يعترف واضعو Leducq مؤسسة (التاجي) والوكالة الوطنية صب لا بحوث (منح وكالة الاستخبارات الوطنية Specistem) لتمويل هذا البحث.

1. إعداد إجراءات الحيوان الحصول على موافقة من لجنة أخلاقية الحيوانية واتباع المبادئ التوجيهية المؤسسية للعمل مع الفيروس، HuESC و / أو التوجيهية (عند الاقتضاء)، وكذلك التعامل مع الماوس، والحصول على أجنة الفئران، وإجراء العمليات الجراحية الماوس. لتوقيت التزاوج، وتعتبر اليوم من المكونات اليوم الجنينية (E) 0.5 / 0.5 أيام تال للجماع. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإبر حقن مكروي: لالسابقين الرحم حقن مكروي، وسحب الماصات الزجاج (1.2 ملم أنابيب قطرها الخارجي البورسليكات الشعرية) باستخدام مجتذب ماصة / beveller للحصول على 1 أو 10 ميكرون قطر الحافة الداخلية وحادة ومخروطي الشكل تلميح لحقن الحمض النووي أو الخلايا، على التوالي. لحقن بوساطة الموجات فوق الصوتية، واستخدام الإبر المعقمة المخصصة، والتي يبلغ قطرها الخارجي / الداخلي (OD / ID) من 1.14 مم mm/0.53، مع تلميح 50/35 ميكرون OD / ID. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السيليكون مملوءة أطباق بتري: إعداد السيليكون كما هو موضح في الدليل. شغلطبق بتري زجاجي نظيف 60 مم مع طبقة من المطاط الصناعي ~ 1 سم. تجنب فقاعات الهواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأدوات: إبقاء جميع الأدوات الجراحية المعقمة قبل وأثناء العملية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحمض النووي: إضافة 3 ميكروغرام DNA و 12 ميكرولتر غروب MEM في أنبوب واحد. إضافة 3 ميكرولتر Lipofectamine 2000 و 12 ميكرولتر غروب MEM في أنبوب آخر. احتضان لمدة 5 دقائق على RT وتخلط كل من الحلول. استخدامها على الفور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الخلايا: إعداد تعليق 10 6 خلية / مل DMEM (Dulbecco والنسر متوسطة، ارتفاع نسبة الجلوكوز و 50٪ مصل الفئران). 50 ميكرولتر من تعليق خلية النهائية يكفي لمدة 8-10 الأجنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صبغ إعداد: استخدام الفلورية الخضراء CDCFDA-SE بنسبة 25 ملغ / مل DMSO. إعداد 20 ميكرولتر مأخوذة وتخزينها في -20 درجة مئوية. تمييع 1:100 / 1:200 في ملحي معقم أو برنامج تلفزيوني قبل الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الفيروس: استخدام الجيل الثالث 3-PGK التجارية، معربا عن GFP الفيروسة البطيئة مع عيار 9 ~ 10 -10 10 هيئة تنظيم الاتصالاتnsducing وحدة / مل DMEM. لإعداد الفيروسة البطيئة، انظر Tiscornia وآخرون 14 ارتداء معدات الوقاية الشخصية واستخدام بأمان والتخلص من الفيروس. </li></ol> 2. جمع E9.5 E10.5 الأجنة وللخارج الحي حقن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء ماوس حاملا في اليوم الجنينية 9.5 أو 10.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم الصدر والبطن من الفأر مع الايثانول 70٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل شق خط الوسط بطني لفتح البطن واسترداد قرن الرحم في RT في برنامج تلفزيوني وتحويلها بعد سنتين يغسل PBS إلى طبق بتري مليئة سيليكون مع M16 المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دبوس قرن الرحم مع دبابيس الحشرات إلى طبقة السيليكون بحيث الجانب أوعية دموية الرحم في الجزء السفلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع سطح الرحم مع ملقط غرامة، وقبعة من الساقط في 1 ملم تحت سطح الأرض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلطف استرداد الجنين في الكيس المحي من خلال نشر خارج جدران الساقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين الأجنة عند 37 درجة؛ مئوية في المتوسط ​​M16 قبل حقن الخلايا. للحقن، يتم نقل كل جنين إلى الطبق سيليكون مليئة M16 المتوسطة في مرحلة ما قبل حرارة 37 درجة مئوية. </li></ol> 3. الحمض النووي أو حقن الخلايا تحت Stereomicroscope <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء ماصة الزجاج من الخلف مع حقنة هاميلتون وتهز ماصة لإزالة فقاعات في الطرف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين ماصة على حامل حقن مكروي؛ ضبط ضغط عقد إلى 50 (DNA) أو 30 (خلايا) HPA، وضغط الحقن إلى 150 (DNA) إلى 300 (خلايا) HPA. ضبط الوقت الحقن إلى 0.2 ثانية (DNA) أو 0.5 ثانية (الخلايا). قد تختلف هذه الإعدادات قليلا وفقا لنوع microinjector وماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دبوس الجنين إلى أسفل سيليكون من خلال الكيس المحي دون لمس الجنين السليم. مشاهدة منطقة القلب وفتح الكيس فقط فوق هذه المنطقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 4 دبابيس حول الجنين لمنع أي حركة أثناء حقن الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مياداة مجهرية (تعيين إلى دليل)، ببموقف ذ غيض ماصة في زاوية من 45 درجة فوق التأمور، وذلك فوق منطقة القلب التي سيتم حقن (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل ماصة في المنطقة من اهتمام ويؤدي الحقن. إخراج ماصة في أسرع وقت ممكن. تأكد من أن القلب ينبض بشكل صحيح بعد حقن الحمض النووي / خلية. </li></ol> 4. الأجنة، القلب معزولة، ويزدرع الثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة الأجنة E9.5 في 25٪ M2 المتوسطة و 75٪ مصل الفئران، على أن تستكمل مع البنسلين / الستربتوميسين، قبل تحسنت عند 37 درجة مئوية والاوكسيجين مع 40٪ O 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 مل مستنبت في أنبوب زجاجي 25 مل، إضافة بلطف الجنين، والأوكسجين مع 40٪ O 2 قبل الشد الغطاء على أنبوب. احتضان تصل إلى 36 ساعة عند 37 درجة مئوية في حين تناوب أو الهز (30 تناوب / دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نقطة الوقت المطلوب (على سبيل المثال 24 ساعة)، تشريح قلوب بعناية مع ملقط غرامة، دون لمس قلوب، من