slice cultures. This method closely recapitulates an in vivo model with its full complement of CNS cell types in intact tissue, while maintaining the chemical, genetic, and environmental amenability of an in vitro system.

Studying myelination&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo poses numerous challenges. The differentiation of oligodendrocyte precursor cells (OPCs)&#160;in ...

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine neonates for the isolation of glial subpopulations. The purpose of the procedure is to dissociate microglia, oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), and astrocytes from cortical, cerebellar, brainstem, and spinal cord tissue to facilitate further in vitro analysis. The CNS region isolation procedures allow for the determination of regional heterogeneity among glia in multiple cell culture systems. Rapid CNS region isolation is performed, followed by the mechanical removal of meninges to prevent meningeal cell contamination of glia. This protocol combines gentle tissue dissociation and plating on a specified matrix designed to preserve cell integrity and adherence. Isolating mixed glia from multiple CNS regions provides a comprehensive analysis of potentially heterogenous glia while maximizing the use of individual experimental animals. Additionally, following dissociation of regional tissue, mixed glia are further divided into multiple cell types including microglia, OPCs, and astrocytes for use in either single cell type, cell culture plate inserts, or co-culture systems. Overall, the demonstrated techniques provide a comprehensive protocol of broad applicability for careful dissection of four individual CNS regions from murine neonates and includes methods for the isolation of three individual glia cell types to examine regional heterogeneity in any number of in vitro cell culture systems or assays.

Here we present a protocol for in vitro isolation of multiple glial cell populations from a mouse CNS. This method allows for the segregation of regional microglia, oligodendrocyte precursor cells, and astrocytes to study the phenotypes of each in a variety of culture systems.

تشريح وعزل الفئران الدبقية من مناطق الجهاز العصبي المركزي المتعددة

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

و

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

إنتاج واستخدام الفيروسة البطيئة إلى خلايا انتقائي تنبيغ الابتدائية دبقية قليلة التغصن السلائف ل