Name: collection and cryopreservation of hamster oocytes and mouse embryos
Uploaded: 2009-03-27T00:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos at JoVE.com

وأيد هذا العمل من قبل MINISTERIO Ciencia الاسبانية دي ذ Educación (BIO 2006-11792) وكتالونيا دي كاتالونيا (2005 SGR00437). وأود أن أشكر كتاب مارك لوكاس Jonatan Puigcerver ولما قدموه من مساعدة فنية في إعداد وسائل الإعلام. ومن المسلم به جميع الموظفين من Estabulari ديفوار Servei للإسكان الحيوانات ، وخصوصا خوان خوسيه مارتن وخافيير بنيتو لمساهمتهم إضافية حول تسجيل جزء من هذا الفيديو. البنك الأهلي التجاري هو زميل في الفقرة قرينتها البرتغالية ه Ciência بحوث والتكنولوجيا وسان جرمان هو زميل إسباني MINISTERIO دي Educación Ciencia ذ.

أجريت رعاية الحيوان والإجراءات وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وافقت عليها لجنة الأخلاقيات في بحوث الحيوان والإنسان في جامعة برشلونة المستقلة ، إسبانيا. أولا جمع سيت <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وحدد الاختيار الهامستر الإناث (Mesocricetus auratus ؛ 12/08 الاسبوع القديمة) من سلالة السوري الذهبي عن وجود إفرازات مهبلية سميكة (التفريغ بعد الإباضي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حمل الإناث المحدد إلى superovulate عن طريق الحقن داخل الصفاق من 40 وحدة دولية من PMSG (ماري الحامل مصل موجهة الغدد التناسلية) ، يليه 40 وحدة دولية من (موجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية) قوات حرس السواحل الهايتية 60 ساعة في وقت لاحق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هامستر أنثى الموت ببطء بعد 16 ساعة من إدارة قوات حرس السواحل الهايتية في غرفة الكربون ثاني أكسيد الكربون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل ناقلة البيضات من الإناث كما هو مبين في الفيديو ونقلها إلى قطرة من KSOM - H المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع البويضة ، قزع المجمعات التي تمزق أمبولة قناة البيض تحت المجهر مجسمة في قطرة من هيالورونيداز (156 U / مل) على 37 درجة مئوية. وسيتم اطلاق سراح من خلايا البويضات الركامية في حوالي 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط البويضات من هيالورونيداز وغسلها مرتين في KSOM - H المتوسط. </li></ol> لجمع أجنة الفئران والفئران الإناث (المصحف العضلة ؛ 6-8 الاسبوع القديمة) وحثهم على superovulate عن طريق الحقن داخل الصفاق من 5 وحدة دولية من PMSG تليها 5 وحدة دولية من 48 ساعة في وقت لاحق قوات حرس السواحل الهايتية وتزاوج مع الفئران الذكور. وضحى الاناث ، من خلال عنق الرحم في خلع 24-26 ، 44-46 أو 54-56 بعد ساعات من إدارة قوات حرس السواحل الهايتية لobtention pronuclear التوالي من 2 خلايا الأجنة أو مرحلة 4 خلايا ، ،. يتم تنفيذ مجموعة من الأجنة pronuclear تماما كما وصفها لالبويضات الهامستر. يتم جمع الأجنة في المراحل 2 - الخلية والخلية 4 * شطف ناقلة البيضات مع KSOM - H المتوسطة [6]. ملاحظة : بعد هذا البروتوكول يمكن جمع حوالي 20 إلى 30 البويضات / الأجنة الإناث من كل. II. إعداد تجميد والذوبان حلول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل لي تمييع 0.57 مل من propilenglycol في 5 مل من KSOM - H (1.5 م من propilenglycol). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل ذوبان بإضافة 2 مل من KSOM - H إلى أنبوب مع السكروز ز 0.2052 (0.3 م من السكروز). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل تجميد بإضافة 2 مل من محلول الأول لأنبوب مع السكروز ز 0.0684 (1.5 م و 0.1 من propilenglycol السكروز M). </li></ol> ملاحظة : يجب أن أكون مستعدا الحل والتجميد والذوبان حلول عادلة قبل استخدامها. ومع ذلك ، قد تكون مرجحة لكميات محددة من السكروز لاستخدامها في التحضير للتجميد والذوبان في حلول مسبقة وتخزينها في أنابيب ML - 3 في درجة حرارة الغرفة لعدة أشهر. III. تجميد البروتوكول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل البويضات / الأجنة من المتوسط ​​KSOM - H إلى انخفاض الحل الأول واحتضان ل15/07 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وفي الوقت نفسه ، بإعداد طبق بتري 90 ملم لتحميل القش عن طريق وضع قطرات 90 ميكرولتر من التجمد والذوبان الحلول كما هو مبين في الفيديو (1 قطرة من كل حل / القش). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل العدد المرغوب فيه من البويضات / الأجنة إلى حل تجميد قطرات. ملاحظة : نقوم بنقل عادة ما بين 5-30 البويضات أو الأجنة / قطرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق القش لتطلع نظام للرقابة والفم تحميله التالية بهذا الترتيب : الحل الأول ، والهواء ، وانخفاض تجميد البويضات مع والهواء وانخفاض ذوبان الجليد ، والهواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد أن يتم تحميل القش ، والحفاظ على الشفط حتى أول انخفاض قدم (الحل الأول) تصل إلى البوليمر في نهاية العلوي من القش والأختام هذه الغاية. الحرارية ختم الطرف الآخر من القش أو الختم مع المكونات البلاستيكية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل في الثلاجة للبرمجة وحدد البرنامج التجمد. ويستند البرنامج تجميد المستخدمة في هذا البروتوكول على معدلات التبريد نشرت أصلا لاسال وآخرون. [7] : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 درجة مئوية / دقيقة من درجة حرارة الغرفة ل-7 درجة مئوية 0 درجة مئوية / دقيقة لمدة 10 دقيقة للسماح لموازنة درجة الحرارة وتحريض بذر (أنظر أدناه) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.3 درجة مئوية / دقيقة من -7 -30 درجة مئوية إلى درجة مئوية 0 درجة مئوية / دقيقة لمدة 2 دقيقة للسماح لموازنة درجة الحرارة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 35 درجة مئوية / دقيقة من -30 درجة مئوية إلى -130 درجة مئوية </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل القش على فتحات لصاحب الثلاجة للبرمجة ، والتأكد من أن جزءا من القش مع ذوبان قطرة من حل تواجه الخارج. بدء برنامج التجميد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما تصل درجة حرارة العينة -7 درجة مئوية وتبريد قيد الانتظار ، نفذ دليل البذر : ملقط يغرق في النيتروجين السائل ، وسحب أصحاب قليلا من خارج الثلاجة لكشف جزء من القش التي تحتوي على قطرات من ذوبان الحل ، وعلى الفور لمس هذا الجزء من القش مع ملقط. كرر لكل حامل والقش في كل حامل ، واسمحوا ثم تجميد برنامج تشغيل حتى النهاية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما يتم الانتهاء من البرنامج ، يغرق في حملة النيتروجين السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة من القشأصحاب ونقلها إلى gobelet المسمى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أخيرا ، تخزين gobelet داخل خزان النتروجين السائل. </li></ol> رابعا. ذوبان بروتوكول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة القش من خزان النتروجين السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على القش في درجة حرارة الغرفة لمدة 40 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقع القش في حمام الماء عند 30 درجة مئوية خلال 40 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المكونات من قش أو خفض رأس الحرارية مختوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إفراغ القش في طبق بتري 35 ملم والمزيج برفق قطرات يحتويان على تجميد والذوبان الحلول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك البويضات / الأجنة في الخليط لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل البويضات / الأجنة إلى هبوط جديد للKSOM - H لمدة 15 دقيقة إضافية بلغت 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البويضات / الأجنة على استعداد الآن للتلاعب أخرى. </li></ol> ملاحظة : أثناء الخطوتين 6 و 7 سترى أن إذابة البويضات / الأجنة تنتفخ ببطء بسبب الجفاف. خامسا نتائج الممثل وذكرت واستخدام بروتوكول الحفظ بالتبريد هنا النتائج في معدل البقاء على قيد الحياة من حوالي 95 ٪ للبويضات وحيوانات أليفة 90 ٪&gt; ، 85 ٪ و 80 ٪ للأجنة B6CBAF1 الماوس في pronuclear ، 2 خلية خلية مراحل و 4 على التوالي. عندما يتم تربيتها في المختبر أجنة فئران في KSOM بعد ذوبان الجليد ، وينبغي أن لا يقل عن 70 إلى 80 ٪ تصل إلى مرحلة الكيسة الثقافة في ظروف مثلى. فمن المستحسن أن تقوم بتضمين مجموعة التحكم (القش) من البويضات / الأجنة في كل تجربة تجميد والذي أذاب هذه المجموعة قبل أن يتم استخدام ما تبقى من البويضات / الأجنة لمزيد من التلاعب. إذا كانت معدلات البقاء على قيد الحياة لمجموعة المراقبة هي أقل مما كان متوقعا ، أذاب آخر القش من الكثير واحد. إذا كانت معدلات البقاء على قيد الحياة لهذه المجموعة الثانية هي أيضا منخفضة ، وتجاهل القش المتبقي من هذا الكثير التجمد.