خلال أول ديcapitating الأجنة؛ قلب من السهل أن المكوس عن طريق سحبها خارج باستخدام تدفق المسالك البعيدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الثقافة قلب معزولة لساعة أخرى 36-48 في DMEM مع FCS 50٪ على إدراج Matrigel المغلفة مجموعة في 12 لوحة جيدا. انظر داير وباترسون (2013) لبروتوكول تحسين الثقافة القلب 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل أي ازدراع المنطقة من الفائدة. كمثال على ذلك، تشريح القناة الأذين البطين (AVC) والثقافة لمدة 48 ساعة على نوع الكولاجين 1 هلام 16. </li></ol> 5. حقن الموجات فوق الصوتية الموجهة في القلب أنا ن الرحم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإعداد من جهاز الموجات فوق الصوتية وmicroinjector: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام نظام الموجات فوق الصوتية عالية الدقة مع محول 40 ميغاهيرتز والإعداد حقن مكروي على السكك الحديدية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين حجم الحقن على microinjector في 69 NL في الحقن. راجع كتيب حقن مكروي الشركة المصنعة لبرمجة microinjector. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد microiالإعداد njection وحقن: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع micropipette الزجاج في microinjector. لضمان كفاءة الحقن، ومعطف الأولى الجانب الداخلي من ماصة مع الزيوت المعدنية بواسطة الشفط يصل إلى أقصى حجم. ثم إخراج النفط مرة أخرى، وترك 1-2 ملم من النفط داخل إبرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح injectate حتى يتم التوصل إلى الحد الأقصى لحجم. يجب الحرص على عدم لمس أي الأسطح مع طرف الإبرة لأن هذا سوف تخفف من حدة غيض وجعل حقن أكثر صعوبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحقيق الاستقرار في قرن الرحم الذي يحتوي على الأجنة خلال الحقن، واستخدام طبق بتري تعديل مع وجود ثقب في منتصف (2.5 سم القطر)، عن طريق غشاء السيليكون رقيقة مع شق صغير في وسط قطع تغطيتها، ووضعه فوق موقع شق . تحقيق الاستقرار في طبق بيتري على الطاولة التعامل مع الماوس عن طريق وضع كتل من الطين 3-4 تحت حواف الطبق. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء الحقن: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حلق البطن من ماوس الحوامل (في المرحلة الجنينية المطلوب) قبل تخديرسيا لإزالة الشعر. علاج البطن مع وكيل إزالة الشعر الكيميائية لإزالة الشعر المتبقي وتعقيم مع الايثانول 70٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير ماوس الحوامل مع الأكسجين / isoflurane وعبر قناع الوجه. استخدام 3-5٪ isoflurane والأكسجين في 100٪ للتخدير الأولي، تليها 1-1.5٪ خلال الفترة المتبقية من هذا الإجراء. ضمان أن الفأر هو تخدير كاف عن طريق معسر بلطف الكفوف و / أو الذيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الماوس مستلق على الطاولة التعامل مع الماوس (تعيين لتسخين عند 37 درجة مئوية) وتغطية العينين مع زيوت التشحيم لمنع جفاف القرنية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق هلام الكهربائي على الأقطاب والشريط الكفوف إلى الأقطاب لرصد معدل ضربات القلب، ومعدل التنفس، وتخطيط القلب. ضع ميزان حرارة المستقيم لمراقبة درجة حرارة الجسم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق أولا من أن الفأر هو الحامل من خلال وضع تصور والفرز الأجنة بواسطة الموجات فوق الصوتية. تطبيق هلام الموجات فوق الصوتية على البطن ووضع مسح الرأس فوق المثانة. من أجل التناسق، تصور المثانة الأولى،وتعول الأجنة في اليسار وقرون الرحم اليمنى، بدءا من موقف المثانة. ضمان قلوب الجنينية والضرب بشكل طبيعي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان الماوس الحوامل، ضع طبق بيتري فوق موقع شق المستقبل مع الطين. اضغط الطبق قليلا على البطن بحيث الطبق هو في اتصال مباشر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الطبق وتعقيم البطن مرة أخرى. جعل 1.5-2 سم خط الوسط بطني شق، ما يقرب من 0،75 حتي 1 سم فوق المهبل، لفتح البطن والصفاق. تجنب إصابة الأعضاء الداخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من الداخل للظاهر اليسار أو اليمين الرحم القرن بالملقط، وسحب بلطف من خلال غشاء السيليكون من الطبق، وتحقيق الاستقرار في طبق على الطين مرة أخرى. منع اسعة سحب أو التلاعب، لأن هذا قد يسبب النزيف في الأوعية الرحم والوفاة المبكرة من الإناث و / أو الأجنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الأجنة مرة أخرى للتأكد كافية حفظ السجلات التي تم حقن الاجنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق هلام الموجات فوق الصوتية على شأبواق terine لصورة القلب ومنع الجفاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صورة الجنين الأولى ليتم حقنه. تحقق الضرب العادي القلب الجنينية والاحتفاظ بسجلات للتوجه الجمجمة، الذيلية واليسار واليمين من الجنين. إذا لزم الأمر، إعادة قرن الرحم قليلا لضمان التوجه السليم. إذا هذا يثبت صعبة، والانتقال إلى الجنين القادم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقب الرحم بعناية مع إبرة حقن مكروي لوضع إبرة في زاوية 45 درجة فوق الجنين، قليلا خارج التامور (الشكل 3). لوصفها الخلايا النخابية، صورة قلب في طريقة عرض أربعة الغرفة ووضع الإبرة بحيث يشير نحو الأخدود الأذين البطين (الشكل 3). إذا يحتاج إلى أن يتم ضبط زاوية، وسحب الإبرة، وإعادة. لا ضبط زاوية مع إبرة داخل الرحم، لأن هذا قد كسر الإبرة. تجنب ثقب الأنسجة الأخرى، مثل أطرافه أو المشيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحريك الإبرةعلى الجدار التامور وثقب ذلك مع اقتراح لطيف، ولكن سريع. بشكل عام، وسوف يكون هناك بعض المقاومة، ولكن تتحرك الإبرة سريع جدا قد يتسبب في طرف الإبرة لثقب القلب نفسه. يجب أن ينتهي