نشكر علوم الحياة وكلية الآداب والعلوم في جامعة كوينز لتمويل هذا العمل. كذلك، نشكر مختبر تشين سانج لتوفير الكواشف اللازمة والمعدات والدعم التقني. كما نشكر QGEM 2011، خصوصا توني لمساهمته في المناقشة.

1. إعداد / غسل الديدان <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزامنة الديدان إلى الشباب البالغين 11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 2 مل من بصل S الصعود إلى 5 سم لوحة الانجذاب الكيميائي من نظموا الديدان التي مسحت مجرد حشيش OP50 E. القولونية. إمالة لوحة حسب الحاجة لضمان تغسل الديدان من سطح لوحة في المخزن المؤقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 1 مل من محلول دودة-S بصل إلى أنبوب microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 ثانية باستخدام PicoFuge في 6،600 دورة في الدقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح بصل S، وترك بيليه من الديدان دون عائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل S حل بصل إلى أنبوب microcentrifuge، عكس عدة مرات لغسل الديدان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 1،4-1،6 آخر ثلاث مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 ثانية مرة الخامسة، وهذه المرة الشفط طاف إلى الحجم النهائي من كاليفورنيا. 100 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 2 ميكرولتر من الديدان على لوحة NGM لضمان وجود ما بين 50 و 250 الديدان في كل عينة 2 ميكرولتر. ضبطتركيز الديدان في بصل S حسب الحاجة عن طريق إعادة التعليق على الديدان في حجم أصغر أو أكبر من S بصل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الديدان في مقايسة مباشرة بعد غسل الديدان لمدة تصل إلى 1 ساعة. </li></ol> 2. إعداد لوحات اختبار <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمناسبة السفلي من لوحة 5 سم، تقسيم الطبق إلى 4 أجزاء متساوية. أجار الكيميائي أو NGM يمكن استخدامها. وثمة حاجة إلى الحد الأدنى من 3 محاكمات لكل سلالة الجينية التي يجري اختبارها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمناسبة دائرة نصف قطرها 0.5 سم حول المنشأ (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمناسبة نقطة في كل رباعي إما مع &quot;T&quot; ل &quot;اختبار&quot; أو &quot;C&quot; ل &quot;السيطرة&quot; التأكد من أن المواقع هي على مسافة واحدة من أصل وبعضها البعض. النقاط يجب أن تكون 2 سم بعيدا عن الأصل على الأقل. بمناسبة أعلى اليسار وأسفل اليمين كما الأرباع الأرباع اختبار والحق أعلى وأسفل اليسار الأرباع والضوابط (الشكل 1). </li></ol> 3. تشغيل الفحص </P&gt; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج من محلول الاختبار من خلال الجمع بين أحجام متساوية من مركب اختبار و 0.5 M أزيد (وهو مخدر يستخدم للقبض على الديدان عند بلوغ رباعي). مزيج من حلول التحكم من خلال الجمع بين المذيبات المستخدمة لتخفيف مركب اختبار مع 0.5 M أزيد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 2 ميكرولتر من الحل دودة (المعد في 1.8) من بيليه على المنشأ (حيث تتقاطع السطرين). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباشرة بعد، ماصة 2 ميكرولتر من محلول الاختبار على موقعين &quot;T&quot;. وبالمثل، ماصة على نفس القدر من الحل السيطرة على موقعين &quot;C&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة وقد تم استيعاب قطرات دودة والرائحة في أجار، استبدال الأغطية وعكس لوحات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 60 دقيقة، ووضع الديدان في 4 درجة مئوية الحاضنة. فقط إزالة لوحة من الحاضنة عندما يمكن عدها. ترك الديدان في درجة حرارة الغرفة قد تسمح لهم لتعبئة مرة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسجيل عدد من الديدان في كل رباعي التي عبرت تماما CIRC الداخليةجنيه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 3،2-3،6 باستخدام حلول التحكم في كل من الاختبار والأرباع السيطرة. وهذا سيكون بمثابة لوحة التحكم. وينبغي بذل ثلاثة من هذه اللوحات وتشغيل لتكون بمثابة المكافحة المناسبة. </li></ol> 4. تفسير النتائج / تحديد مؤشر الانجذاب الكيميائي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب مؤشر الكيميائي باستخدام المعادلة 1. هذا وسوف تسفر عن مؤشر الكيميائي بين -1.0 و +1.0. </li></ol> (1) الكيميائي مؤشر = (# الديدان في كل من الأرباع اختبار - # الديدان في كل من الأرباع التحكم) / (مجموع # من الديدان الناجحة) والنتيجة +1.0 يشير جذب القصوى نحو الهدف، ويمثل 100٪ من الديدان وصوله في الأرباع تحتوي على الهدف الكيميائية. فهرس -1.0 دليل على تنافر القصوى. وقد تم بالفعل استخدام طرق فحص مماثل 3 (الجدول 1). <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإبلاغ عن متوسط ​​Chemotaxiق مؤشر (CI) والخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM). أداء الطالب اختبار T-بمقارنة البيانات من لوحات اختبار ومراقبة. </li></ol>

<ol>
	<li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans.">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Cell. 74, 515-527 (1993).</li><li>Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensory+neurons+with+overlapping+functions+direct+chemotaxis+to+multiple+chemicals+in+C.+elegans.">Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans.</a> Neuron. 7, 729-742 (1991).</li><li>Lee, J., Jee, C., McIntire, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+preference+in+C.+elegans.">Ethanol preference in C. elegans.</a> Genes Brain Behav. 8, 578-585 (2009).</li><li>Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+behavioral+analysis+in+C.+elegans.">High-throughput behavioral analysis in C. elegans.</a> Nat. Methods. 8, 592-598 (2011).</li><li>Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+by+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+identification+of+attractants+and+analysis+of+the+response+by+use+of+mutants.">Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 817-821 (1973).</li><li>Colbert, H. A., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant-specific+adaptation+pathways+generate+olfactory+plasticity+in+C.+elegans.">Odorant-specific adaptation pathways generate olfactory plasticity in C. elegans.</a> Neuron. 14, 803-812 (1995).</li><li>Kauffman, A., Parsons, L., Stein, G., Wills, A., Kaletsky, R., Murphy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+Positive+Butanone+Learning,+Short-term,+and+Long-term+Associative+Memory+Assays.">C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays.</a> J. Vis. Exp. (49), e2490 (2011).</li><li>Troemel, E. R., Kimmel, B. E., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+chemotaxis+responses:+sensory+neurons+define+olfactory+preferences+in+C.+elegans.">Reprogramming chemotaxis responses: sensory neurons define olfactory preferences in C. elegans.</a> Cell. 91, 161-169 (1997).</li><li>Pierce-Shimomura, J. T., Morse, T. M., Lockery, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fundamental+role+of+pirouettes+in+Caenorhabditis+elegans+chemotaxis.">The fundamental role of pirouettes in Caenorhabditis elegans chemotaxis.</a> J Neurosci. 19, 9557-9569 (1999).</li><li>Frokjaer-Jensen, C., Ailion, M., Lockery, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ammonium-acetate+is+sensed+by+gustatory+and+olfactory+neurons+in+Caenorhabditis+elegans.">Ammonium-acetate is sensed by gustatory and olfactory neurons in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 3, e2467 (2008).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+Methods:+Synchronization+and+Observation.">Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation.</a> J. Vis. Exp. (64), e4019 (2012).</li><li>Sengupta, P., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fate+specification+and+differentiation+in+the+nervous+system+of+Caenorhabditis+elegans.">Cell fate specification and differentiation in the nervous system of Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Genet. 18, 73-80 (1996).</li><li>Hart, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior.">Behavior.</a> WormBook. , (1895).</li></ol>

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

الكيميائي، على الرغم من أن تسيطر عليها مجموعة معقدة من الآليات العصبية والخلوية، ويمكن بسهولة وبشكل موضوعي كميا باستخدام المقايسات الكيميائي. للحصول على أفضل النتائج من المقايسات، يجب اتخاذ بعض الخطوات الحاسمة. أولا، تنظيم الديدان أمر أساسي في تحقيق نتائج متسقة ال...

جناح أول من طور الفحص الكيميائي في عام 1973 5، ومنذ ذلك الحين، بعيدة المدى التطبيقات. بيولوجيا الأعصاب هو حقل واحد التي استفادت من استخدام مجموعة متنوعة من المقايسات الكيميائي. وقد تجلى تكيف حاسة الشم، وهو شكل بسيط من التعلم والذاكرة، في C. ايليجانس باستخدام المقايسات الكيميائي 6. كما تم استخدامها لاظهار ان C. يمكن ايليجانس تطوير الإيثانول التسامح، وهي النتيجة التي يوضح ليس فقط اللدونة السلوكية للديدان، ولكن هذا يدل أيضا على أن الديدان يمكن أن تكون مفيدة جدا في دراسة إدمان الكحول في البشر 3. وقد جرى حتى وضعت فحوصات للتدليل على قدرة C. ايليجانس لتخزين القصير والذاكرة على المدى الطويل من خلال إظهار أن الجمعيات مصنوعة من الديدان بين chemoattractants والمواد الغذائية (OP50) 7. بالإضافة إلى ذلك، وبالنظر إلى المعلومات الواسعة المتاحة حاليا فيما يتعلق C. ايليجانس الجينوم، وchemotaxiق سلوك C. تم تغيير ايليجانس مرات عديدة عن طريق إحداث الطفرات 1،8. وهذا يسمح لكثير من الاحتمالات هندسة مثيرة، مثل تطوير C. ايليجانس كأداة المعالجة البيولوجية. وهكذا، منذ التطوير الأولي للفحص الكيميائي في عام 1973، تم تغييره في كثير من الأحيان واستخدامها لتوضيح أسرار في مجموعة متنوعة من التخصصات. بعض المقايسات التي تهدف إلى اكتشاف الطريق المحددة التي اتخذتها الديدان نحو الهدف. وقد تم تطوير هذا الفحص تنميط من هذا النوع من قبل وارد 5. وضعت ثلاثة الديدان على أجار ذاب لمدة 15 دقيقة. وتتبع تحركاتهم عن طريق بصمة تركوها لأنها سافرت من المحيط الخارجي للوحة تصل الانحدار إلى جاذب في وسط اللوحة. ألقي القبض على جميع الديدان على لوحة باستخدام الكلوروفورم في نهاية كل محاكمة. واحدة سليل هذه الطريقة وضعت دودة واحدة في منتصف لوحة مع جاذبة والسيطرة علىر مسافات متساوية والعكس من أصل 2. بيرس-شيمومورا وآخرون. بتطوير فحص لمراقبة الطبيعة الدقيقة للحركة المشاركة في 9 الكيميائي. وضعت الديدان الفردية في 9 سم أطباق بتري إما تحتوي على تركيز الموحد للجاذبة أو على شكل شعاعي الانحدار، وبلغت ذروتها في مصدر جاذب. برنامج برامج الكمبيوتر التي اعترفت دودة كان يستخدم لتسجيل السلوك الملاحظ. كاميرا فيديو مثبتة في المجهر عملت بالتزامن مع المرحلة لضبط طبق بيتري تلقائيا عندما تمكن الفحص لضمان بقيت الدودة في مجال الرؤية. من هذا، تم اكتشاف معلومات أكثر تفصيلا عن سبب الدوران المعروضة بواسطة C. ايليجانس. فحوصات أخرى أكثر مشابهة لتلك الموصوفة هنا، اختبر استجابة من عدد كبير من الديدان لمركبات الاختبار. وقد اثنين من رباعي المقايسات الكيميائيتستخدم لاستكشاف الأدوار التي الخلايا العصبية المختلفة، والمستقبلات، والجزيئات نقل الإشارة لعبت عندما C. تعرضت ايليجانس لمختلف مركبات 1. وضعت بين 20-50 الديدان غسلها بالقرب من وسط لوحة مع جاذبة والسيطرة على طرفي القطبية جنبا إلى جنب مع مخدر، الصوديوم أزيد (نان 3). بعد 60 دقيقة، تم إنشاء فهرس الكيميائي مع القيم من -1.0 إلى +1.0 على أساس الفرق بين كيفية العديد من الديدان والملصقة على جاذبة أو عنصر التحكم. تم استخدام مؤشر الكيميائي مماثلة في مقايسة ذكرت في هذه المقالة، على الرغم من أن الفحص في وقت سابق فشلت في تقييم صارم الديدان غير متحركة. ثم تم تطبيق هذا الاختبار إضافية لاختبار آثار الاجتثاث الخلايا العصبية على الكيميائي. تم إجراء آخر من الاختلاف الفحص المذكورة أعلاه حيث وضعت 100-200 الديدان في وسط لوحة تحتوي على أربعة أجزاء 3. الأرباع المجاورة سواء الواردة أو الاختبارالرقابة على المواد. كما هو الحال في المقايسات السابقة، ويجمد الديدان بفعل أزيد الصوديوم قبل أن يسجل هدفا. ووصف طريقة مماثلة هنا كوسيلة لتقييم مدى استجابة C. ايليجانس لمركبات مختلفة. ومع ذلك، فإن الأسلوب أدناه له فائدة إضافية تتمثل في تقييم الديدان التي مرت على مسافة عتبة فصل النقال من الديدان قادرة على الحركة فقط. أدرجت فحوصات أخرى مبادئ توجيهية مماثلة لتجاهل الديدان قادرة على الحركة. Frøkjær-جنسن وآخرون. وضع مقايسة تنوعا والتي يمكن استخدامها لاختبار مركبات قابلة للذوبان على حد سواء متقلبة والمياه 10. تم تقسيم طبق بتري إلى أربعة أجزاء. لم الأرباع العلوي والسفلي لا تحتوي على المذيبات. رباعي اليسرى الواردة الماء، والحق الوارد الجاذب. عند اختبار عطور متقلبة، وضعت الحليلة على غطاء الطبق، خلال الربع السليم، في حين وضعت مركبات ذوبان في الماء مباشرة على الآغاص. الطرق الموجودة حاليا لتقييم استجابة الكيميائي من C. ويجري باستمرار تنقيحها ايليجانس لتحسين سهولة استخدامها، والكفاءة، والدقة. لذلك، في حين أن مقايسة الموصوفة هنا لديها القدرة على تقييم أكبر عدد من الديدان (الإنتاجية القصوى: 250 الديدان / ساعة لكل لوحة، أكبر بقليل من سرعة أبداه لي وآخرون 3)، والقوة الحقيقية لهذا الأسلوب هو تتويجا مقتضبة للعديد من سمات فحوصات في وقت سابق (الجدول 1).

<table><tbody><tr><td>S Basal (- cholesterol) [5.8 g NaCl; 1 M K phosphate buffer, pH 6.0; dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 1 liter.] Autoclave</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PicoFuge</td><td>Stratagene</td><td>400552</td><td></td></tr><tr><td>Microscopes</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissecting</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P1000 Pipette</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P10 Pipette</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 M Sodium Azide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemotaxis Agar [1.6% BBL-agar (Benton-Dickinson) or 2% Difco-agar. Autoclave. Add 5 mM potassium phosphate, pH 6.0; 1 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 1 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;]</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol/Distilled Water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Test Compounds (eg. 0.5% diacetyl)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Bio-Rad</td><td>166-0600</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Amresco</td><td>CA97062-046</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>VWR</td><td>CA12001-120</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;OH</td><td>BDH</td><td>CABDH8641-2</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Tween 20</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6531</td><td></td></tr></tbody></table>

c. elegans chemotaxis assay

استخدام العديد من الكائنات الحية الكيميائي للبحث عن مصادر الغذاء، وتجنب المواد الضارة، وتجد زملائه. انواع معينة ايليجانس ديه السلوك الكيميائي للإعجاب. فرضية وراء اختبار استجابة من الديدان إلى الرائحة هي وضعها في منطقة ومراقبة حركة أثار ردا على الرائحة. حتى مع العديد من المقايسات المتاحة، وتحسين دودة انطلاق الموقع النسبي لكلا من التحكم ومناطق اختبار، مع التقليل من التفاعل من الديدان مع بعضها البعض، مع الحفاظ على حجم عينة كبيرة لا يزال التقدم في العمل 1-10. الطريقة الموضحة هنا يهدف لمعالجة هذه القضايا عن طريق تعديل مقايسة التي وضعتها Bargmann وآخرون. 1. وينقسم طبق بتري إلى أربعة أجزاء، وتتم تسمية اثنين من الأرباع مقابل وضع علامة &quot;اختبار&quot; واثنين من &quot;السيطرة&quot;. يتم وضع مخدر في جميع مواقع المراقبة والاختبار. يتم وضع الديدان في وسط لوحة مع circlه ملحوظ في جميع أنحاء المنشأ للتأكد من أن الديدان غير متحركة سيتم تجاهل. الاستفادة من وجود نظام أربع رباعي بدلا من واحد أو اثنين 2 1 يزيل التحيز في حركة الديدان، كما هي على مسافة واحدة من اختبار ومراقبة العينات، بغض النظر عن أي جانب من أصل بدأوا. هذا تلتف مشكلة الديدان إجبارهم على السفر من خلال مجموعة من الديدان الأخرى للرد على الرائحة، والتي يمكن أن تؤخر الديدان أو إجبارهم على اتخاذ طريقا غير مباشر، مما أسفر عن تفسير غير صحيح من طريق وجهتهم. يظهر هذا الأسلوب أيضا المزايا العملية من خلال وجود حجم عينة أكبر والسماح للباحث لتشغيل مقايسة غير المراقب ويسجل الديدان مرة واحدة انتهت صلاحية الوقت المحدد.

مقارنة البرية من نوع (N2) C. ايليجانس إلى ODR-10 (KY10) متحولة. كنا ثنائي الأسيتيل، وهي المعروفة C. ايليجانس جاذب كيميائي، لمقارنة الديدان wildtype إلى أن من الطافرة التي تفتقر إلى مستقبلات للثنائي الأسيتيل 1،12. لwildtype (N2)</e...

Watch this Scientific Journal Video about C. elegans Chemotaxis Assay at JoVE.com

C. elegans Chemotaxis Assay

وهناك طريقة لتقييم كمي لاستجابة الكيميائي من<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em&gt; يوصف. كان يعمل A مؤشر الكيميائي (CI) كوسيلة لتقييم بالضبط الرد من الديدان إلى أهداف معينة، ويكون بمثابة منصة للمقارنة بين سلالات والمركبات من الفائدة.

C. ايليجانس الانجذاب الكيميائي الفحص

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

C. elegans Chemotaxis Assay

45.6K Views.  Queen's University. وهناك طريقة لتقييم كمي لاستجابة الكيميائي من انواع معينة ايليجانس يوصف. كان يعمل A مؤشر الكيميائي (CI) كوسيلة لتقييم بالضبط الرد من الديدان إلى أهداف معينة، ويكون بمثابة منصة للمقارنة بين سلالات والمركبات من الفائدة.

Video: C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment through neuron-specific detection of food and chemical odors1, 2, and can associate nutritive states with chemical odors3, temperature4, and the pathogenicity of a food source5.
Here, we describe assays of C. elegans associative learning and short- and long-term associative memory. We modified an aversive olfactory learning paradigm6 to instead produce a positive response; the assay involves starving ~400 worms, then feeding the worms in the presence of the AWC neuron-sensed volatile chemoattractant butanone at a concentration that elicits a low chemotactic index (similar to Toroyama et al.7). A standard population chemotaxis assay1 tests the worms' attraction to the odorant immediately or minutes to hours after conditioning.
After conditioning, wild-type animals' chemotaxis to butanone increases ~0.6 Chemotaxis Index units, its "Learning Index". Associative learning is dependent on the presence of both food and butanone during training. Pairing food and butanone for a single conditioning period ("massed training") produces short-term associative memory that lasts ~2 hours. Multiple conditioning periods with rest periods between ("spaced training") yields long-term associative memory (&lt;40 hours), and is dependent on the cAMP Response Element Binding protein (CREB),6 a transcription factor required for long-term memory across species.8
Our protocol also includes image analysis methods for quick and accurate determination of chemotaxis indices. High-contrast images of animals on chemotaxis assay plates are captured and analyzed by worm counting software in MatLab. The software corrects for uneven background using a morphological tophat transformation.9 Otsu's method is then used to determine a threshold to separate worms from the background.10 Very small particles are removed automatically and larger non-worm regions (plate edges or agar punches) are removed by manual selection. The software then estimates the size of single worm by ignoring regions that are above a specified maximum size and taking the median size of the remaining regions. The number of worms is then estimated by dividing the total area identified as occupied by worms by the estimated size of a single worm.
We have found that learning and short- and long-term memory can be distinguished, and that these processes share similar key molecules with higher organisms.6,8 Our assays can quickly test novel candidate genes or molecules that affect learning and short- or long-term memory in C. elegans that are relevant across species.

C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

Here we describe methods to test C. elegans associative learning and short- and long-term associative memory. These population assays employ the worms abilities to chemotax toward volatile odorants, and form positive associations upon pairing food with the chemoattractant butanone. Increasing the number of conditioning periods induces long-term memory.

جيم ايليجانس Butanone التعلم الإيجابي ، قصيرة الأجل وطويلة الأجل فحوصات الذاكرة الترابطية

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment ...

Neuroscience

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and pathways as well as its ease of cultivation. Several C. elegans disease models have been reported, including neurodegenerative disorders such as Parkinson's disease (PD), which involves the degeneration of dopaminergic (DA) neurons 1. Both transgenes and neurotoxic chemicals have been used to induce DA neurodegeneration and consequent movement defects in worms, allowing for investigations into the basis of neurodegeneration and screens for neuroprotective genes and compounds 2,3.
Screens in lower eukaryotes like C. elegans provide an efficient and economical means to identify compounds and genes affecting neuronal signaling. Conventional screens are typically performed manually and scored by visual inspection; consequently, they are time-consuming and prone to human errors. Additionally, most focus on cellular level analysis while ignoring locomotion, which is an especially important parameter for movement disorders.
We have developed a novel microfluidic screening system (Figure 1) that controls and quantifies C. elegans' locomotion using electric field stimuli inside microchannels. We have shown that a Direct Current (DC) field can robustly induce on-demand locomotion towards the cathode ("electrotaxis") 4. Reversing the field's polarity causes the worm to quickly reverse its direction as well. We have also shown that defects in dopaminergic and other sensory neurons alter the swimming response 5. Therefore, abnormalities in neuronal signaling can be determined using locomotion as a read-out. The movement response can be accurately quantified using a range of parameters such as swimming speed, body bending frequency and reversal time.
Our work has revealed that the electrotactic response varies with age. Specifically, young adults respond to a lower range of electric fields and move faster compared to larvae 4. These findings led us to design a new microfluidic device to passively sort worms by age and phenotype 6.
We have also tested the response of worms to pulsed DC and Alternating Current (AC) electric fields. Pulsed DC fields of various duty cycles effectively generated electrotaxis in both C. elegans and its cousin C. briggsae 7. In another experiment, symmetrical AC fields with frequencies ranging from 1 Hz to 3 KHz immobilized worms inside the channel 8.
Implementation of the electric field in a microfluidic environment enables rapid and automated execution of the electrotaxis assay. This approach promises to facilitate high-throughput genetic and chemical screens for factors affecting neuronal function and viability.

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

A semi-automated micro-electro-fluidic method to induce on-demand locomotion in Caenorhabditis elegans is described. This method is based on the neurophysiologic phenomenon of worms responding to mild electric fields (&#x201C;electrotaxis&#x201D;) inside microfluidic channels. Microfluidic electrotaxis serves as a rapid, sensitive, low-cost, and scalable technique to screen for factors affecting neuronal health.

انجذاب كهربي المستندة ميكروفلويديك للتحليل الكمي بناء على الطلب<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em&gt; &#39;تنقل

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

Bioengineering

Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection of the neural circuits underlying these behaviors, the development of robust and reproducible behavioral assays is necessary. Previous C. elegans behavioral studies have used variations of a "drop test", a "chemotaxis assay", and a "retention assay" to investigate the response of C. elegans to soluble compounds. The method described in this article seeks to combine the complementary strengths of the three aforementioned assays. Briefly, a small circle in the middle of each assay plate is divided into four quadrants with the control and experimental solutions alternately placed. After the addition of the worms, the assay plates are loaded into a behavior chamber where microscope cameras record the worms' encounters with the treated regions. Automated video analysis is then performed and a preference index (PI) value for each video is generated. The video acquisition and automated analysis features of this method minimizes the experimenter's involvement and any associated errors. Furthermore, minute amounts of the experimental compound are used per assay and the behavior chamber's multi-camera setup increases experimental throughput. This method is particularly useful for conducting behavioral screens of genetic mutants and novel chemical compounds. However, this method is not appropriate for studying stimulus gradient navigation due to the close proximity of the control and experimental solution regions. It should also not be used when only a small population of worms is available. While suitable for assaying responses only to soluble compounds in its current form, this method can be easily modified to accommodate multimodal sensory interaction and optogenetic studies. This method can also be adapted to assay the chemosensory responses of other nematode species.

We present a behavior recording setup and protocol that enables automated analysis of the nematode, Caenorhabditis elegans' preference for soluble compounds in a population-based assay. This article describes the construction of a behavior chamber, the behavioral assay protocol, and video analysis software usage.

التحليل الآلي من النيماتودا القائم على السكان الحسية الكيميائية تفضيل التفضيل

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection ...

Behavior

<meta charset="utf8"></head><body>استخراج واستجابات الفرمون الجنسي المتطاير وقياسها في C. ايليجانس

Volatile Sex Pheromone Extraction and Chemoattraction Assay in Caenorhabditis elegans

Chemical communication is vital in organismal health, reproduction, and overall well-being. Understanding the molecular pathways, neural processes, and computations governing these signals remains an active area of research. The nematode Caenorhabditis elegans provides a powerful model for studying these processes as it produces a volatile sex pheromone. This pheromone is synthesized by virgin females or sperm-depleted hermaphrodites and serves as an attractant for males.
This protocol describes a detailed method for isolating the volatile sex pheromone from several C. elegans strains (WT strain N2, daf-22, and fog-2) and C. remanei. We also provide a protocol for quantifying the male chemotaxis response to the volatile sex pheromone. Our analysis utilizes measurements such as chemotaxis index (C.I.), arrival time (A.T.), and a trajectory plot to compare male responses under various conditions accurately. This method allows for robust comparisons between males of different genetic backgrounds or developmental stages. Furthermore, the experimental setup outlined here is adaptable to investigating other chemoattraction chemicals.

<meta charset="utf8"></head><body>أضواء الكاتب: فحص تأثير الفرمون الجنسي المتطاير على سلوك C. ايليجانس الذكري

This protocol establishes methods for extracting and quantifying responses to the volatile sex pheromone in C. elegans, providing tools to study chemical communication and navigation trajectory.

استخراج الفرمون الجنسي المتطاير ومقايسة الجذب الكيميائي في Caenorhabditis elegans

Chemical communication is vital in organismal health, reproduction, and overall well-being. Understanding the molecular pathways, neural processes, and ...

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to infection. A common method to measure chemotaxis is the Boyden chamber assay, in which cells and chemoattractant are separated by a porous membrane. As cells migrate through the membrane toward the chemoattractant, they adhere to the underside of the membrane, or fall into the underlying media, and are subsequently stained and visually counted 1. In this method, cells are exposed to a steep and transient chemoattractant gradient, which is thought to be a poor representation of gradients found in tissues 2.
Another assay system, the under-agarose chemotaxis assay, 3, 4 measures cell movement across a solid substrate in a thin aqueous film that forms under the agarose layer. The gradient that develops in the agarose is shallow and is thought to be an appropriate representation of naturally occurring gradients. Chemotaxis can be evaluated by microscopic imaging of the distance traveled. Both the Boyden chamber assay and the under-agarose assay are usually configured as endpoint assays.
The automated ECIS/Taxis system combines the under-agarose approach with Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) 5, 6. In this assay, target electrodes are located in each of 8 chambers. A large counter-electrode runs through each of the 8 chambers (Figure 2). Each chamber is filled with agarose and two small wells are the cut in the agarose on either side of the target electrode. One well is filled with the test cell population, while the other holds the sources of diffusing chemoattractant (Figure 3). Current passed through the system can be used to determine the change in resistance that occurs as cells pass over the target electrode. Cells on the target electrode increase the resistance of the system 6. In addition, rapid fluctuations in the resistance represent changes in the interactions of cells with the electrode surface and are indicative of ongoing cellular shape changes. The ECIS/Taxis system can measure movement of the cell population in real-time over extended periods of time, but is also sensitive enough to detect the arrival of a single cell at the target electrode. 
Dictyostelium discoidium is known to migrate in the presence of a folate gradient 7, 8 and its chemotactic response can be accurately measured by ECIS/Taxis 9. Leukocyte chemotaxis, in response to SDF1&alpha; and to chemotaxis antagonists has also been measured with ECIS/Taxis 10, 11. An example of the leukocyte response to SDF1&alpha; is shown in Figure 1.

The ECIS/Taxis system is an automated, real-time assay that measures cellular chemotaxis. In this assay, cells move beneath a layer of agarose to arrive at a target electrode. Cellular movement is measured by the onset of resistance to AC current 0.

قياس من الانجذاب الكيميائي الخلوي مع ECIS / سيارات الأجرة

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to ...

Aversive Associative Learning and Memory Formation by Pairing Two Chemicals in Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is an attractive model organism to study learning and memory at molecular and cellular levels because of the simplicity of its nervous system, whose chemical and electrical wiring diagrams were completely reconstructed from serial electron micrographs of thin sections. Here, we describe detailed protocols for the conditioning of C. elegans by massed and spaced training for the formation of short-term memory (STM) and long-term memory (LTM), respectively. By pairing 1-propanol and hydrochloric acid as conditioned and unconditioned stimuli, respectively, C. elegans was successfully trained to form aversive associative STM and LTM. While na&#239;ve animals were attracted to 1-propanol, the trained animals were no longer or very weakly attracted to 1-propanol. Like in other organisms such as Aplysia and Drosophila, "learning and memory genes" play essential roles in memory formation. Particularly, NMDA-type glutamate receptors, expressed in only six pairs of interneurons in C. elegans, are required for the formation of both STM and LTM, possibly as a coincidence factor. Therefore, the memory trace may reside among the interneurons.

Aversive Associative Learning and Memory Formation by Pairing Two Chemicals in Caenorhabditis elegans

We have previously developed protocols for Caenorhabditis elegans to form short- and long-term associative memories by massed and spaced training, respectively. Here, detailed protocols are described for the conditioning of C. elegans by pairing 1-propanol and hydrochloric acid as conditioned and unconditioned stimuli, respectively, to form aversive associative memory.

التعلم الترابطي الانعكاسي وتكوين الذاكرة عن طريق إقران مادتين كيميائيتين في Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is an attractive model organism to study learning and memory at molecular and cellular levels because of the ...

Chemotaxis is a process in which cells or organisms move in response to a chemical stimulus. In nature, chemotaxis is important for organisms to sense and move toward food sources and move away from stimuli that may be toxic or harmful. Chemotaxis is also important at the cellular level. For example, chemotaxis is required for the movement of sperm toward an egg prior to fertilization. In the lab, chemotaxis is frequently examined in the nematode, C. elegans, which is known to migrate towards food sources in soil, but away from toxins such as heavy metals, substances with a low pH, and detergents. This video demonstrates how to perform a chemotaxis assay, which includes preparing the chemotaxis plates and the worms, running the assay, and analyzing the data. Then, we discuss examples of how chemotaxis assays can be used in C. elegans as a tool to understand learning and memory, olfactory adaptation, and neurological disease such as Alzheimer&quot;s disease. Chemotaxis experiments in C. elegans have near-limitless possibilities for learning more about the cellular and genetic mechanisms of many biological processes, and may lead to a greater understanding of human biology, development, and disease.

Chemotaxis Assay in Caenorhabditis elegans

Chemotaxis is a process in which cells or organisms move in response to a chemical stimulus. In nature, chemotaxis is important for organisms to sense and ...

Education

JoVE Science Education

Basic Biology

Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

C. elegans Survival Assay: A Short-Term Toxicity Test

Source: Possik, E. and Pause, A. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/video/2496/measuring-caenorhabditis-elegans-life-span-96-well-microtiter">Measuring Oxidative Stress Resistance of&#160;Caenorhabditis elegans&#160;in 96-well Microtiter Plates.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2015).
This video introduces a short-term survival assay that tests a treatment for acute toxicity or tests a genetic strain for resistance to a toxic condition.&#160; The example protocol shows an example survival assay in which worms are tested for their ability to&#160; resist oxidative stress induced by paraquat (PQ).

ج. ايليجانس اختبار البقاء على قيد الحياة: اختبار سمية قصير المدى

Source: Possik, E. and Pause, A. Measuring Oxidative Stress Resistance of&#160;Caenorhabditis elegans&#160;in 96-well Microtiter Plates.&#160;J. Vis. Exp. ...

C. ايليجانس الانجذاب الكيميائي الفحص

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

جيم ايليجانس Butanone التعلم الإيجابي ، قصيرة الأجل وطويلة الأجل فحوصات الذاكرة الترابطية

انجذاب كهربي المستندة ميكروفلويديك للتحليل الكمي بناء على الطلب

التحليل الآلي من النيماتودا القائم على السكان الحسية الكيميائية تفضيل التفضيل

استخراج الفرمون الجنسي المتطاير ومقايسة الجذب الكيميائي في Caenorhabditis elegans

استخراج الفرمون الجنسي المتطاير ومقايسة الجذب الكيميائي في Caenorhabditis elegans

استخراج الفرمون الجنسي المتطاير ومقايسة الجذب الكيميائي في Caenorhabditis elegans

قياس من الانجذاب الكيميائي الخلوي مع ECIS / سيارات الأجرة

التعلم الترابطي الانعكاسي وتكوين الذاكرة عن طريق إقران مادتين كيميائيتين في Caenorhabditis elegans

C. elegans Chemotaxis Assay

ج. ايليجانس اختبار البقاء على قيد الحياة: اختبار سمية قصير المدى