<ol>
	<li>Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+mouse+embryos+frozen+to+-196+and+-269+&#176;C.">Survival of mouse embryos frozen to -196 and -269 &#176;C.</a> Science. 178, 411-414 (1972).</li><li>Wilmut, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cooling+rate,+warming+rate,+cryoprotective+agent+and+stage+of+development+on+survival+of+mouse+embryos+during+freezing+and+thawing.">The effect of cooling rate, warming rate, cryoprotective agent and stage of development on survival of mouse embryos during freezing and thawing.</a> Life Sci. 11, 1071-1079 (1972).</li><li>Parkening, T. A., Tsunoda, Y., Chang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+various+low+temperatures,+cryoprotective+agents+and+cooling+rates+on+the+survival,+fertilizability+and+development+of+frozen-thawed+mouse+eggs.">Effects of various low temperatures, cryoprotective agents and cooling rates on the survival, fertilizability and development of frozen-thawed mouse eggs.</a> J. Exp. Zool. 197, 369-374 (1976).</li><li>Schneider, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryobiological+principles+of+embryo+freezing.">Cryobiological principles of embryo freezing.</a> J. In Vitro Fert. Embryo Transf. 3, 3-9 (1986).</li><li>Vajta, G., Kuwayama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+cryopreservation+systems.">Improving cryopreservation systems.</a> Theriogenology. 65, 236-244 (2006).</li><li>Duselis, A. R., Vrana, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrieval+of+mouse+oocytes.">Retrieval of mouse oocytes.</a> JoVE. 3, (2007).</li><li>Lassalle, B., Testart, J., Renard, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryo+features+that+influence+the+success+of+cryopreservation+with+the+use+of+1,2+propanediol.">Human embryo features that influence the success of cryopreservation with the use of 1,2 propanediol.</a> Fertil. Steril. 44, 645-651 (1985).</li><li>Ib&#225;&#241;ez, E., Grossmann, M., Vidal, F., Egozcue, J., Santal&#243;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+caprine+beta-lactoglobulin+transgenic+mouse+embryos.">Cryopreservation of caprine beta-lactoglobulin transgenic mouse embryos.</a> Cryobiology. 35, 290-298 (1997).</li><li>Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+genotype+on+the+efficiency+of+mouse+embryo+cryopreservation+by+vitrification+or+slow+freezing.">Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing.</a> Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).</li><li>Tateno, H., Kamiguchi, Y., Mikamo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+freezing+and+thawing+method+of+hamster+oocytes+designed+for+both+the+penetration+test+and+chromosome+assay+of+human+spermatozoa.">A freezing and thawing method of hamster oocytes designed for both the penetration test and chromosome assay of human spermatozoa.</a> Mol. Reprod. Dev. 33, 202-209 (1992).</li><li>Biggers, J., McGuinnis, L. K., Raffin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acids+and+preimplantation+development+of+the+mouse+in+the+protein-free+KSOM.">Amino acids and preimplantation development of the mouse in the protein-free KSOM.</a> Biol. Reprod. 63, 281-293 (2000).</li></ol>