الطرف حتى في الفضاء التامور الأخدود الأذين البطين. في حالة النزيف التامور، سوف خلايا الدم تكون مرئية كنمط مثل الثلج الأبيض. إذا كان هذا هو الحال، والتوقف عن حقن الجنين والانتقال إلى الجنين آخر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن injectate. ضخ الحد الأقصى 700 NL في الفضاء التامور لمنع التأثير السلبي على التنمية القلوب. رصد الحقن بواسطة طفيف، وتورم الزمني للكيس التامور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحقن، وسحب الإبرة خارج وتأكيد أن injectate لا يزال من الممكن إخراجه للتأكد من أن الإبرة لم انسداد بواسطة شظايا الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة الجدول مناولة لصورة وحقن الجنين القادم. الحفاظ على عدد من الأجنة حقن ل3-4 الحد الأقصى (في واحدة قرن الرحم) لمنعتمديد التخدير، للسماح للأجنة التحكم في قرن الرحم معارضة، وضمان أن الإجراء لم تخل التطور الجنيني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد حقن العدد المطلوب من الأجنة، وإزالة هلام الموجات فوق الصوتية الزائدة ووضع بلطف قرن الرحم مرة أخرى في البطن في موقعها الصحيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إغلاق البطن الأمهات باستخدام طبقة واحدة من خياطة لالصفاق والعضلات في منطقة البطن، وطبقة ثانية من خياطة للبشرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن الفأر مع الجرعة الأولى من الدواء الألم. استخدام حقنة واحدة من 0.05-0.1 ملغ / كغ البوبرينورفين 15 دقيقة قبل إنهاء التخدير وثلاث حقن إضافية مع 12 فترات ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقف التخدير ومراقبة الماوس لاسترداد كافية من الإجراء. منزل الماوس الحوامل في قفص الفردية لمدة المرجوة من المتابعة. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li><li>Mummery, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes:+a+methods+overview.">Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview.</a> Circ. Res. 111, 344-358 (2012).</li><li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-organ+tissue+engineering:+decellularization+and+recellularization+of+three-dimensional+matrix+scaffolds.">Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).</li><li>Dickinson, L. E., Kusuma, S., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstructing+the+differentiation+niche+of+embryonic+stem+cells+using+biomaterials.">Reconstructing the differentiation niche of embryonic stem cells using biomaterials.</a> Macromol. Biosci. 11, 36-49 (2011).</li><li>Van Vliet, P., Zaffran, S., Wu, S., Puceat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+cardiac+development:+a+view+from+stem+cells+to+embryos.">Early cardiac development: a view from stem cells to embryos.</a> Cardiovasc. Res. In press, (2012).</li><li>Cai, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myocardial+lineage+derives+from+Tbx18+epicardial+cells.">A myocardial lineage derives from Tbx18 epicardial cells.</a> Nature. 454, 104-108 (2008).</li><li>Boulland, J. L., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenotransplantation+of+human+stem+cells+into+the+chicken.">Xenotransplantation of human stem cells into the chicken.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li><li>Liu, A., Joyner, A. L., Turnbull, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+limb+and+brain+patterning+in+early+mouse+embryos+by+ultrasound-guided+injection+of+Shh-expressing+cells.">Alteration of limb and brain patterning in early mouse embryos by ultrasound-guided injection of Shh-expressing cells.</a> Mech. Dev. 75, 107-115 (1998).</li><li>Pierfelice, T. J., Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound-guided+microinjection+into+the+mouse+forebrain+in+utero+at+E9.5.">Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li><li>Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+recombinase:+the+universal+reagent+for+genome+tailoring.">Cre recombinase: the universal reagent for genome tailoring.</a> Genesis. 26, 99-109 (2000).</li><li>Buckingham, M. E., Meilhac, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+cells+for+tracking+cell+lineage+and+clonal.">Tracing cells for tracking cell lineage and clonal.</a> Dev. Cell. 21, 394-409 (2011).</li><li>Phoon, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+tools+for+the+developmental+biologist:+ultrasound+biomicroscopy+of+mouse+embryonic+development.">Imaging tools for the developmental biologist: ultrasound biomicroscopy of mouse embryonic development.</a> Pediatr. Res. 60, 14-21 (2006).</li><li>Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+purification+of+lentiviral+vectors.">Production and purification of lentiviral vectors.</a> Nat. Protoc. 1, 241-245 (2006).</li><li>Dyer, L. A., Patterson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Ex+vivo+Culture+Method+for+the+Embryonic+Mouse.">A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse.</a> J. Vix. Exp. , (2013).</li><li>Runyan, R. B., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+mesenchyme+into+three-dimensional+collagen+gels:+a+regional+and+temporal+analysis+of+interaction+in+embryonic+heart+tissue.">Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue.</a> Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

تم تصميم السابقين بروتوكولات حقن الجسم الحي داخل القلب المذكورة أعلاه للحفاظ على وظيفة عضلة القلب لمدة 48 ساعة على الأقل في منتصف مرحلة (E9.5-E11.5) أجنة الفئران. هذه الأساليب تسمح للحقن حقن استهدفت مكانيا من الحمض النووي أو الخلايا. وبعض الأمثلة هو مبين في ا?...

منذ أكثر من عقد من الزمان، والخلايا الجذعية الجنينية البشرية (HuESCs) قد استمدت من مثانات بلاستولية الإنسان 1. منذ ذلك الحين، أصبحت هذه الخلايا موضوع حقل مهم من الأبحاث التي تتناول المسائل التي لم تتم تلبيتها في البيولوجيا التطورية الإنسان. وقد وفرت HuESCs علاوة على ذلك الآمال في الطب التجديدي. في السنوات الأخيرة، تم إنشاؤها الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها الإنسان (iPSCs) من الخلايا الجسدية المريض محددة، وتوفير نماذج من مرض وراثي 2. العديد من البروتوكولات في المختبر لتمايز الخلايا الجنينية الجذعية المحفزة أو المستحثة نحو مختلف الأنساب الخلية، بما في ذلك القلب الأنساب 3، تم الإبلاغ عنها. وغالبا ما phenotyped خلايا متمايزة عن طريق تحليل الحمض النووي الريبي والبروتينات التعبير، المناعية، و / أو في اختبارات الوظائف المختبر. ومع ذلك، المحفزة مشتقات الخلايا الجذعية يجب أن توضع في بيئة الجنينية المناسبة من أجل اختبار ما إذا يكتسبون تماما سلل مصير نظيرتها الجنينية وما إذا كانت ألخص في الجسم الحي وظيفة حقيقية في استجابة لمنبهات الإقليمية. بينما هندسة الأنسجة واعدة، فإنه لا يوفر بعد كل الاشارات المعروفة وغير المعروفة من السليم في الجسم الحي الأنسجة الجنينية النامية 4،5. وسم الخلية مع الأصباغ أو ناقلات فيروسات في الأجنة، بما في ذلك أجنة الفئران، جلبت معلومات هامة فيما يتعلق بمنشأ الجنينية الأنساب الخلية أثناء التطور القلب 6. على سبيل المثال، صبغ الحقن في الفضاء التامور من أجنة الفئران فيفو السابقين، تليها الثقافة في المختبر من قلوب معزولة، وكان يستخدم لتسمية الخلايا النخابية وذريتهم 7. ومع ذلك، صبغ ووسم الخلية فيروسات طبقت معظمها لأجنة الفئران في وقت مبكر مع أجهزة تزال ضعيفة، أو أجنة الدجاج، والتي هي أكثر يمكن الوصول إليها بسهولة 8. استثناء هو الدماغ، وهو أسهل لاستهداف في البريدmbryos 9،10. لم يتم حتى الآن تطبيق هذا النهج لضرب قلب الجنينية الماوس. لاستكمال وضع العلامات مباشرة مع الأصباغ أو الفيروس وإجراء النسب التتبع في أكثر تقدما أجنة الفئران والجرذان مرحلة الكبار، وقد تم الجمع بين نهج وضع العلامات الخلية مع تحليل الفئران المعدلة وراثيا باستخدام التكنولوجيا لجنة المساواة العرقية / السلمون المدخن. إلا أن نهج لجنة المساواة العرقية / السلمون المدخن 11 ملامح بعض القيود بسبب خصوصية الزمانية المكانية للمناطق التنظيمية الجيني يستخدم لدفع التعبير عن recombinase، وكفاءة إعادة التركيب لجنة المساواة العرقية / لوكس 12. وعلاوة على ذلك، فإن هذا النهج لا يعالج تماما الأسئلة محددة من الخلايا اقتناء يحركها هجرة مصير الخلية كما يمكن تسمية فقط السلائف بعد تفعيل المنطقة التنظيمية المستخدمة لدفع لجنة المساواة العرقية التعبير. فإنه أيضا لا يمكن أن تنطبق على الأجنة البشرية من أجل قضايا أخلاقية واضحة. ونظرا لهذه القيود، قمنا بتصميم سلسلة من ع جديدةrotocols لحقن مجموعة متنوعة من وكلاء وسم الخلية مثل الأصباغ الفلورية، فيروس، جهري التعبير الجيني مثل shRNAs وناقلات توسيم الخلايا المعتمدة على الحمض النووي، أو الخلايا في الجنين الماوس في E9.5 ومراحل لاحقة من التنمية في المناطق المستهدفة من القلب. حقن الحمض النووي / خلية استخدام stereomicroscope وجهاز حقن مكروي بسيطة جنبا إلى جنب مع فيفو السابقين الثقافة الجنين تصل إلى 48 ساعة، أو القلب معزولة أو الثقافة يزدرع الجنينية ل48-72 ساعة. نحن أيضا تقريرا بروتوكول حقن مكروي بوساطة الموجات فوق الصوتية في قلوب الماوس الجنينية في الرحم، وهذا الأسلوب يسمح رصد تطور الأجنة 13 ويسمح على المدى الطويل متابعة من injectates و / أو الخلايا المسمى. وجدنا أن هذه المناهج الحفاظ على وظيفة الجهاز وتوفير بيئة أكثر من ممثل في المختبر اختبار إمكانات الخلايا الجذعية. كما يوفر الفرصة لمتابعة الهجرةمن وصفت و / أو حقن خلايا لرصد مصيرهم. في نهاية المطاف، وهذا ينبغي أن تسفر عن فهم أفضل للتنميط الأنسجة الإقليمية والعمليات البيولوجية الرئيسية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="986">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Setups / Hardware</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td style="width:411px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">40 MHz Transducer</td>
			<td style="width:175px;">VisualSonics</td>
			<td>MS550S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Microinjector</td>
			<td style="width:175px;">VisualSonics</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microinjector&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Eppendorf</td>
			<td>5242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micromanipulator&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Eppendorf</td>
			<td>5171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Nitrogen</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>required to pressurize the injector</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Rail system</td>
			<td style="width:175px;">VisualSonics</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">rotator</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>to rotate glass tube with embryos inside the incubator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Standard incubator</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>5% CO2, 37 C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">stereomicroscope</td>
			<td style="width:175px;">Zeiss</td>
			<td style="width:104px;">Discovery. V8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Vevo 2100</td>
			<td style="width:175px;">VisualSonics</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Microinjection</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">borosilicate capillary tubes</td>
			<td style="width:175px;">World Precision Instrument</td>
			<td style="width:104px;">KTW-120-6</td>
			<td>1.2 mm external diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pipette puller&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Sutter</td>
			<td style="width:104px;">Model P87</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">microinjection needles</td>
			<td>Origio-Humagen&#160;</td>
			<td>C060609</td>
			<td>OD/ID 1.14mm/53mm, with 50/35 um OD/ID tip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hamilton syringes&#160;</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Petridishes</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>10 cm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mineral oil&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td>M8410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Silicon membrane</td>
			<td style="width:175px;">Visualsonics</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>4.3x4.3 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Play-Doh</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:175px;">Vet One</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hair removal agent&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Nair</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:297px;">eye lubricant</td>
			<td style="width:175px;">Optixcare</td>
			<td>31779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Electrode gel (Signa)</td>
			<td style="width:175px;">Parker</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Suture</td>
			<td style="width:175px;">Sofsilk 5-0</td>
			<td style="width:104px;">S1173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Ultrasound gel</td>
			<td style="width:175px;">Aquasonic</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Buprenex Buprenex (buprenorphine hydrochloride)</td>
			<td style="width:175px;">Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc.</td>
			<td style="width:104px;">NDC 12496-0757-1</td>
			<td>0.05-0.1 mg/kg in saline</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone Elastomer</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Glass petridishes</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>60mm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">insect pins&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>26002-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Media and culture reagents</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optimem medium</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">51985026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M2 medium&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">M7167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Eagle Medium</td>
			<td style="width:175px;">Lonza</td>
			<td style="width:104px;">BE12-640F</td>
			<td>high glucose and 50% rat serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M16 medium&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:104px;">M7292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">rat serum</td>
			<td style="width:175px;">Janvier</td>
			<td style="width:104px;">ODI 7158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pennicilin/streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">15140-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">oxygen 40%</td>
			<td style="width:175px;">Air liquid</td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>required to oxygenate the embryo culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">fetal calf serum</td>
			<td style="width:175px;">Fisher</td>
			<td style="width:104px;">RVJ35882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">matrigel</td>
			<td style="width:175px;">BD</td>
			<td style="width:104px;">356230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">collagen type I</td>
			<td style="width:175px;">BD</td>
			<td style="width:104px;">354236</td>
			<td>to coat culture dishes for explant culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">culture dishes</td>
			<td style="width:175px;">Dutcher /Orange</td>
			<td style="width:104px;">131020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Injectates</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CDCFDA-SE&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Molecular Probes&#160;</td>
			<td>C1165</td>
			<td>25mg/ml DMSO. Store at -20 C. Dilute 1:100-200 in saline before use.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PGK-GFP-expressing lentivirus&#160;</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:104px;"></td>
			<td>~8E9 transducing units/ml DMEM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">lipofectamine 2000&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell labeling and injection in developing embryonic mouse hearts

اختبار مصير الجنينية أو الجذعية المحفزة الخلايا في المختبر المشتقات في بروتوكولات أدى إلى نتائج مثيرة للجدل والتي لا تعكس بالضرورة في الجسم الحي المحتملة. ويفضل، ينبغي أن توضع هذه الخلايا الجنينية في بيئة سليمة من أجل الحصول على النمط الظاهري محددة. وعلاوة على ذلك، ظلت نسب خلية تتبع الدراسات في الماوس بعد وضع العلامات الخلايا مع الأصباغ أو ناقلات فيروسات محدودة معظمها إلى أوائل أجنة الفئران المرحلة مع أجهزة تزال ضعيفة. للتغلب على هذه القيود، قمنا بتصميم بروتوكولات القياسية وحقن مكروي بوساطة الموجات فوق الصوتية لحقن عوامل مختلفة في المناطق المستهدفة من القلب في أجنة فئران في مراحل لاحقة E9.5 والتنمية. يزدرع الجنينية أو الأجنة ثم مثقف أو اليسار لمزيد من التطور في الرحم. وتشمل هذه العوامل الأصباغ الفلورية، فيروس، shRNAs، أو الخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا الاصلية. نهجنا يسمح الحفاظ على فوnction للجهاز في حين رصد الهجرة ومصير الخلايا المسمى و / أو حقن. هذه التقنيات يمكن أن تمتد إلى الأجهزة الأخرى، وسوف تكون مفيدة جدا لمعالجة المسائل الرئيسية في علم الأحياء البيولوجية للتنمية.

باستخدام بروتوكولات الحقن المذكورة أعلاه، وخلايا يمكن أن توصف و / أو حقنها في قلب الفأر الجنينية. كدليل على المفهوم، وتظهر العديد من الأمثلة التي بروتوكول الحقن وفيفو السابقين AVC ازدراع والقلب معزولة، أو ثقافة الجنين كلها كانت مجتمعة (الشكل 1). <p class="jov...

Watch this Scientific Journal Video about Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts at JoVE.com

Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

نحن تصف سلسلة من الطرق لحقن الأصباغ وناقلات الحمض النووي، والفيروسات، والخلايا من أجل رصد كل من مصير الخلية والنمط الظاهري من الخلايا الذاتية والمطعمة المشتقة من الخلايا الجنينية أو المحفزة داخل أجنة الفئران في اليوم الجنينية (E) 9.5 و مراحل لاحقة التنمية.

وسم الخلية وحقن في تطوير الجنينية الماوس قلوب

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect ...

cell-labeling-and-injection-in-developing-embryonic-mouse-hearts

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

14.1K Views.  Aix-Marseille University.  نحن تصف سلسلة من الطرق لحقن الأصباغ وناقلات الحمض النووي، والفيروسات، والخلايا من أجل رصد كل من مصير الخلية والنمط الظاهري من الخلايا الذاتية والمطعمة المشتقة من الخلايا الجنينية أو المحفزة داخل أجنة الفئران في اليوم الجنينية (E) 9.5 و مراح?...

Video: Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time imaging of vesicles labeled with FM dye to monitor the rate of presynaptic vesicle release.  FM4-64 is a red fluorescent amphiphilic styryl dye that embeds into the membranes of synaptic vesicles as endocytosis is stimulated.  Lipophilic interactions cause the dye to greatly increase in fluorescence, thus emitting a bright signal when associated with vesicles and a nominal one when in the extracellular fluid. After a wash step is used to help remove external dye within the plasma membrane, the remaining FM is concentrated within the vesicles and is then expelled when exocytosis is induced by another round of electrical stimulation. The rate of vesicles release is measured from the resulting decrease in fluorescence.  Since FM dye can be applied external and transiently, it is a useful tool for determining rates of exocytosis in neuronal cultures, especially when comparing the rates between transfected synapses and neighboring control boutons.



The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission. Here we used real-time imaging of vesicles labeled with the red fluorescent dye FM 4-64 to measure the rate of presynaptic vesicle release in hippocampal neuronal cultures.

قياس إيماس في الخلايا العصبية عن طريق وصفها وزير الخارجية

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. The distinct advantage of this technique is that experimental manipulations may be performed on individual cells while leaving the surrounding tissue unaltered, thereby distinguishing cell-autonomous effects from those resulting from global treatments. When combined with advanced in vivo imaging techniques, SCE of fluorescent markers permits direct visualization of cellular morphology, cell growth, and intracellular events over timescales ranging from seconds to days. While this technique is used in a variety of in vivo and ex vivo preparations, we have optimized this technique for use in Xenopus laevis tadpoles. In this video article, we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the albino Xenopus tadpole. We also discuss methods to optimize yield, and show examples of live two-photon fluorescence imaging of neurons fluorescently labeled by SCE.

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. Here we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the Xenopus laevis tadpole.

وحيد الخلية في الجسم الحي Electroporation داخل الدماغ سليمة النامية

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of the predominant imaging modalities to assess the restoration of the injured myocardium. Furthermore, ex-vivo labeling agents, such as iron-oxide nanoparticles, have been employed to track and localize the transplanted stem cells. However, this method does not monitor a fundamental cellular biology property regarding the viability of transplanted cells. It has been known that manganese chloride (MnCl2) enters the cells via voltage-gated calcium (Ca2+) channels when the cells are biologically active, and accumulates intracellularly to generate T1 shortening effect. Therefore, we suggest that manganese-guided MRI can be useful to monitor cell viability after the transplantation of hESC into the myocardium.
In this video, we will show how to label hESC with MnCl2 and how those cells can be clearly seen by using MRI in vitro. At the same time, biological activity of Ca2+-channels will be modulated utilizing both Ca2+-channel agonist and antagonist to evaluate concomitant signal changes.

In this video, we are showing how to label human embryonic stem cells (hESC) with manganese chloride (MnCl2) which can enter cells via voltage-gated calcium channels when the cells are biologically active. Additionally, we show the use of MnCl2 as cellular MRI contrast agent to determine the in vitro viability of hESC.

وصفها في المختبر من خلايا المنشأ الجنينية البشرية لتصوير بالرنين المغناطيسي

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

إعداد الأجنة المجهري للإلكترون من ذبابة الفاكهة أنبوب القلب الجنينية

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

العزلة واشتقاق خلايا الفأر الجنينية بيرشوت

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is often the most effective and noninvasive form of delivery of an agent of interest. In the zebrafish (Danio rerio), IV injection of drugs has long been a challenge because of the small vessel diameter. This has also proved a significant hurdle for the injection of cells during hematopoeitic stem cell transplantation. Historically, injections into the bloodstream were done directly through the heart. However, this intra-cardiac procedure has a very high mortality rate as the heart is often punctured during injection leaving the fish prone to infection, massive blood loss or fatal organ damage. Drawing on our experience with the mouse, we have developed a new injection procedure in the zebrafish in which the injection site is behind the eye and into the retro-orbital venous sinus. This retro-orbital (RO) injection technique has been successfully employed in both the injection of drugs in the adult fish as well as transplantation of whole kidney marrow cells. RO injection has a much lower mortality rate than traditional intra-cardiac injection. Fish that are injected retro-orbitally tend to bleed less following injection and are at a much lower risk of injury to a major organ like the heart. Further, when performed properly, injected cells and/or drugs quickly enter the bloodstream allowing compounds to exert their effect on the whole fish and kidney cells to easily home to their niche. Thus, this new injection technique minimizes mortality while allowing efficient delivery of material into the bloodstream of adult fish. Here we exemplify this technique by retro-orbital injection of Tg(globin:GFP) cells into adult casper fish as well as injection of a red fluorescent dye (dextran, Texas Red ) into adult casper fish. We then visualize successful injections by whole animal fluorescence microscopy.

Here we show how to do retro-orbital injection in adult zebrafish.

الرجعية المدارية في حقن اسماك الزرد الكبار

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment are open and allow cations to flow steadily inwards across the membrane, depolarizing the cell. Light exposure triggers the closure of the CNG channels, blocks the inward cation current flow, and thus results in cell hyperpolarization. Based on the polarity of photoreceptors, a suction recording method was developed in 1970s that, unlike the classic patch-clamp technique, does not require penetrating the plasma membrane 1. Drawing the outer segment into a tightly-fitting glass pipette filled with extracellular solution allows recording the current changes in individual cells upon test-flash exposure. However, this well-established "outer-segment-in (OS-in)" suction recording is not suitable for mouse cone recordings, because of the low percentage of cones in the mouse retina (3%) and the difficulties in identifying the cone outer segments. Recently, an inner-segment-in (IS-in) recording configuration was developed to draw the inner segment/nuclear region of the photoreceptor into the recording pipette 2,3. In this video, we will show how to record from individual mouse cone photoresponses using single-cell suction electrode.

We will show how to record flash responses from single mouse cones using a suction electrode.

تسجيلات شفط وحيدة الخلية المستقبلة من المخروط ماوس

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer software.  Video bioinformatics is a powerful quantitative approach for extracting spatio-temporal data from video images using computer software to perform dating mining and analysis. In this article, we introduce a video bioinformatics method for quantifying the growth of human embryonic stem cells (hESC) by analyzing time-lapse videos collected in a Nikon BioStation CT incubator equipped with a camera for video imaging. In our experiments, hESC colonies that were attached to Matrigel were filmed for 48 hours in the BioStation CT.  To determine the rate of growth of these colonies, recipes were developed using CL-Quant software which enables users to extract various types of data from video images.  To accurately evaluate colony growth, three recipes were created. The first segmented the image into the colony and background, the second enhanced the image to define colonies throughout the video sequence accurately, and the third measured the number of pixels in the colony over time.  The three recipes were run in sequence on video data collected in a BioStation CT to analyze the rate of growth of individual hESC colonies over 48 hours. To verify the truthfulness of the CL-Quant recipes, the same data were analyzed manually using Adobe Photoshop software. When the data obtained using the CL-Quant recipes and Photoshop were compared, results were virtually identical, indicating the CL-Quant recipes were truthful. The method described here could be applied to any video data to measure growth rates of hESC or other cells that grow in colonies. In addition, other video bioinformatics recipes can be developed in the future for other cell processes such as migration, apoptosis, and cell adhesion.  

Video bioinformatics is the automated processing, analysis, understanding, and data mining of biological spatio-temporal data extracted from microscopic videos. The purpose of this article is to demonstrate a method for measuring human embryonic stem cell colony growth using a video bioinformatics method.

الفيديو المعلوماتية الحيوية تحليل النمو البشري الخلية الجذعية الجنينية كولوني

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

في الجسم الحي التصوير والعلاجات العلاجية في الفأر نموذج مثلي من سرطان المبيض

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Separation of Mouse Embryonic Facial Ectoderm and Mesenchyme

Orofacial clefts are the most frequent craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal facial development3. In human and mouse, initial growth and patterning of the face relies on several small buds of tissue, the facial prominences4,5. The face is derived from six main prominences: paired frontal nasal processes (FNP), maxillary prominences (MxP) and mandibular prominences (MdP). These prominences consist of swellings of mesenchyme that are encased in an overlying epithelium. Studies in multiple species have shown that signaling crosstalk between facial ectoderm and mesenchyme is critical for shaping the face6. Yet, mechanistic details concerning the genes involved in these signaling relays are lacking. One way to gain a comprehensive understanding of gene expression, transcription factor binding, and chromatin marks associated with the developing facial ectoderm and mesenchyme is to isolate and characterize the separated tissue compartments.
Here we present a method for separating facial ectoderm and mesenchyme at embryonic day (E) 10.5, a critical developmental stage in mouse facial formation that precedes fusion of the prominences. Our method is adapted from the approach we have previously used for dissecting facial prominences7. In this earlier study we had employed inbred C57BL/6 mice as this strain has become a standard for genetics, genomics and facial morphology8. Here, though, due to the more limited quantities of tissue available, we have utilized the outbred CD-1 strain that is cheaper to purchase, more robust for husbandry, and tending to produce more embryos (12-18) per litter than any inbred mouse strain8. Following embryo isolation, neutral protease Dispase II was used to treat the whole embryo. Then, the facial prominences were dissected out, and the facial ectoderm was separated from the mesenchyme. This method keeps both the facial ectoderm and mesenchyme intact. The samples obtained using this methodology can be used for techniques including protein detection, chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay, microarray studies, and RNA-seq.

A protocol for separation of embryo facial ectoderm and mesenchyme is described. We use Dispase II to treat whole embryos first, dissect whole facial prominences out, and then separate the facial ectoderm and mesenchyme.

فصل الأدمة الجنينية الماوس الوجه واللحمة المتوسطة

 Orofacial clefts are the most frequent  craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal ...