وأيد هذا البحث من قبل برنامج بحوث جماعية من لجنة التحقيق الوطنية.

1. إعداد مخزون ماستر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل الأسهم الرئيسي من المركبات لفحصها في DMSO. إعداد الأسهم بتركيز مستوى 20 ملي. ملاحظة: أي تركيز أعلى من 10 ملي يمكن استخدامها. المركبات التي يمكن أن تستخدم الضوابط الإيجابية للتحقق من صحة هذا الاختبار تشمل RAL، EVG، وDTG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تذاب ضمان مركبات في DMSO من قبل vortexing الحلول عدة مرات لمدة 15 ثانية وتفرخ على RT لمدة 1 ساعة. تخزين 20 ملي حلول الأسهم في الظلام في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. </li></ol> 2. إعداد لوحات 96 جيدا لفحص المركبة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار خط الخلية لفحصها (على سبيل المثال ملتحقا أو TZM-BL)، والبذور 100 ميكرولتر من تلك الخلايا في مناطق ذات كثافة من 4 × 10 4 خلية / مل (4،000 خلايا / جيد) في وسائل الإعلام (مثل تعديل في النسر أو DMEM المتوسطة Dulbecco و تستكمل مع 5٪ (V / V) مصل الجنين البقري، 5٪ مصل العجل الوليد، والبنسلين (50 وحدة / مل)، بالإضافة إلى streptomycin). </li></ol> 3. جيل من مخزون الفيروسات إنتاج VSV-ز pseudotyped فيروس نقص المناعة البشرية عليها بنقل 293 خلايا (كما هو موضح في الشكل 1، الخطوة 1) 32-34. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم قبل ترنسفكأيشن، لوحة 293 الخلايا على الأطباق 100 مم في مناطق ذات كثافة من 1.5 × 10 6 خلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم ترنسفكأيشن، 293 بالنقل الخلايا مع 16 ميكروغرام من النوع البري أو متحولة فيروس نقص المناعة البشرية (pNLNgoMIVR - ΔLUC) و 4 ميكروغرام من VSV (pHCMV ز) باستخدام طريقة فوسفات الكالسيوم 35. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم إضافة ما يقرب من 6 ساعة بعد راسب فوسفات الكالسيوم، وغسل الخلايا مرتين مع 293 الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، واحتضان مع وسائل الإعلام الجديدة لمدة 48 ساعة. [تستكمل DMEM مع 5٪ (V / V) مصل الجنين البقري، 5٪ مصل العجل الوليد، والبنسلين (50 وحدة / مل)، بالإضافة إلى الستربتوميسين (50 ميكروغرام / مل)]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد الفيروس تحتوي على supernatants عن طريق إزالة وسائل الاعلام من 100 ممالأطباق، وتوضيح supernatants بواسطة الطرد المركزي في انخفاض سرعة 3،000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة، تحديد supernatants من خلال مرشح 45 ميكرون حجم المسام حقنة، علاج supernatants مع توربو الدناز لمدة 30 دقيقة في RT وتمييع supernatants في وسائل الإعلام لإعداد المقايسات في العدوى . تخزين supernatants الفيروسية المجمدة، في مأخوذة، في -80 درجة مئوية. ملاحظة: يتم تحديد المبلغ من P24 في طاف باستخدام HIV-1 P24 انزيم مرتبط المناعي طقم الفحص. ويستخدم تركيز P24 للسيطرة على كمية الفيروس في العينة. يتم إضافة ما يقرب من 500 نانوغرام من الفيروس إلى الخلايا ملتحقا مطلي على أطباق قطرها 60 ملم في مناطق ذات كثافة من 1.5 × 10 5 خلية / طبق في اليوم قبل العدوى. بعد ساعة 48 من الحضانة، ويتم حصاد الخلايا، التي تم جمعها بواسطة الطرد المركزي، وغسلها، ومعلق في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. إضافة مبلغ مساو من مراسل التلألؤ فحص الجينات كاشف وقياس luciferase النشاط كما هو موضح في الأقسام 5.4.1 و5.4.2. من هذا، يمكن إجراء التخفيف المناسب للفيروس كما نوقش في الخطوة 4.6. </li></ol> 4. فحص مركب في لوحات 96 جيد فحص كل مجمع في ثلاث نسخ ومتوسط ​​النتائج. ملاحظة: يتم تصحيح تأثير كل مركب على تكاثر الفيروس عن طريق تطبيع إلى مستوى النسخ المتماثل التي تم الحصول عليها في غياب أي مجمع. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد نطاق تركيز التجريبية ليتم عرضه. ملاحظة: عادة، يتم إجراء شاشات مع 11 التخفيفات المسلسل بإضافة مركب إلى العمود العمود وحة من قبل وشاشات مع 7 التخفيفات التسلسلي مصنوعة بإضافة المجمع حسب الصف. واحدة ثلاث نسخ مجموعة من الآبار يجب أن تكون محفوظة لمراقبة أي مجمع. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن يظل عمود واحد أو صف واحد فارغ لتكون بمثابة السيطرة السلبية / الخلفية. أخيرا، سواء كان السمسة الخلوية أو العدوى مقايسة سوف تملي إذا تم إضافة الفيروس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعدادالتخفيفات المسلسل من محلول المخزون 20 ملي. ويتم اختيار التركيزات اعتمادا على مجموعة العزم تجريبيا تركيزات لفحصها (كما هو موضح في الجدول رقم 1). تحضير التخفيفات في وسائل الإعلام في تركيز النهائي من 10X المطلوب، أي إذا كان تركيز النهائي سيكون 100 ميكرومتر، وجعل الأسهم العمل 1 ملم. ملاحظة: المركبات مع IC 50 ق 5-10 ميكرومتر أعلاه ليسوا مرشحين عادة ما تكون جيدة لتطوير العقاقير. في فحوصات أولية ونحن اختبار المركبات فقط ضد ناقلات WT. ثم يتم اختبار مركبات الواعدة التي تمنع بشكل فعال متجه WT ضد فريق من المسوخ مقاومة المخدرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة لوحات 96 جيدا من الحاضنة وإضافة التخفيفات التسلسلي للمركبات التي سيتم اختبارها في الآبار في ثلاث نسخ (كما هو موضح في الشكل 1، الخطوة 2). ملاحظة: حجم تضاف إلى البئر يجب أن يكون حجم 1/10 من تركيز النهائي. وهكذا، أضف 22 ميكرولتر / جيد (النهائي ع حجمبالإضافة إلى ذلك الفيروس معاهدة الفضاء الخارجي هو 220 ميكرولتر) لفحوصات العدوى. لفحوصات السمية الخلوية، إضافة 11 ميكرولتر / جيد (الحجم النهائي هو 110 ميكرولتر / جيد). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العودة لوحات 96 جيدا إلى الحاضنة. لشاشة السمسة الخلوية، واحتضان لوحات 96 جيد 48 ساعة على 37 درجة مئوية، وهناك حاجة إلى أي مزيد من التلاعب في البروتوكول 4: المضي قدما في البروتوكول 5 لفحوصات العدوى، ومواصلة اتباع الإرشادات الموجودة في البروتوكول 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فحوصات العدوى فقط. إزالة لوحات من الحاضنة بعد مدة لا تقل عن 3 ساعة الحضانة عند 37 درجة مئوية مع المركبات ليتم تحليلها. ملاحظة: هذا يسمح المجمع ليتم تناولها من قبل الخلايا قبل عدوى فيروس نقص المناعة البشرية مع ناقلات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد تخفيف الأسهم للفيروس 33 و 34 (عادة حوالي 1:3) التي من شأنها أن تنتج إشارة luciferase المراسل بين 0،2-1،5 وحدة luciferase المراسل النسبي (RLUs) في الخلايا غير المعالجة. سوف لوحة كامل يستغرق حوالي 10 مل من diluتيد الفيروس. إضافة 100 ميكرولتر من الفيروس إلى كل من الآبار، وذلك باستخدام إما 8 أو 12 الأقنية pipettor. لا تضيف الفيروس إلى آبار المراقبة السلبية / الخلفية. العودة إلى لوحات الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. ملاحظة: ل01:03 التخفيف من الأسهم الفيروس هو التخفيف النموذجية التي سوف تنتج إشارة luciferase المراسل بين 0.2 -1.5 RLUs على أساس مقايسة P24 تبين أن تركيز الفيروس في طاف ما يقرب من 500 نانوغرام في 1.0 مل. </li></ol> 5. إعداد وقياس السمسة والعدوى في لوحات 96 جيد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح وسائل الإعلام من الآبار (الفينول الحمراء في وسائل الإعلام يمكن أن تتداخل مع إشارة luciferase المراسل). استخدام ماصة الزجاج مع تلميح ماصة 200 ميكرولتر تعلق على نهاية. تبدأ في الجزء العلوي من وسائل الإعلام والعمل ببطء نحو الزاوية قاع البئر. لا تنفق الكثير من الوقت في قاع البئر، أو يمكن إزالة الخلايا من البئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني تستكمل مع 0.5 مترM MgCl 2 إلى كل بئر. هذا يجب القيام به فورا بعد إزالة وسائل الإعلام بحيث الخلايا لا تجف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فقط لفحوصات السمية الخلوية، إضافة 5 مل من العازلة الركيزة من كشف فحص التلألؤ ATP إلى كل قارورة من توفيره كاشف مجفف بالتجميد. واحد قارورة كافية لوحة 96 جيدا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكرولتر من العازلة تحلل الخلية من كشف فحص التلألؤ ATP إلى كل بئر. يهز جيدا لوحة 96 في 700 دورة في الدقيقة في RT لمدة 5 دقائق باستخدام thermomixer المدمجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكرولتر من إعادة تشكيل التلألؤ ATP كشف الفحص الكاشف لجميع الآبار باستثناء آبار المراقبة / خلفية سلبية. يهز في 700 دورة في الدقيقة عند درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق باستخدام thermomixer المدمجة. احتضان لوحات في RT لمدة 20 دقيقة لإتاحة الوقت لوضع إشارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قراءة لوحة 96 جيدا باستخدام luminometer صفيحة ميكروسكوبية. ملاحظة: فتح برو برنامج صفيحة ميكروسكوبية luminometer SoftMax. تأكد من تعيين luminometer لقياس وميnescence في حساسية من 5 قراءات / جيد. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فقط لفحوصات العدوى، إضافة 10 مل من العازلة الركيزة من الفحص الجيني مراسل التلألؤ إلى كل قارورة من توفيره كاشف مجفف بالتجميد. واحد قارورة كافية لكل لوحة 96 جيدا. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من إعادة تشكيل التلألؤ مراسل الفحص الجيني كاشف إلى كل بئر. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة لإتاحة الوقت لوضع إشارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قراءة لوحة 96 جيدا باستخدام luminometer صفيحة ميكروسكوبية كما يؤديها في القسم 5.3.3. </li></ol></li></ol> 6. تحديد CC 50 و 50 IC القيم للمركبات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل البيانات luciferase المراسل من luminometer صفيحة ميكروسكوبية في جداول اكسل. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البيانات luciferase المراسل في ثلاث نسخ والبيانات إشارة الخلفية / تحكم المتوسط ​​على حد سواء. طرح متوسط ​​إشارة الخلفية / تحكم عن متوسط ​​إشارة ثلاث نسخ لمجموعة تركيز كامل. </li> &lt;لى&gt; تطبيع الخلفية تصحيح متوسط ​​إشارة للنطاقات تركيز على النشاط، سواء كان السمسة أو العدوى، في غياب أي عنصر لتحديد تثبيط في المئة. ملاحظة: يتم تعريف المئة تثبيط كما luciferase النشاط في وجود المخدرات مقسوما على luciferase النشاط في غياب المخدرات مضروبا في 100. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام برنامج حاسوبي Kaleidagraph الحصول CC 50 و 50 IC القيم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل كل من مجموعة تركيز العزم تجريبيا في المئة وتثبيط luciferase النشاط في Kaleidagraph. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم البيانات مع مجموعة التركيز على المحور س وتثبيط في المئة من luciferase النشاط على المحور ص. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Mouton, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+protease+inhibitors+on+AIDS-defining+events+and+hospitalizations+in+10+French+AIDS+reference+centres.+Federation+National+des+Centres+de+Lutte+contre+le+SIDA.">Impact of protease inhibitors on AIDS-defining events and hospitalizations in 10 French AIDS reference centres. Federation National des Centres de Lutte contre le SIDA.</a> AIDS. , 101-105 (1997).</li><li>Hammer, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+controlled+trial+of+two+nucleoside+analogues+plus+indinavir+in+persons+with+human+immunodeficiency+virus+infection+and+CD4+cell+counts+of+200+per+cubic+millimeter+or+less+AIDS+Clinical+Trials+Group+320+Study+Team.">A controlled trial of two nucleoside analogues plus indinavir in persons with human immunodeficiency virus infection and CD4 cell counts of 200 per cubic millimeter or less AIDS Clinical Trials Group 320 Study Team.</a> New Eng. J. Med. 337, 725-733 (1997).</li><li>Hogg, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+survival+among+HIV-infected+patients+after+initiation+of+triple-drug+antiretroviral+regimens.">Improved survival among HIV-infected patients after initiation of triple-drug antiretroviral regimens.</a> Can. Med. Assoc. 160, 659-665 (1999).</li><li>Egger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+new+antiretroviral+combination+therapies+in+HIV+infected+patients+in+Switzerland:+prospective+multicentre+study.+Swiss+HIV+Cohort+Study.">Impact of new antiretroviral combination therapies in HIV infected patients in Switzerland: prospective multicentre study. Swiss HIV Cohort Study.</a> BMJ. 315, 1194-1199 (1997).</li><li>Gulick, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+with+indinavir,+zidovudine,+and+lamivudine+in+adults+with+human+immunodeficiency+virus+infection+and+prior+antiretroviral+therapy.">Treatment with indinavir, zidovudine, and lamivudine in adults with human immunodeficiency virus infection and prior antiretroviral therapy.</a> New Eng. J. Med. 337, 734-739 (1997).</li><li>Perelson, A. S., Neumann, A. U., Markowitz, M., Leonard, J. M., Ho, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+dynamics+in+vivo:+virion+clearance+rate,+infected+cell+life-span,+and+viral+generation+time.">HIV-1 dynamics in vivo: virion clearance rate, infected cell life-span, and viral generation time.</a> Science. 271, 1582-1586 (1996).</li><li>Simoni, J. M., Amico, K. R., Pearson, C. R., Malow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+promoting+adherence+to+antiretroviral+therapy:+a+review+of+the+literature.">Strategies for promoting adherence to antiretroviral therapy: a review of the literature.</a> Curr. Infect. Dis. Rep. 10, 515-521 (2008).</li><li>Simoni, J. M., Amico, K. R., Smith, L., Nelson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiretroviral+adherence+interventions:+translating+research+findings+to+the+real+world+clinic.">Antiretroviral adherence interventions: translating research findings to the real world clinic.</a> Curr. HIV/AIDS Rep. 7, 44-51 (2010).</li><li>Volberding, P. A., Deeks, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiretroviral+therapy+and+management+of+HIV+infection.">Antiretroviral therapy and management of HIV infection.</a> Lancet. 376, 49-62 (2010).</li><li>Acosta, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+to+assess+antiretroviral+target+trough+concentrations+using+in+vitro+susceptibility+data.">Novel method to assess antiretroviral target trough concentrations using in vitro susceptibility data.</a> Antimicr. 56, 5938-5945 (2012).</li><li>Rockstroh, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+treatment+with+raltegravir+or+efavirenz+combined+with+tenofovir/emtricitabine+for+treatment-naive+human+immunodeficiency+virus-1-infected+patients:+156-week+results+from+STARTMRK.">Long-term treatment with raltegravir or efavirenz combined with tenofovir/emtricitabine for treatment-naive human immunodeficiency virus-1-infected patients: 156-week results from STARTMRK.</a> Clin. Infect. Dis. 53, 807-816 (2011).</li><li>Fernandez-Montero, J. V., Eugenia, E., Barreiro, P., Labarga, P., Soriano, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiretroviral+drug-related+toxicities+-+clinical+spectrum,+prevention,+and+management.">Antiretroviral drug-related toxicities - clinical spectrum, prevention, and management.</a> Exp. Opin. Drug Safety. , (2013).</li><li>Lunzen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Once+daily+dolutegravir+(S/GSK1349572)+in+combination+therapy+in+antiretroviral-naive+adults+with+HIV:+planned+interim+48+week+results+from+SPRING-1,+a+dose-ranging,+randomised,+phase+2b+trial.">Once daily dolutegravir (S/GSK1349572) in combination therapy in antiretroviral-naive adults with HIV: planned interim 48 week results from SPRING-1, a dose-ranging, randomised, phase 2b trial.</a> Lancet Infect Dis. 12, 111-118 (2012).</li><li>Sax, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-formulated+elvitegravir,+cobicistat,+emtricitabine,+and+tenofovir+versus+co-formulated+efavirenz,+emtricitabine,+and+tenofovir+for+initial+treatment+of+HIV-1+infection:+a+randomised,+double-blind,+phase+3+trial,+analysis+of+results+after+48+weeks.">Co-formulated elvitegravir, cobicistat, emtricitabine, and tenofovir versus co-formulated efavirenz, emtricitabine, and tenofovir for initial treatment of HIV-1 infection: a randomised, double-blind, phase 3 trial, analysis of results after 48 weeks.</a> Lancet. 379, 2439-2448 (2012).</li><li>Sax, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abacavir/lamivudine+versus+tenofovir+DF/emtricitabine+as+part+of+combination+regimens+for+initial+treatment+of+HIV:+final+results.">Abacavir/lamivudine versus tenofovir DF/emtricitabine as part of combination regimens for initial treatment of HIV: final results.</a> Infect. Dis. 204, 1191-1201 (2011).</li><li>Kellam, P., Larder, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+virus+assay:+a+rapid,+phenotypic+assay+for+assessment+of+drug+susceptibility+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+isolates.">Recombinant virus assay: a rapid, phenotypic assay for assessment of drug susceptibility of human immunodeficiency virus type 1 isolates.</a> Antimicr. Agents Chemother. 38, 23-30 (1994).</li><li>Hertogs, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+simultaneous+detection+of+phenotypic+resistance+to+inhibitors+of+protease+and+reverse+transcriptase+in+recombinant+human+immunodeficiency+virus+type+1+isolates+from+patients+treated+with+antiretroviral+drugs.">A rapid method for simultaneous detection of phenotypic resistance to inhibitors of protease and reverse transcriptase in recombinant human immunodeficiency virus type 1 isolates from patients treated with antiretroviral drugs.</a> Antimicr. Agents Chemother. 42, 269-276 (1998).</li><li>Petropoulos, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+phenotypic+drug+susceptibility+assay+for+human+immunodeficiency+virus+type+1.">A novel phenotypic drug susceptibility assay for human immunodeficiency virus type 1.</a> Antimicr. Agents Chemother. 44, 920-928 (2000).</li><li>Engelman, A., Mizuuchi, K., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+DNA+integration:+mechanism+of+viral+DNA+cleavage+and+DNA+strand+transfer.">HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer.</a> Cell. 67, 1211-1221 (1991).</li><li>Hazuda, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+strand+transfer+that+prevent+integration+and+inhibit+HIV-1+replication+in+cells.">Inhibitors of strand transfer that prevent integration and inhibit HIV-1 replication in cells.</a> Science. 287, 646-650 (2000).</li><li>Nguyen, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raltegravir:+the+first+HIV-1+integrase+strand+transfer+inhibitor+in+the+HIV+armamentarium.">Raltegravir: the first HIV-1 integrase strand transfer inhibitor in the HIV armamentarium.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1222, 83-89 (2011).</li><li>Wills, T., Vega, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elvitegravir:+a+once-daily+inhibitor+of+HIV-1+integrase.">Elvitegravir: a once-daily inhibitor of HIV-1 integrase.</a> Exp. Opin. Invest. Drugs. 21, 395-401 (2012).</li><li>Kobayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+antiretroviral+properties+of+S/GSK1349572,+a+next-generation+HIV+integrase+inhibitor.">In Vitro antiretroviral properties of S/GSK1349572, a next-generation HIV integrase inhibitor.</a> Antimicr. Agents Chemother. 55, 813-821 (2011).</li><li>Cooper, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subgroup+and+resistance+analyses+of+raltegravir+for+resistant+HIV-1+infection.+Eng.">Subgroup and resistance analyses of raltegravir for resistant HIV-1 infection. Eng.</a> J. Med. 359, 355-365 (2008).</li><li>Briz, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raltegravir+and+etravirine+are+active+against+HIV+type+1+group+O.">Raltegravir and etravirine are active against HIV type 1 group O.</a> AIDS Res.Human Retroviruses. 25, 225-227 (2009).</li><li>Fransen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+raltegravir+susceptibility+by+human+immunodeficiency+virus+type+1+is+conferred+via+multiple+nonoverlapping+genetic+pathways.">Loss of raltegravir susceptibility by human immunodeficiency virus type 1 is conferred via multiple nonoverlapping genetic pathways.</a> J. Virol. 83, 11440-11446 (2009).</li><li>Goethals, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+mutations+selected+in+vitro+with+raltegravir+confer+large+fold+changes+in+susceptibility+to+first-generation+integrase+inhibitors,+but+minor+fold+changes+to+inhibitors+with+second-generation+resistance+profiles.">Primary mutations selected in vitro with raltegravir confer large fold changes in susceptibility to first-generation integrase inhibitors, but minor fold changes to inhibitors with second-generation resistance profiles.</a> Virology. 402, 338-346 (2010).</li><li>Goethals, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+mutations+in+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase+selected+with+elvitegravir+confer+reduced+susceptibility+to+a+wide+range+of+integrase+inhibitors.">Resistance mutations in human immunodeficiency virus type 1 integrase selected with elvitegravir confer reduced susceptibility to a wide range of integrase inhibitors.</a> J. Virol. 82, 10366-10374 (2008).</li><li>Canducci, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+patterns+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase+gene+evolution+in+patients+failing+raltegravir-based+salvage+therapies.">Dynamic patterns of human immunodeficiency virus type 1 integrase gene evolution in patients failing raltegravir-based salvage therapies.</a> AIDS. 23, 455-460 (2009).</li><li>Ceccherini-Silberstein, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+structural+analysis+of+HIV-1+integrase+conservation.">Characterization and structural analysis of HIV-1 integrase conservation.</a> AIDS Rev. 11, 17-29 (2009).</li><li>Charpentier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+resistance+profiles+for+the+HIV+integrase+gene+in+patients+failing+raltegravir+salvage+therapy.">Drug resistance profiles for the HIV integrase gene in patients failing raltegravir salvage therapy.</a> HIV Med. 9, 765-770 (2008).</li><li>Julias, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+mutations+in+the+G+tract+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+polypurine+tract+on+virus+replication+and+RNase+H+cleavage.">Effects of mutations in the G tract of the human immunodeficiency virus type 1 polypurine tract on virus replication and RNase H cleavage.</a> J. Virol. 78, 13315-13324 (2004).</li><li>Hare, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+analyses+of+the+second-generation+integrase+strand+transfer+inhibitor+dolutegravir+(S/GSK1349572).">Structural and functional analyses of the second-generation integrase strand transfer inhibitor dolutegravir (S/GSK1349572).</a> Mol. Pharmacol. 80, 565-572 (2011).</li><li>Adachi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+acquired+immunodeficiency+syndrome-associated+retrovirus+in+human+and+nonhuman+cells+transfected+with+an+infectious+molecular+clone.">Production of acquired immunodeficiency syndrome-associated retrovirus in human and nonhuman cells transfected with an infectious molecular clone.</a> J. Virol. 59, 284-291 (1986).</li><li>Kemp, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+polymorphism+at+codon+333+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+reverse+transcriptase+can+facilitate+dual+resistance+to+zidovudine+and+L-2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine.">A novel polymorphism at codon 333 of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase can facilitate dual resistance to zidovudine and L-2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine.</a> J. Virol. 72, 5093-5098 (1998).</li><li>Butler, S. L., Hansen, M. S., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+assay+for+HIV+DNA+integration+in+vivo.">A quantitative assay for HIV DNA integration in vivo.</a> Nat. Med. 7, 631-634 (2001).</li><li>Brussel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+monitoring+of+2-long+terminal+repeat+circles+in+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+patients+with+chronic+HIV-1+infection.">Longitudinal monitoring of 2-long terminal repeat circles in peripheral blood mononuclear cells from patients with chronic HIV-1 infection.</a> AIDS. 17, 645-652 (2003).</li><li>Daelemans, D., Pauwels, R., De Clercq, E., Pannecouque, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-of-drug+addition+approach+to+target+identification+of+antiviral+compounds.">A time-of-drug addition approach to target identification of antiviral compounds.</a> Nat. Protoc. 6, 925-933 (2011).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

نحن تصف مقايسة سريعة وفعالة، وقابلة للتكرار والتي يمكن استخدامها لمركبات الشاشة من أجل سمية الخلايا وقدرتها على منع تكرار كلا WT ومقاومة HIV-1 المخدرات. القدرة على التعرف بسرعة المركبات واختبار فعاليتها والسمسة أمر بالغ الأهمية في تطوير عقاقير جديدة ومحسنة ضد HIV-1. مرة واحدة يتم تحديد مركبات الرصاص، نظائرها من مركب الرصاص يمكن أن تنتج واختبارها باستخدام نفس الفحص. مقايسة بسيطة نسبيا. هناك على حد سواء الضوابط الإيجابية والسلبية التي تسمح للمستخدم لتشخيص المشاكل الأكثر شيوعا (المركبات السامة، ومشاكل مع الأسهم ناقلات). استخدام مجموعة من الآبار ثلاث نسخ مع عدم وجود مجمع أضاف يدل على أن العدوى الفيروسية قد حدث. حقيقة أن السمسة يقاس مقايسة مستقلة يتجنب إساءة تفسير انخفاض في luciferase المراسل الناجمة عن سمية الخلايا كأثر محددة على تكاثر الفيروس. الخطوات الحاسمةفي بروتوكول يستعدون لوحات بحيث يتم توزيع الخلايا بشكل موحد في الآبار، أن الآبار لديهم تركيزات السليم للمركبات لفحصها، مضيفا نفس كمية الفيروس إلى كل من الآبار، وقياس luciferase النشاط ل تحديد CC 50 و 50 IC القيم. الفحص آمن، الكمية، وقابلة للتكرار. مقايسة آمنة لأن ناقلات هي تكرار معيب. الفحص هو كمية وقابلة للتكرار لأنه يقوم على ناقلات جولة واحدة التي تعبر عن luciferase المراسل، والتي يمكن أن يعاير بدقة وسهولة. في الجولة متعددة تكاثر الفيروس مقايسة، وIC قياس 50 يعتمد على عدد من دورات الحياة الفيروسية؛ هذه مشكلة خاصة عندما تنطوي على حد سواء المقايسات WT والفيروسات المقاومة للأدوية التي قد يكون لها قدرات مختلفة تكرارها بشكل كبير. هناك عدة فحوصات تم الأنزيمية ذكرت سابقا التي يمكن أنأن تستخدم للكشف عن مثبطات IN. المقايسات التي تنطوي في الوقت الحقيقي PCR التكنولوجيا لقياس الحمض النووي المتكاملة تتطلب تنقية البروتينات المؤتلف (ق)، ويتم، بشكل عام، على حد سواء أكثر كثيفة العمالة ومكلفة 36، 37. على الرغم من أنه من الممكن استخدام المقايسات الأنزيمية لقياس تأثير المركبات على الانزيمات الفيروسية الأخرى (RT والبروتيني)، يتطلب كل انزيم نظام الفحص الخاصة بها. ناقلات فحص جولة واحدة، كما هو موضح، ويمكن استخدامها، دون تعديل، للكشف عن مثبطات RT. A مقايسة مماثلة يمكن استخدامها للكشف عن مثبطات الأنزيم البروتيني؛ ومع ذلك، في مقايسة مثبط البروتياز، ويجب أن يضاف المركبات إلى الخلايا المستخدمة لإنتاج النواقل. A الفحص ذات الصلة، باستخدام خلايا وناقلات مختلفة، ويمكن أن تستخدم أيضا للكشف عن الظرف (الحياة الفطرية) وفيروس نقص المناعة البشرية مثبطات الانصهار الدخول. وأخيرا، فإن الفحص يمكن استخدامها، وعلى نطاق أوسع، مع موزعات الآلية المؤتمتة. وبالتالي، فإن الفحص يمكن استخدامه للكشف مكتبات كبيرة من المركبات ضد WT ومutant فيروس نقص المناعة البشرية. ومع ذلك، فإن حقيقة الفحص يمكن الكشف عن المانع من تكرار فيروس نقص المناعة البشرية التي تعمل في مختلف مراحل الفيروسية النقاط دورة الحياة إلى وجود قيود في تفسير البيانات. في حد ذاته لا يحدد الفحص الذي يتم حظر خطوة في دورة الحياة من قبل المجمع. إذا دعت هذا السؤال، فإنه لا يمكن حلها باستخدام وقت فحوصات بالإضافة إلى ذلك 38، واختبار مركب ضد البروتينات الفيروسية المؤتلف المنقى. للأسف، على الرغم من نجاح العقاقير المضادة بفيروس نقص المناعة البشرية، لا تزال هناك مشاكل مع كل من المقاومة وسمية. في غياب لقاح فعال لمكافحة فيروس نقص المناعة البشرية، هناك حاجة ليس فقط إلى تطوير عقاقير علاجية جديدة من شأنها أن تكون فعالة ضد المسوخ مقاومة للأدوية الموجودة، ولكن أيضا لتطوير أدوية وقائية التي يمكن أن تقلل من انتشار الفيروس. إذا كان الاستخدام الوقائي للعقاقير المضادة بفيروس نقص المناعة البشرية incudes معاملة الناس المعافين، وهذا النهج عبئا خاصا على تطوير العقاقير التي يكون لإيتل أو لا سمية على المدى الطويل.

وقد أدى توافر العقاقير تستهدف عدة خطوات أساسية في دورة الحياة الفيروسية HIV-1 إلى الجمع بين العلاج المخدرات (وتسمى العلاج نشطة للغاية المضادة للفيروسات الرجعية، أو خليط عقاقير هارت) الذي تحسن كبير في علاج HIV-1 والالتهابات، والبقاء على قيد الحياة على المدى الطويل من المرضى. خليط عقاقير هارت، والذي يستخدم عادة مزيج من اثنين نوكليوزيد الناسخ العكسي (RT) مثبطات وإما مثبط البروتياز أو مثبط غير نوكليوزيد RT، حولت الآن المرض الفتاك في حياة طويلة حالة 1-5. ومع ذلك، على الرغم من العديد من النجاحات من خليط عقاقير هارت في قمع متواصلة من تكاثر الفيروس، له حدود. HAART لا قضاء على فيروس نقص المناعة البشرية، لذلك لا يشفى المرضى والعلاج هو حياة طويلة. هناك مشاكل مع سمية الدواء ومع ظهور سلالات مقاومة للأدوية. المقاومة يمكن أن تنشأ لجميع من وافق الأدوية المضادة بفيروس نقص المناعة البشرية، بما في ذلك الأدوية المعتمدة حديثا والتي تستهدف integrase فيروس نقص المناعة البشرية (IN). مقاومة العقاقير المرجح تنشأ بيكااستخدام الطفرات العفوية التي تحدث أثناء تكاثر الفيروس (نسبة الخطأ 3 × 10 -5 الطفرات دورة / القاعدة / النسخ المتماثل) 6. عندما تنشأ طفرات في الجينات الترميز لأهداف العقاقير المضادة للفيروسات الرجعية، ومجموعة فرعية صغيرة من هذه الطفرات تؤدي إلى انخفاض في قابلية السلالة الفيروسية للعقاقير. لتجنب نشوء مقاومة للعقاقير، لا بد من الحفاظ على مستويات تركيزات المخدرات التي تقمع بشكل كامل تكرار فيروس نقص المناعة البشرية. الفقراء الالتزام بالنظام العلاجي يزيد من تفاقم المشكلة، ويمكن أن يؤدي إلى التطور السريع للمقاومة 7-9. على الرغم من أن تركيزات الدواء في المرضى الذين يمكن أن تختلف بسبب اختلاف امتصاص والتمثيل الغذائي، والتوزيع، ومستويات إفراز، يمكن أن تركيزات عالية المخدرات يؤدي إلى سمية 10. منذ العلاج يستمر لحياة المريض، وهناك مخاوف جدية حول سلامة سمية على المدى الطويل من مكافحة الفيروسات. مكافحة الفيروسات التي يشيع استخدامها في خليط عقاقير هارت يمكن أن يكون لها آثار سلبية علىالثانية كانت هناك حالات حيث الآثار الجانبية التي تهدد الحياة وقد 11-15. مشاكل تواجه المرضى مع تطور المقاومة وسمية تكمن وراء الحاجة إلى تطوير أدوية جديدة التي تمنع بشكل فعال تكرار سلالات مقاومة المخدرات شيوعا من الفيروس مع سمية قليلة أو معدومة على المدى الطويل. وبالتالي، هناك حاجة لفحص الشاشة التي يمكن للمركبات التي تعمل على منع خطوات أساسية في دورة الحياة الفيروسية بسرعة. نحن هنا تصف مقايسة كفاءة التي يمكن استخدامها لتقييم السمسة من المركبات وقدرتها على منع تكرار كلا WT وسلالات فيروس نقص المناعة البشرية المقاوم للأدوية بسرعة وكفاءة. الفحص التي نستخدمها هي مماثلة لمقايسة التي تم تطويرها للكشف عن الفيروسات المقاومة للأدوية في عزل المرضى من 16-18. على الرغم من أن الفحص يمكن استخدامها دون تعديل للكشف عن المركبات التي يمكن منع فيروس نقص المناعة البشرية النسخ العكسي، ونحن سوف descrمتد باستخدام مقايسة لتقييم IN مثبطات. في هو انزيم الفيروسية الضروري أن يدرج الحمض النووي الفيروسي في جينوم الخلوية 19. على الرغم من أن عددا من واعدة في مثبطات يجري تطويرها، وبعضها يخضع حاليا لتجارب سريرية، Isentress فقط 20، 21 (المعروف أيضا باسم Raltegravir أو RAL) ومؤخرا، Elvitegravir (EVG) 22 وDolutegravir (DTG) 23 كانت التي وافقت عليها ادارة الاغذية والعقاقير. هذه المركبات هي فعالة ضد فيروس نقص المناعة البشرية على حد سواء B وأنواع فرعية غير B في خلية ثقافة والمرضى في 24 و 25. ومع ذلك، والمعاملة مع راؤول يختار لالمقاوم للأدوية HIV-1 في المسوخ، بما في ذلك Y143R، N155H، وG140S/Q148H 24، 26-31. N155H وG140S/Q148H أيضا أن يقلل من فعالية EVG، وهو ما يؤكد على الحاجة لتصميم وتطوير الجيل الثاني في مثبطات نقل حبلا (INSTIs) التي هي فعالة ضد هذه الطفرات المقاومة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="659">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D2650</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:157px;">Corning Cellgro</td>
			<td style="width:119px;">10-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ATPlite Luminescence ATP Detection Assay System</td>
			<td style="width:157px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">6016941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Steady Lite Plus High Sensitivity Luminescence Reporter Gene Assay System</td>
			<td style="width:157px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">6016751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dulbecco&#39;s PBS</td>
			<td style="width:157px;">Gibco-Life Technologies-Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">14190-136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SpectraMax Gemini EM</td>
			<td style="width:157px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KaleidaGraph</td>
			<td style="width:157px;">Synergy Software</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nunc F96 Microwell White Polystyrene Plate</td>
			<td style="width:157px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-566-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Eppendorf Thermomixer Compact</td>
			<td style="width:157px;">Sigma Alrich</td>
			<td style="width:119px;">T1442-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Turbo Dnase</td>
			<td style="width:157px;">Ambion-Life Technologies-Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Millex HA Filter Unit, 0.45 &#181;M</td>
			<td style="width:157px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SLAHA033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alliance HIV-1 p24 Elisa Kit</td>
			<td style="width:157px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">NEK050B001KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HOS cells</td>
			<td style="width:157px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-1543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TZM-bl cells</td>
			<td style="width:157px;">NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td style="width:119px;">8129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">pNL4.3&#916;Env.LUC</td>
			<td style="width:157px;">NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">VSV-G</td>
			<td style="width:157px;">NIH-NCI HIV Drug Resistance Program- Hughes Lab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SoftMax Pro</td>
			<td style="width:157px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">0200-310</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid screening of hiv reverse transcriptase and integrase inhibitors

على الرغم من أن تم الموافقة على عدد من العقاقير المضادة بفيروس نقص المناعة البشرية، لا تزال هناك مشاكل مع سمية والمقاومة للعقاقير. هذا يدل على الحاجة إلى تحديد المركبات الجديدة التي يمكن أن تمنع الإصابة من قبل المقاومة للأدوية الشائعة HIV-1 مع الحد الأدنى من السلالات السمية. نحن هنا تصف مقايسة كفاءة التي يمكن استخدامها لتحديد بسرعة السمسة الخلوية وفعالية من مركب ضد سلالات فيروسية WT ومتحولة. والمصنفة خط الخلية الهدف المنشود في لوحة 96 جيدا، وبعد الحضانة 24 ساعة، تضاف متسلسل التخفيفات من المركبات لفحصها. لا مزيد من التلاعب ضرورية لفحوصات السمسة الخلوية؛ لمكافحة فيروس نقص المناعة البشرية المقايسات كمية محددة سلفا إما WT أو المخدرات مقاومة HIV-1 النواقل التي تعبر يضاف luciferase المراسل إلى الخلايا. يتم قياس سمية الخلايا باستخدام ATP تعتمد مقايسة التألق وتأثير المركبات على العدوى تقاس تحديد مبلغ lucifeRASE في وجود أو غياب مثبطات المفترضة. هذا الاختبار فحص يستغرق 4 أيام لاستكمال والمركبات متعددة يمكن فرزهم في نفس الوقت. يتم فحص المركبات في ثلاث نسخ والبيانات هي تطبيع لمستويات العدوى / ATP في غياب المركبات المستهدفة. توفر هذه التقنية لقياس سريع ودقيق للفعالية وسمية من المركبات المضادة المحتملة بفيروس نقص المناعة البشرية.

إذا كان فحص (الشكل 1، الخطوتين 1 و 2) وقد أجريت بنجاح، ثم القيم luciferase المراسل يجب أن يشبه البيانات الواردة في الجدول 2 المسح الضوئي عبر مجموعة التركيز.؛ سوف مركب يحتمل أن تكون قوية تكشف عن زيادة luciferase النشاط من اليسار إلى اليمين، ويجب أن يكون التحكم في أعلى luciferase النشاط. إذا لم luciferase النشاط تتجاوز 0.1 وحدات luciferase المراسل النسبية (RLUs) عبر مجموعة التركيز، وهذا عادة ما يشير إلى أن مجمع قتل الخلايا. إذا كانت البيانات luciferase المراسل أكبر من أو يساوي 2.0 RLUs في جميع التخفيفات التسلسلي، ثم كانت المركبات غير قادرة على منع العدوى بفيروس نقص المناعة البشرية 1 في تركيزات التي تم اختبارها. التآمر تركيز مركبات مقابل تثبيط في المئة من luciferase النشاط في Kaleidagraph (الجدول 3، الجزء ألف)، وبعد إجراء تحليل الانحدار الخطي، وسوف تنتج نتائج مماثلة لر<html> خرطوم هو مبين في الجدول 3، الجزء باء. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51400/51400fig1highres.jpg" width="500" /> الشكل 1. إعداد HIV-1 أسهم الفيروسية وإعداد الخلوي السمسة وجولة واحدة العدوى فحوصات. في الخطوة 1، و transfected الخلايا 293T مع pNL4.3ΔEnv.LUC وVSV-G والمحتضنة لمدة 48 ساعة لإنتاج الفيروس 34 . يتم حصاد الفيروس وتخزينها (المجمدة في -80 درجة مئوية في مأخوذة) حتى يتم استخدامها في فحوصات العدوى. لخطوة 2، هي المصنفة الخلايا ملتحقا في لوحة 96 جيدا والمحتضنة لمدة 24 ساعة. ثم يتم preincubated الخلايا مع التخفيفات التسلسلي للمركبات التي سيتم اختبارها لمدة 3 ساعة ثم المصابين بفيروس (إما WT أو مقاومة المخدرات). بعد الحضانة 48 ساعة، ويتم قياس luciferase النشاط. le1.jpg &quot;العرض =&quot; 300 &quot;/&gt; الجدول 1. فحص المخدرات المسلسل التخفيف النموذج. ينطوي على فحص أكثر صرامة 11 التخفيفات المتسلسلة التي تبدأ عادة في 10 ميكرومتر ويغلق عند مستوى 0.0005 ميكرومتر. يتم إعداد التخفيفات المسلسل 10X؛ هناك 100 ميكرولتر من الخلايا و100 ميكرولتر من الفيروس في كل بئر). في هذا الكتاب، وبعد هذه الحسابات، فإن التخفيفات التسلسلي يكون كافيا ل3 صفوف من كامل وحة 96 جيدا. يتم إعداد المقايسات السمسة بالمثل؛ ولكن 11 التخفيفات المسلسل تبدأ في 250 ميكرومتر ويغلق عند 0.05 ميكرومتر. تضاف فقط 11 ميكرولتر من التخفيفات إلى الآبار في لوحة تحتوي على 100 ​​ميكرولتر من الخلايا. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51400/51400table1.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الجدول 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51400/51400table2.jpg" width="600" /><br/&gt; الجدول 2. luciferase المراسل الإشارة قراءة البيانات وتحديد نسبة تثبيط luciferase المراسل آخر. يبين الجدول البيانات مجموعة نموذجية من البيانات luciferase المراسل لمجمع ناجحة. ويبين الجدول أيضا الحسابات الإضافية اللازمة لتحديد تثبيط في المئة من luciferase النشاط وCC 50 و 50 IC القيم. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51400/51400table2.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الجدول 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51400/51400table3.jpg" width="600" /> الجدول 3. الانحدار الخطي تحليل بيانات الجدول. الجزء ألف. والرسوم البيانية نطاق التركيز المستخدم مقابل تثبيط في المئة من luciferase النشاط في Kaleidagraph إنتاج منحنيات تثبيط المناسبة. الجزء باء، يتم تعريف المنحنيات تثبيط من قبل حدودي 3وظيفة السيني وتناسب إلى البيانات عن طريق تحليل الانحدار الخطي 18. ثم يتم استخدام هذا الجدول البيانات بالتزامن مع Microsoft Excel لحساب تركيزات المخدرات اللازمة لمنع الفيروس والتكامل السمسة الخلوية بنسبة 50٪، على سبيل المثال IC 50 و 50 CC. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51400/51400table3.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors at JoVE.com

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

نحن هنا وصف السمسة الخلوية واحد المقايسات العدوى الجولة التي تتيح لفحص سريع ودقيق من المركبات لتحديد السمسة الخلوية الخاصة بهم (CC 50) وIC 50 ضد القيم WT ومقاومة HIV-1 المخدرات.

الفحص السريع للفيروس نقص المناعة البشرية والناسخ العكسي مثبطات Integrase

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

rapid-screening-of-hiv-reverse-transcriptase-and-integrase-inhibitors

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.7K Views.  National Cancer Institute.  نحن هنا وصف السمسة الخلوية واحد المقايسات العدوى الجولة التي تتيح لفحص سريع ودقيق من المركبات لتحديد السمسة الخلوية الخاصة بهم (CC 50) وIC 50 ضد القيم WT ومقاومة HIV-1 المخدرات. 

Video: Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using fluorescence video microscopy. To track the movements of the human immunodeficiency virus core protein during cell-to-cell transmission of human immunodeficiency virus, we have GFP-tagged the Gag protein in the context of an infectious molecular clone of HIV, called HIV Gag-iGFP. We study this viral clone using video confocal microscopy. In the following visualized experiment, we transfect a human T cell line with HIV Gag-iGFP, and we use fluorescently labeled uninfected CD4+ T cells to serve as target cells for the virus. Using the different fluorescent labels we can readily follow viral production and transport across intercellular structures called virological synapses. Simple gas permeable imaging chambers allow us to observe synapses with live confocal microscopy from minutes to days. These approaches can be used to track viral proteins as they move in from one cell to the next.

This visualized experiment is a guide for utilizing a fluorescent molecular clone of HIV for live confocal imaging experiments.

تصور الخلية إلى خلية نقل فيروس نقص المناعة البشرية باستخدام النسخ نيون فيروس نقص المناعة البشرية ومتحد البؤر المجهري لايف

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

مزيج من الشريط اللاصق على أساس أخذ العينات والإسفار في الموقع تهجين للكشف السريع عن السالمونيلا على المنتجات الطازجة

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

الاستدلال الوراثي من HIV - 1 Tropism باستخدام السكان على أساس تسلسل V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

Uncoating في المختبر من HIV - 1 النوى

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close person-to-person contact cannot be avoided 1, 2. During the last few years an increase in the incidence of outbreaks in hospitals has been reported, causing significant disruptions to their operational capacity as well as large economic losses. The identification of new antiviral approaches has been limited due to the inability of human noroviruses to complete a productive infection in cell culture 3. The recent isolation of a murine norovirus (MNV), closely related to human norovirus 4 but which can be propagated in cells 5 has opened new avenues for the investigation of these pathogens 6, 7. 
MNV replication results in the synthesis of new positive sense genomic and subgenomic RNA molecules, the latter of which corresponds to the last third of the viral genome (Figure 1). MNV contains four different open reading frames (ORFs), of which ORF1 occupies most of the genome and encodes seven non-structural proteins (NS1-7) released from a polyprotein precursor. ORF2 and ORF3 are contained within the subgenomic RNA region and encode the capsid proteins (VP1 and VP2, respectively) (Figure 1). Recently, we have identified that additional ORF4 overlapping ORF2 but in a different reading frame is functional and encodes for a mitochondrial localised virulence factor (VF1) 8.
Replication for positive sense RNA viruses, including noroviruses, takes place in the cytoplasm resulting in the synthesis of new uncapped RNA genomes. To promote viral translation, viruses exploit different strategies aimed at recruiting the cellular protein synthesis machinery 9-11. Interestingly, norovirus translation is driven by the multifunctional viral protein-primer VPg covalently linked to the 5' end of both genomic and subgenomic RNAs 12-14. This sophisticated mechanism of translation is likely to be a major factor in the limited efficiency of viral recovery by conventional reverse genetics approaches. 
Here we report two different strategies based on the generation of murine norovirus-1 (referred to as MNV herewith) transcripts capped at the 5' end. One of the methods involves both in vitro synthesis and capping of viral RNA, whereas the second approach entails the transcription of MNV cDNA in cells expressing T7 RNA polymerase. The availability of these reverse genetics systems for the study of MNV and a small animal model has provided an unprecedented ability to dissect the role of viral sequences in replication and pathogenesis 15-17.

Noroviruses are a major cause of gastroenteritis yet molecular techniques for their characterisation are still relatively new. Here we report two different reverse genetics approaches for the efficient recovery of murine norovirus (MNV), the only member of this genus which can be propagated in cell culture.

علم الوراثة العكسية الاسترداد بوساطة من نوروفيروس الفئران المعدية

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close ...

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat because of increased worldwide exchanges and human populations penetrating more and more natural ecosystems. A good example of such an emerging situation is chikungunya virus epidemics of 2005-2006 in the Indian Ocean. Recent progresses in our understanding of cellular pathways controlling viral replication suggest that compounds targeting host cell functions, rather than the virus itself, could inhibit a large panel of RNA viruses. Some broad-spectrum antiviral compounds have been identified with host target-oriented assays. However, measuring the inhibition of viral replication in cell cultures using reduction of cytopathic effects as a readout still represents a paramount screening strategy. Such functional screens have been greatly improved by the development of recombinant viruses expressing reporter enzymes capable of bioluminescence such as luciferase. In the present report, we detail a high-throughput screening pipeline, which combines recombinant measles and chikungunya viruses with cellular viability assays, to identify compounds with a broad-spectrum antiviral profile.

In vitro assays to measure virus replication have been greatly improved by the development of recombinant RNA viruses expressing luciferase or other enzymes capable of bioluminescence. Here we detail a high-throughput screening pipeline that combines such recombinant strains of measles and chikungunya viruses to isolate broad-spectrum antivirals from chemical libraries.

الإنتاجية العالية للفحص واسع الطيف الكيميائية مثبطات الحمض النووي الريبي الفيروسات

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral proteins involved in the regulation of the virus activity recognize several nucleic acids. The nucleocapsid protein NCp7 (NC) is a key protein regulating several processes during virus replication. NC is in fact a chaperone destabilizing the secondary structures of RNA and DNA and facilitating their annealing. The inactivation of NC is a new approach and an interesting target for anti-HIV therapy. The Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) assay was developed to identify molecules able to inhibit the melting and annealing of RNA and DNA folded in thermodynamically stable tridimensional conformations, such as hairpin structures of TAR and cTAR elements of HIV, by the nucleocapsid protein of HIV-1. The new assay employs either the recombinant or the synthetic protein, and oligonucleotides without the need of their previous labeling. The analysis of the results is achieved by standard polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by conventional nucleic acid staining. The protocol reported in this work describes how to perform the NAME assay with the full-length protein or its truncated version lacking the basic N-terminal domain, both competent as nucleic acids chaperones, and how to assess the inhibition of NC chaperone activity by a threading intercalator. Moreover, NAME can be performed in two different modes, useful to obtain indications on the putative mechanism of action of the identified NC inhibitors.

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

قفيصة منواة التليين بوساطة الكهربائي (NAME) الفحص يسمح للتحديد السريع لHIV-1 قفيصة منواة مثبطات

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

عزل Exosomes من البلازما من HIV-1 الأفراد ايجابية

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

نظام لفعالية والسمسة فحص مثبطات استهداف بين الخلايا<em&gt; المتفطرة السلية</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 has been linked to both waterborne and foodborne illnesses, and remains a threat despite the food- and water-screening methods used currently. While conventional bacterial detection methods, such as polymerase chain reaction (PCR) and enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) can specifically detect pathogenic contaminants, they require extensive sample preparation and lengthy waiting periods. In addition, these practices demand sophisticated laboratory instruments and settings, and must be executed by trained professionals. Herein, a protocol is proposed for a simpler diagnostic technique that features the unique combination of magnetic and fluorescent parameters in a nanoparticle-based platform. The proposed multiparametric magneto-fluorescent nanosensors (MFnS) can detect E. coli O157:H7 contamination with as little as 1 colony-forming unit present in solution within less than 1 h. Furthermore, the ability of MFnS to remain highly functional in complex media such as milk and lake water has been verified. Additional specificity assays were also used to demonstrate the ability of MFnS to only detect the specific target bacteria, even in the presence of similar bacterial species. The pairing of magnetic and fluorescent modalities allows for the detection and quantification of pathogen contamination in a wide range of concentrations, exhibiting its high performance in both early- and late-stage contamination detection. The effectiveness, affordability, and portability of the MFnS make them an ideal candidate for point-of-care screening for bacterial contaminants in a wide range of settings, from aquatic reservoirs to commercially packaged foods.

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

The overall goal of this protocol is to synthesize functional nanosensors for the portable, cost-effective, and rapid detection of specifically targeted pathogenic bacteria through a combination of magnetic relaxation and fluorescence emission modalities.

الفحص السريع للفيروس نقص المناعة البشرية والناسخ العكسي مثبطات Integrase

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video