يمكن أن يكون هذا مع البويضات والأجنة الهامستر بروتوكول الماوس cryopreserved بنجاح. المجمدة مرة واحدة ، يمكن تخزين البويضات / الأجنة في النيتروجين السائل الدبابات إلى أجل غير مسمى وتسترد في أي زمان أو مكان المطلوب. هذا يوفر ميزة وجود عينات جاهزة تقريبا لاستخدام كلما دعت الحاجة. من ناحي?...

<table><tbody><tr><td>Material Name</td><td>Type</td><td>Company</td><td>Catalogue Number</td><td>Comment</td></tr><tr><td>French type mini-straw 0.25 ml</td><td></td><td>Mini-tub</td><td>13407/0010</td><td></td></tr><tr><td>hCG</td><td></td><td>Farma-Lepori, Spain</td><td>749036.4</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td></td><td>Sigma</td><td>H-3884</td><td></td></tr><tr><td>KSOM-H medium</td><td></td><td></td><td></td><td>Ref. [11]</td></tr><tr><td>Liquid Nitrogen </td><td></td><td>Air Liquide</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastic plugs</td><td></td><td>Mini-tub</td><td>19046</td><td></td></tr><tr><td>PMSG</td><td></td><td>Intervet, Spain</td><td>1.614/8447</td><td></td></tr><tr><td>Propilenglycol</td><td></td><td>Fluka</td><td>82280</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td></td><td>Merck</td><td>107687</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Scissors</td><td></td><td>Aesculap</td><td>BC-060R; BG-061R</td><td></td></tr><tr><td>Thermo-sealer</td><td></td><td>SIZ</td><td>220</td><td></td></tr><tr><td>35 and 90 mm culture dishes</td><td></td><td>Nunc</td><td>153066; 150350</td><td></td></tr><tr><td>10 ml tubes</td><td></td><td>Greiner Bio-one</td><td>163160</td><td></td></tr><tr><td>Nitrogen tank</td><td></td><td>MVE, Cryogenics</td><td>XC 43/28</td><td></td></tr><tr><td>Programmable Freezer</td><td></td><td>Planner Products Ltd.</td><td>Kryo-10 Series III</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td></td><td>Aesculap</td><td>BD-331R; BD-053R; OC-020R</td><td></td></tr></tbody></table>

collection and cryopreservation of hamster oocytes and mouse embryos

وكانت أول أجنة البويضات cryopreserved بنجاح أكثر من 30 عاما مضت ، عندما يتنغهام<i&gt; وآخرون.</i&gt;<sup&gt; 1</sup&gt; ويلموت<sup&gt; 2</sup&gt; صفها بشكل منفصل يمكن أن يتم تجميد الأجنة وتخزينها على الماوس -196 درجة مئوية ، وبعد سنوات قليلة ، Parkening<i&gt; وآخرون</i&gt;.<sup&gt; 3</supذكرت&gt; ولادة نسل الحية الناتجة عن التخصيب في المختبر (IVF) من البويضات cryopreserved. منذ ذلك الحين ، انتشر استخدام تقنيات الحفظ بالتبريد سريعا ليصبح عنصرا أساسيا في ممارسة المساعدة على الإنجاب البشري والحيواني والحفاظ على الموارد الوراثية الحيوانية. حاليا ، هناك اثنين من الطرق الرئيسية المستخدمة لcryopreserve البويضات والأجنة : تجميد بطيئة والتزجيج. وقد استخدمت مجموعة متنوعة واسعة من النهج في محاولة لتحسين كل من التقنيات والملايين من الحيوانات والآلاف من الأطفال قد ولدوا من أجنة cryopreserved. ومع ذلك ، وأوجه القصور الهامة المرتبطة الحفظ بالتبريد لا يزال يتعين التغلب عليها ، ومنذ تشكيل الجليد الكريستال ، وآثار الصدمة التناضحي الحل ويبدو أن السبب cryoinjuries عدة في مرحلة ما بعد إذابة البويضات والأجنة. تجميد التجميد البطيء مع برمجة لديه ميزة استخدام تركيزات منخفضة من cryoprotectants ، التي ترتبط عادة مع المواد الكيميائية والسمية التناضحي صدمة ، ولكن قدرتها محدودة لتجنب الجليد تشكيل الكريستال في تركيزات منخفضة. التجميد البطيء يدفع أيضا آثار supercooling أنه يجب تجنب استخدام بذر يدوية أو أوتوماتيكية<sup&gt; 4</sup&gt;. في عملية التزجيج ، تركيزات عالية من cryoprotectants يمنع تشكيل بلورات الجليد ، وتؤدي إلى تشكيل دولة المزجج شبيهة بالزجاج التي توطد الماء ، ولكن لا الموسعة. ومع ذلك ، ونظرا لسمية cyroprotectants في التركيزات المستخدمة ، لا يمكن إلا البويضات / الأجنة أن تتعرض للحل cryoprotectant لفترة قصيرة جدا من الزمن ، والحل في حجم الحد الأدنى ، وذلك قبل غمر العينات مباشرة في النيتروجين السائل<sup&gt; 5</sup&gt;. في العقد الأخير ، أصبح أكثر شعبية التزجيج لأنه هو وسيلة سريعة جدا التي تتطلب أية معدات باهظة الثمن (الفريزر برمجة). ومع ذلك ، يستمر التجميد البطيء ليكون الأسلوب الأكثر استخداما لالبويضة / جنين الحفظ بالتبريد. في هذا المقال نعرض الفيديو ، خطوة بخطوة ، وكيفية جمع وتجميد البويضات ببطء الهامستر مع ارتفاع معدلات البقاء على قيد الحياة بعد ذوبان الجليد. يمكن أيضا أن يطبق نفس الإجراء لتجميد والذوبان بنجاح أجنة فئران في مراحل مختلفة من التطور سابق للانغراس.

Watch this Scientific Journal Video about Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos at JoVE.com

Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos

في هذه المقالة عن طريق الفيديو نقدم مظاهرة خطوة بخطوة حول كيفية جمع البويضات وcryopreserve الهامستر مع ارتفاع معدلات البقاء على قيد الحياة بعد ذوبان الجليد. يمكن أيضا أن يطبق نفس الإجراء لتجميد والذوبان بنجاح أجنة فئران في مراحل مختلفة من التطور سابق للانغراس.

جمع والحفظ بالتبريد من البويضات والأجنة الهامستر ماوس

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse ...

collection-and-cryopreservation-of-hamster-oocytes-and-mouse-embryos

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

16.9K Views.  Universitat Autonoma de Barcelona. في هذه المقالة عن طريق الفيديو نقدم مظاهرة خطوة بخطوة حول كيفية جمع البويضات وcryopreserve الهامستر مع ارتفاع معدلات البقاء على قيد الحياة بعد ذوبان الجليد. يمكن أيضا أن يطبق نفس الإجراء لتجميد والذوبان بنجاح أجنة فئران في مراحل مختلفة من التطور سابق للانغراس.

Video: Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos

Retrieval of Mouse Oocytes

To date, only a few studies have reported successful manipulations of Peromyscus embryogenesis or reproductive biology.  Together with the Peromyscus Genetic Stock Center (http://stkctr.biol.sc.edu), we are characterizing the salient differences needed to develop this system.  A primary goal has been to optimize oocyte/early embryo retrieval.

This protocol illustrates the technique for extracting oocytes or early-stage fertilized embryos from the oviduct of mice. The ability to identify the infindibulum and insert a blunt end needle into it is essential to correctly performing the procedure.

استرجاع البويضات ماوس

To date, only a few studies have reported successful manipulations of Peromyscus embryogenesis or reproductive biology.  Together with the Peromyscus ...

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines retain the ability to either self-renew or differentiate under specific conditions. Due to these properties, mESC are a useful tool in regenerative medicine, disease modeling, and tissue engineering studies. This article describes a simple protocol to obtain mESC lines with high derivation efficiencies (60-80%) by culturing blastocysts from permissive mouse strains on feeder cells in defined medium supplemented with leukemia inhibitory factor. The protocol can also be applied to efficiently derive mESC lines from non-permissive mouse strains, by the simple addition of a cocktail of two small-molecule inhibitors to the derivation medium (2i medium). Detailed procedures on the preparation and culture of feeder cells, collection and culture of mouse embryos, and derivation and culture of mESC lines are provided. This protocol does not require specialized equipment and can be carried out in any laboratory with basic mammalian cell culture expertise.

This article describes a protocol to efficiently derive and culture pluripotent stem cell lines from mouse embryos at the blastocyst stage.

اشتقاق خطوط الخلايا الجذعية من الأجنة الجيني الماوس

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Developmental Biology

Use of Freeze-thawed Embryos for High-efficiency Production of Genetically Modified Mice

The use of genetically modified (GM) mice has become crucial for understanding gene function and deciphering the underlying mechanisms of human diseases. The CRISPR/Cas9 system allows researchers to modify the genome with unprecedented efficiency, fidelity, and simplicity. Harnessing this technology, researchers are seeking a rapid, efficient, and easy protocol for generating GM mice. Here we introduce an improved method for cryopreservation of one-cell embryos that leads to a higher developmental rate of the freeze-thawed embryos. By combining it with optimized electroporation conditions, this protocol allows for the generation of knockout and knock-in mice with high efficiency and low mosaic rates within a short time. Furthermore, we show a step-by-step explanation of our optimized protocol, covering CRISPR reagent preparation, in vitro fertilization, cryopreservation and thawing of one-cell embryos, electroporation of CRISPR reagents, mouse generation, and genotyping of the founders. Using this protocol, researchers should be able to prepare GM mice with unparalleled ease, speed, and efficiency.

Here, we present a modified method for cryopreservation of one-cell embryos as well as a protocol that couples the use of freeze-thawed embryos and electroporation for the efficient generation of genetically modified mice.

استخدام الأجنة المذابة بالتجميد لإنتاج الفئران المعدلة وراثياً بكفاءة عالية

The use of genetically modified (GM) mice has become crucial for understanding gene function and deciphering the underlying mechanisms of human diseases. ...

Genetics

Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to promote biodiversity preservation. In felids, most species are threatened with extinction, and domestic breeds are used as a model to increase the efficiency of protocols for germplasm banking. Among oocyte cryopreservation techniques, vitrification is more and more popular in human and veterinary assisted reproduction. Cryotop vitrification, which was at first developed for human oocytes and embryos, has demonstrated to be well-suited for cat oocytes. This method offers several advantages, such as the feasibility in field conditions and the speed of the procedure, which can be helpful when several samples need to be processed. However, the efficiency is strongly dependent on the operator&#8217;s skills, and intra- and inter-laboratory standardization are needed, as well as personnel training. This protocol describes minimum volume vitrification of immature feline oocytes on a commercial support in a step by step field-friendly protocol, from oocyte collection to warming. Following the protocol, preservation of oocyte integrity and viability at warming (as high as 90%) can be expected, although there is still room for improvement in post-warming maturation and embryonic development outcomes.

This manuscript describes a protocol for the minimum volume vitrification of immature cat oocytes with laboratory-made media on commercial supports. It covers every step from oocyte isolation from ex vivo gonads to vitrification and warming.

الحد الأدنى من حجم الحساسية من البويضات غير ناضجة القطط

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells. In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Haploid gametes form through species-specific developmental programs that are coupled to meiosis. The first meiotic division (MI) is unique to meiosis because sister chromatids remain attached while homologous chromosomes are segregated. For reasons not fully understood, this reductional division is prone to errors and is more commonly the source of aneuploidy than errors in meiosis II (MII) or than errors in male meiosis 1,2. 
In mammals, oocytes arrest at prophase of MI with a large, intact germinal vesicle (GV; nucleus) and only resume meiosis when they receive ovulatory cues. Once meiosis resumes, oocytes complete MI and undergo an asymmetric cell division, arresting again at metaphase of MII. Eggs will not complete MII until they are fertilized by sperm. Oocytes also can undergo meiotic maturation using established in vitro culture conditions 3. Because generation of transgenic and gene-targeted mouse mutants is costly and can take long periods of time, manipulation of female gametes in vitro is a more economical and time-saving strategy. 
Here, we describe methods to isolate prophase-arrested oocytes from mice and for microinjection. Any material of choice may be introduced into the oocyte, but because meiotically-competent oocytes are transcriptionally silent 4,5 cRNA, and not DNA, must be injected for ectopic expression studies. To assess ploidy, we describe our conditions for in vitro maturation of oocytes to MII eggs. Historically, chromosome-spreading techniques are used for counting chromosome number 6. This method is technically challenging and is limited to only identifying hyperploidies. Here, we describe a method to determine hypo-and hyperploidies using intact eggs 7-8. This method uses monastrol, a kinesin-5 inhibitor, that collapses the bipolar spindle into a monopolar spindle 9 thus separating chromosomes such that individual kinetochores can readily be detected and counted by using an anti-CREST autoimmune serum. Because this method is performed in intact eggs, chromosomes are not lost due to operator error.

Oocytes are prone to aneuploidy due to errors in chromosome segregation during meiotic maturation. Aneuploid eggs can cause infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Here, we describe methods to introduce materials of choice into oocytes and methods to study meiotic maturation and assess ploidy.

الماوس Microinjection سيت ، والنضج وتقييم الصيغة الصبغية

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic modifications and the number is consistently increasing year by year. Its technical development started with slow freezing methods in the 1970s1, then followed by vitrification methods developed in the late 1980s2. Generally, the latter technique is advantageous in its quickness, simplicity, and high survivability of recovered embryos. However, the cryoprotectants contained are highly toxic and may affect subsequent embryo development. Therefore, the technique was not applicable to certain strains of mice, even when the solutions are cooled to 4&deg;C to mitigate the toxic effect during embryo handling. At the RIKEN BioResource Center, more than 5000 mouse strains with different genetic backgrounds and phenotypes are maintained3, and therefore we have optimized a vitrification technique with which we can cryopreserve embryos from many different strains of mice, with the benefits of high embryo survival after vitrifying and thawing (or liquefying, more precisely) at the ambient temperature4.
Here, we present a vitrification method for mouse embryos that has been successfully used at our center. The cryopreservation solution contains ethylene glycol instead of DMSO to minimize the toxicity to embryos5. It also contains Ficoll and sucrose for prevention of devitrification and osmotic adjustment, respectively. Embryos can be handled at room temperature and transferred into liquid nitrogen within 5 min. Because the original method was optimized for plastic straws as containers, we have slightly modified the protocol for cryotubes, which are more easily accessible in laboratories and more resistant to physical damages. We also describe the procedure of thawing vitrified embryos in detail because it is a critical step for efficient recovery of live mice. These methodologies would be helpful to researchers and technicians who need preservation of mouse strains for later use in a safe and cost-effective manner.

An ethylene glycol-based vitrification method for mouse embryos is described. It is advantageous to other methods in its simplicity and low embryonic toxicity, and therefore can be broadly applicable to many strains of mice, including inbred and gene-modified mice.

الحفظ بالتبريد من أجنة الفئران التي التزجيج جلايكول الإثيلين ، واستنادا

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies. Many of these valuable animals exist only as live animals, with no backup plan in case of emergency. Cryopreservation of embryos can provide this backup, but is costly, can be a lengthy procedure, and generally requires a large number of animals for success. Since the discovery that mouse sperm can be successfully cryopreserved with a basic cryoprotective agent (CPA) consisting of 18&#37; raffinose and 3&#37; skim milk, sperm cryopreservation has become an acceptable and cost-effective procedure for archiving, distributing and recovery of these valuable strains.
 Here we demonstrate a newly developed I&bull;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Sperm from five commonly-used strains of inbred mice were frozen using this kit and then recovered. Higher protection ratios of sperm motility (&gt; 60&#37;) and rapid progressive motility (&gt; 45&#37;) compared to the control (basic CPA) were seen for sperm frozen with this kit in 5 inbred mouse strains. Two cell stage embryo development after IVF with the recovered sperm was improved consistently in all 5 mouse strains examined. Over a 1.5 year period, 49 GM mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&bull;Cryo kit and later recovered by IVF.

Here we demonstrate the newly developed I&#x2022;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Two-cell stage embryo development with frozen-thawed sperm was improved consistently in 5 mouse strains with the use of this kit. Over a 1.5 year period, 49 genetically modified mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&#x2022;Cryo kit and later successfully recovered by IVF.

الماوس حفظ بالبرودة والانتعاش الحيوانات المنوية باستخدام · لقد كرو كيت

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

الفأر الجنينية التنمية في الجامعة نظام الثقافة الأجنة الخالية من المصل

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down&#8217;s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

Here, we present a protocol for specific siRNA-mediated mRNA depletion followed by immunofluorescence analysis to evaluate meiotic spindle assembly and organization in mouse oocytes. This protocol is suitable for in vitro depletion of transcripts and functional assessment of different spindle and/or MTOC-associated factors in oocytes.

تقييم المغزل الانتصافي في ماوس البويضات التي كتبها بوساطة سيرنا إسكات

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods for safe storage of genetic resources beyond the common practices of keeping breeding colonies. The main purpose of this study was to adapt the needle immersed vitrification (NIV) procedure to cryopreserve whole zebrafish testes. Cryopreservation of early-stage germ cells by whole testes NIV offers possibilities for the storage of zebrafish genetic resources, especially since after transplantation they can mature into both male and female gametes. Testes were excised, pinned on an acupuncture needle, equilibrated in two cryoprotective media (equilibration solution containing 1.5 M methanol and 1.5 M propylene glycol; and vitrification solution containing 3 M dimethyl sulfoxide and 3 M propylene glycol) and plunged into liquid nitrogen. Samples were warmed in a series of three consequent warming solutions. The main advantages of this technique are (1) the lack of spermatozoa after digestion of warmed testes thus facilitating downstream manipulations; (2) ultra-rapid cooling enabling the optimal exposure of tissues to liquid nitrogen therefore maximizing the cooling and reducing the required concentration of cryoprotectants, thereby reducing their toxicity; (3) synchronous exposure of several testes to cryoprotectants and liquid nitrogen; and (4) repeatability demonstrated by obtaining viability of above 50% in five different zebrafish strains.

The main purpose of this study was to adapt the needle immersed vitrification (NIV) procedure to cryopreserve whole zebrafish testes. Additionally, the repeatability of the method in five different zebrafish strains was tested.

للواسمات Spermatogonia الزرد بأكملها الخصيتين إبرة مغمورة تبريد فائقة السرعة

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods ...