تصور الديناميكيات الميكروبية لتدوير الميثان في الأراضي الرطبة الساحلية

يكتشف البروتوكول جينات دورة الميثان الرئيسية في الأراضي الرطبة الساحلية في جنوب تكساس ويصور توزيعها المكاني لتعزيز فهم تنظيم الميثان وآثاره البيئية في هذه النظم البيئية الديناميكية.

الأراضي الرطبة الساحلية هي أكبر مصدر حيوي للميثان ، حيث تقوم الميثانوجينات بتحويل المواد العضوية إلى غاز الميثان ويقوم الميثانو بأكسدة الميثان ، وبالتالي تلعب دورا مهما في تنظيم دورة الميثان. تؤثر الأراضي الرطبة في جنوب تكساس ، والتي تخضع لأحداث الطقس المتكررة ، وتقلب مستويات الملوحة ، والأنشطة البشرية المنشأ بسبب تغير المناخ ، على دورة غاز الميثان. على الرغم من الأهمية البيئية لهذه العمليات ، لا يزال تدوير الميثان في الأراضي الرطبة الساحلية في جنوب تكساس غير مستكشف بشكل كاف. لمعالجة هذه الفجوة ، قمنا بتطوير وتحسين طريقة للكشف عن الجينات المتعلقة بالميثانوجينات والميثانوتروف ، بما في ذلك mcrA كمؤشر حيوي للميثانوجينات و pmoA1 و pmoA2 و mmoX كمؤشرات حيوية للميثانوتروفات. بالإضافة إلى ذلك ، هدفت هذه الدراسة إلى تصور أنماط التوزيع المكاني والزماني لوفرة الميثانوجين والميثانوتروف باستخدام برنامج نظام المعلومات الجغرافية (GIS) ArcGIS Pro. قدم دمج هذه التقنيات الجزيئية مع التصور الجغرافي المكاني المتقدم رؤى مهمة حول التوزيع المكاني والزماني لمجتمعات الميثانوجين والميثانوتروف عبر الأراضي الرطبة في جنوب تكساس. وبالتالي ، فإن المنهجية الموضوعة في هذه الدراسة تقدم إطارا قويا لرسم خرائط الديناميكيات الميكروبية في الأراضي الرطبة ، وتعزيز فهمنا لدورة الميثان في ظل ظروف بيئية مختلفة ، ودعم دراسات التغيير البيئي والبيئي الأوسع.

الأراضي الرطبة الساحلية هي أنظمة بيئية حيوية تساهم في تنظيم المناخ والحفاظ على التنوع البيولوجي وإدارة المياه من خلال عمليات مثل عزل الكربون والتبخر والنتح وانبعاثات الميثان (CH₄)¹. هذه النظم الإيكولوجية ، بما في ذلك المياه العذبة والأراضي الرطبة للمياه المالحة² ، عالية الإنتاجية وتعمل كمناطق حرجة لامتصاص ثاني أكسيد الكربون (CO₂) والتقاط المواد العضوية من البيئات الأرضية والبحرية^3،4. تحفز التفاعلات الديناميكية داخل هذه الأراضي الرطبة إنتاج واستهلاك CH₄ الميكروبي⁵ ، مما يجعلها واحدة من أكبر المصادر الطبيعية ل CH₄⁶. باعتباره ثاني أهم غازات الدفيئة ، فإن CH₄ لديه إمكانية الاحتباس الحراري بحوالي 27-30 مرة أكبر من ثاني أكسيد الكربون₂^4،7،8،9 ، مما يجعل دراسة انبعاثات CH₄ من الأراضي الرطبة الساحلية ضرورية في عصر تغير المناخ. يتأثر انبعاث CH₄ بعوامل بيئية مختلفة ، وخاصة الملوحة ، وتلعب دورا مهما في العمليات الميكروبية¹⁰. تساهم الأراضي الرطبة في المياه العذبة بشكل كبير في غاز الميثان في الغلاف الجوي بسبب انخفاض مستويات الكبريتات ، مما يسهل زيادة إنتاج CH₄ الميكروبي ، بينما تميل الأراضي الرطبة للمياه المالحة عموما إلى إصدار أقل من CH₄ بسبب ارتفاع تركيزات الكبريتات^11،12،13.

يتم التحكم في انبعاثات CH₄ من الأراضي الرطبة الساحلية بشكل عام بواسطة مجموعتين من الكائنات الحية الدقيقة ، تعرف باسم الميثانوجينات والميثانو¹⁴. تنتج الميثانوجينات CH₄ في رواسب نقص الأكسجين عن طريق تكسير ركائز مثل الفورمات أو الأسيتات أو الهيدروجين أو المركبات الميثيلية من خلال عملية تعرف باسم تكوين^{الميثان 15}. الإنزيم المهم في هذا المسار هو اختزال ميثيل إنزيم M (MCR) ، لأنه يحفز الخطوة النهائية والمحددة للمعدل من تكوين الميثان^15،16،17. الجين mcrA ، الذي يشفر الوحدة الفرعية ألفا ل MCR ، هو علامة وظيفية يمكن العثور عليها في جميع العتائق الميثانية¹⁸. علاوة على ذلك ، في الأراضي الرطبة الساحلية ، تتشكل المنطقة الانتقالية للكبريتات والميثان (SMTZ) فوق المنطقة الميثانية ، حيث يتقارب الميثان الذي ينتشر لأعلى وتتحرك الكبريتات لأسفل وتستنفد¹⁹. داخل هذه المنطقة ، تقوم العتائق اللاهوائية بالتغذية الميثانية (ANME) بتأكسد الميثان إلى ثاني أكسيد الكربون باستخدام إنزيم MCR ، بينما تقلل البكتيريا المختزلة للكبريتات (SRB) من الكبريتات إلى كبريتيد. يتفوق SRB على الميثانوجينات للهيدروجين والأسيتات ، مما يحد من إنتاج الميثان حتى يتم استنفاد الكبريتات^16،17.

في المقابل ، تؤكسد البكتيريا الميثانوغذية الهوائية CH₄ في البيئات الهوائية²⁰ ، باستخدام أشكال مختلفة من أحادي الأكسجين الميثان (MMO). وتشمل هذه أحادي الأكسجين الميثان الجسيمي (pMMO) ، وهو إنزيم يحتوي على النحاس مضمن في الغشاء داخل الهيولى ، وميثان أحادي الأكسجين القابل للذوبان (sMMO) ، وهو إنزيم يحتوي على الحديد موجود في السيتوبلازم. ومع ذلك ، بالنسبة ل pMMO ، هناك ثلاثة مشغلات جينية pmoCAB²¹. من بينها ، جين pmoA هو الأكثر تحفظا لجميع الميثانوتروف. هناك نوعان مختلفان من جينات المؤشرات الحيوية ل pmoA: pmoA1 و pmoA2²². علاوة على ذلك ، من أجل فهم شامل للميثانوتروف ، يتم استخدام جين mmoX كأداة في البيولوجيا الجزيئية لتحديد الميثانوتروف المحتوية على sMMO²³. يسلط هذا التمييز في مسارات التمثيل الغذائي والمتطلبات البيئية للميثانوجينات والميثانوتروف الهوائية الضوء على التفاعلات الميكروبية المعقدة التي تنظم دورة الميثان في النظم البيئية للأراضي الرطبة الساحلية.

تشهد الأراضي الرطبة في بوكا تشيكا (BC) ، وهي بيئة مياه مالحة منتجة في جنوب تكساس ، تأثيرات المد والجزر من خليج المكسيك (GOM) ، مما يؤدي إلى مستويات ملوحة سطحية متغيرة ، خاصة بسبب قربها من لاجونا مادري²⁴ شديدة الملوحة. يتسبب هذا الإجراء المد والجزر ، بالتناوب بين المد والجزر المرتفع والمنخفض ، في تذبذب مستويات الأكسجين²⁵ مما قد يغير نشاط الميثانوجين والميثانوتروف في الرواسب²⁶. في المقابل ، تعتبر الأراضي الرطبة للمياه العذبة الساحلية نقطة ساخنة مهمة ل CH₄ تدفقات²⁷. تتمتع الأراضي الرطبة الساحلية للمياه العذبة في جنوب تكساس ، بما في ذلك Resaca Del Rancho Viejo (RV) و Lozano Banco (LB) ، البعيدة عن تأثيرات المد والجزر في GOM ، بإدارة هيدرولوجية متميزة. تشهد عربة سكن متنقلة تدفقات نبضية تكملها مياه النهر أثناء انخفاض مستويات المياه ، بينما يعمل LB كنظام تدفق غير متصل بدون مثل هذه المكملات. علاوة على ذلك ، يحافظ RV و LB على مستويات ملوحة أقل بسبب التصريف العالي للمياه العذبة التي يتم ضخها صناعيا وكونها بحيرة قوس الثور ، على التوالي. يمكن أن تؤثر العوامل البيئية المختلفة بشكل كبير على تدوير الميثان عبر الأراضي الرطبة الساحلية في جنوب تكساس. ومع ذلك ، لا يزال ركوب الميثان في الأراضي الرطبة الساحلية في جنوب تكساس منطقة لم يتم التحقيق فيها بدقة بعد.

يمثل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) و PCR في الوقت الفعلي (ويسمى أيضا تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي [qPCR]) تقنيات أساسية ومستخدمة على نطاق واسع لاكتشاف وقياس الوفرة النسبية لجينات معينة في العينات البيئية. تعمل هذه التقنيات على وجه التحديد على تضخيم المناطق المستهدفة من الحمض النووي للإشارة إلى وجود الجينات المرتبطة بركوب الدراجات CH₄ وكميتها النسبية ، مما يوفر مؤشرات على دورة الميثان المحتملة. ومع ذلك ، فإن توافر وفعالية مجموعات التمهيدي PCR قد يكون محدودا بعوامل مثبطة مختلفة في الحمض النووي البيئي المستخرج ، والتي تتأثر بأنواع البيئات^28،29. وبالتالي ، أنشأت هذه الدراسة بشكل أساسي طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل المثلى للكشف عن وجود الجينات المرتبطة بركوب الدراجات CH₄ في الأراضي الرطبة الساحلية في جنوب تكساس (الشكل 1) ثم تصور وفرة نسبية كمية في هذه النظم البيئية. يمكن تطبيق نتائج هذه الدراسة على المناطق الساحلية الأخرى لتعزيز فهم دورة CH₄ والديناميكيات الميكروبية في النظم البيئية الساحلية المتنوعة.

1. جمع العينات

1. اجمع عينات الرواسب باستخدام جهاز أخذ عينات أو مجرفة للرواسب.
   ملاحظة: تم جمع العينات من محطتين من ثلاث أراضي رطبة ساحلية متميزة خلال المواسم الباردة (أكتوبر - فبراير ، متوسط درجة الحرارة 20 درجة مئوية) والدافئ (أبريل - يونيو ، متوسط درجة الحرارة 27 درجة مئوية) في عامي 2023 و 2024. تم استخدام جهاز أخذ عينات من الرواسب عند جمع العينات من الأراضي الرطبة للمياه العذبة الساحلية (الشكل 2) وتم استخدام مجرفة للأراضي الرطبة الساحلية المتأثرة بالمد والجزر.
2. قم بخفض جهاز أخذ العينات في المسطح المائي الضحل أولا واتركه يغرق في سطح الرواسب (داخل أعلى 50 سم) تحت وزنه ، مما يقلل من اضطراب بنية الرواسب كما هو موضح في الشكل 2.
3. اسحبه من عمود الماء حيث كان العمق عادة من 60 سم إلى 215 سم³⁰ ، وانقل عينات الرواسب إلى أكياس بسحاب ، وقم بتخزينها في صندوق ثلج على الفور.
   ملاحظة: قم بتنظيف وغسل جهاز أخذ العينات بالماء منزوع الأيونات (DI) قبل المتابعة إلى المحطات التالية.
4. قم بتخزين جميع العينات عند -20 درجة مئوية على الفور في المختبر.
5. في كل موقع أخذ عينات ، قم بقياس معلمات جودة المياه السطحية مثل الملوحة ودرجة الحرارة في الموقع باستخدام مقياس جودة المياه متعدد المعلمات.
   ملاحظة: تم شطف المجسات بالماء منزوع الأيونات (DI water) بعد استخدامها في كل محطة.

2. استخراج الحمض النووي الجيني

1. قم بإذابة العينات في درجة حرارة الغرفة قبل البدء في إجراء استخراج الحمض النووي الجيني.
2. انقل ما يقرب من 500 مجم من عينات الرواسب إلى أنبوب سعة 15 مل وجهاز طرد مركزي بسعة 4,250 × جم لمدة 3 دقائق لإزالة كل المياه.
3. استخرج الحمض النووي الجيني باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي للتربة باتباع بروتوكول الشركة^{المصنعة 31} مع القليل من التعديل وتخزينه في -20 درجة مئوية على الفور.
   ملاحظة: تم إجراء التغييرات لتقليل التكرار وسير العمل الفعال.
   1. أضف ما يصل إلى 500 مجم من عينة التربة إلى أنبوب يحتوي على حبة زجاجية / كرة خزفية.
   2. أضف 978 ميكرولتر من محلول فوسفات الصوديوم إلى العينة في الأنبوب المحتوي على حبة / كرة.
   3. أضف 122 ميكرولتر من محلول التحلل العازل إلى العينة في الأنبوب المحتوي على الخرزة / الكرة لإذابة الملوثات الخارجية.
   4. قم بالتجانس باستخدام مجانس مطحنة الخرز بمستوى 5 أضعاف مستوى السرعة لمدة 20 ثانية وكرر 2x.
      ملاحظة: تم استخدام الخالط مطحنة الخرزة في هذه الدراسة ، ولهذا السبب تم تعديل السرعة.
   5. الطرد المركزي الخليط لمدة 10 دقائق عند 14,000 × جم.
   6. انقل المادة الطافية إلى أنبوب نظيف للطرد المركزي الدقيق سعة 2.0 مل.
   7. أضف 250 ميكرولتر من محلول ترسيب البروتين (PPS) لفصل الأحماض النووية الذائبة عن الحطام الخلوي ومصفوفة التحلل. امزج عن طريق قلب الأنبوب 10x.
   8. جهاز طرد مركزي عند 14,000 × جم لمدة 5 دقائق لترسيب الحبيبات وإزالة الحطام الخلوي ومصفوفة التحلل.
   9. انقل المادة الطافية إلى أنبوب نظيف للطرد المركزي الدقيق سعة 15 مل.
   10. أضف 1.0 مل من تعليق مصفوفة الربط إلى المادة الطافية في أنبوب 15 مل.
       ملاحظة: قم بهز تعليق مصفوفة الربط لإعادة التعليق قبل إضافته.
   11. اسمح بربط الحمض النووي بمصفوفة الربط عن طريق وضع الأنابيب على دوار لمدة 2 دقيقة.
   12. ضع جميع الأنابيب على رف واحتضانها لمدة 3 دقائق للسماح بتسوية مصفوفة الربط.
   13. بعد 3 دقائق ، تخلص من 750 ميكرولتر واخلط المادة الطافية المتبقية برفق مع الحبيبات باستخدام ماصة.
   14. انقل 750 ميكرولتر من الخليط إلى مرشح SPIN وجهاز طرد مركزي عند 14,000 × جم لمدة 1 دقيقة. أفرغ أنبوب الالتقاط وأعد استخدامه. كرري العملية مع الخليط المتبقي.
   15. أضف 500 ميكرولتر من محلول الغسيل المحضر (مع إضافة الكمية المناسبة من الإيثانول) لزيادة إذابة الشوائب. أعد تعليق الحبيبات برفق باستخدام قوة السائل من طرف الماصة.
   16. جهاز طرد مركزي عند 14,000 × جم لمدة 1 دقيقة لإزالة الشوائب. أفرغ أنبوب الالتقاط وأعد استخدامه.
   17. جهاز الطرد المركزي مرة أخرى عند 14,000 × جم لمدة دقيقتين دون إضافة أي شيء.
   18. استبدل أنبوب الالتقاط بأنبوب التقاط جديد ونظيف وجفف مرشح SPIN بالهواء لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   19. أضف 50 ميكرولتر من الماء الخالي من الحمض النووي (DES) وجهاز الطرد المركزي عند 14,000 × جم لمدة 1 دقيقة.
       ملاحظة: في هذا البروتوكول ، تم استخدام 50 ميكرولتر من DES لشطف الحمض النووي لضمان الاسترداد والاستقرار الأمثل للحمض النووي البيئي المستخرج (eDNA).

3. قياس الحمض النووي

1. أضف 1 ميكرولتر من الحمض النووي المستخرج مع 200 ميكرولتر من صبغة الفلورسنت في أنبوب 0.5 مل واخلطه جيدا عن طريق سحب العينات.
2. لف الأنبوب على الفور بورق الألمنيوم حتى لا يتغلغل الضوء ويحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
3. قم بقياس تركيز الحمض النووي باستخدام مقياس الفلور في وضع تركيز الحمض النووي ONE باتباع بروتوكول الشركة المصنعة.

4. الكشف عن 16S rRNA و pmoA1 و pmoA2 و mmoX و mcrA بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي

1. قبل تشغيل تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي (cPCR)، قم بإذابة جميع العينات والكواشف في دلو ثلج.
2. تمييع جميع عينات eDNA المستخرجة إلى 10 نانوغرام / ميكرولتر.
   ملاحظة: ترد قائمة بالبادئات في الجدول 1.
3. قم بإعداد خليط تفاعل cPCR سعة 25 ميكرولتر لكل عينة ، بما في ذلك 12.5 ميكرولتر من 2x PCR Master mix ، و 0.5 ميكرولتر من الاشعال الأمامية والعكسية (10 ميكرومتر) (انظر الجدول 1 للحصول على قائمة التمهيدي) ، و 1 ميكرولتر من 10 نانوغرام / ميكرولتر eDNA ، و 10.5 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز.
   ملاحظة: قم بإعداد المزيج الرئيسي بحجم كاف لعينة إضافية واحدة لتقليل أخطاء سحب العينات.
4. قم بإجراء تفاعل cPCR باتباع البروتوكول الذي يتكون من تمسخ أولي عند 95 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، متبوعا ب 40 دورة من التمسخ عند 95 درجة مئوية لمدة 45 ثانية ، والتمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، والتمديد النهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 5 أمتار ، مع درجات حرارة تلدين متفاوتة لبادئات مختلفة (انظر الجدول 1 للحصول على درجات حرارة التلدين لبادئات مختلفة تستخدم لجينات مختلفة).
   ملاحظة: بالنسبة لجين mcrA ، أظهرت بادئات ML النطاق المطلوب باستخدام معدل منحدر بطيء يبلغ 0.1 درجة مئوية / ثانية بين خطوات التلدين والتمديد للدورات الخمس الأولى³².
5. تصور منتجات cPCR في هلام الاغاروز الملطخ ببروميد الإيثيديوم (EtBr).
   ملاحظة: استخدم جل الاغاروز 2.5٪ لسلم 50 نقطة أساس و 0.9٪ جل لسلم 1 كيلو بايت. استخدم 1x TAE buffer لجل الاغاروز 2.5٪ و 0.5x TAE المؤقت لجل الاغاروز 0.9٪.

5. الكشف عن pmoA1 و pmoA2 و mmoX و mcrA عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي

ملاحظة: لوحظت وفرة الجينات المستهدفة بالميثانوجين والميثانوفوروف مثل pmoA1 و pmoA2 و mmoX و mcrA بواسطة qPCR باستخدام نظام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي.

1. قم بإعداد المعايير لكل جين على حدة للحصول على المنحنى القياسي لكل جين.
   1. تضخيم الجين المستهدف باستخدام cPCR ، باستخدام العينات التي أنتجت ألمع نطاق أثناء الرحلان الكهربائي الهلامي لكل جين. اتبع الطريقة والبادئات الموضحة في القسم 4.
   2. قم بتنقية المنتجات المضخمة باستخدام مجموعة استخراج الهلام وقياس تركيز الحمض النووي باتباع الطريقة الموضحة في القسم 3 وتخزينها في -20 درجة مئوية.
      ملاحظة: Aliquot المعايير المنقاة في أنابيب منفصلة لمزيد من الاستخدام.
   3. احسب النسخ الجينية من تركيز الحمض النووي المقاس باستخدام موقع حساب رقم النسخ ل qPCR.
   4. قم بتخفيف رقم النسخة المحسوب للمعيار بالماء الخالي من النوكلياز لتحضير كل معيار ، يتراوح من 10⁸ إلى 10² نسخة / ميكرولتر ، قبل تشغيل qPCR.
   5. قم بإعداد المنحنى القياسي باستخدام ثلاث نسخ مكررة لكل رقم نسخة، بما في ذلك عنصر تحكم سلبي (NTC، بدون قالب DNA).
      ملاحظة: كانت قيمة R² لكل منحنى قياسي أكبر من 0.99.
2. قم بإعداد خليط تفاعل qPCR سعة 20 ميكرولتر لجميع العينات والمعايير و NTC. قم بإجراء تحليل qPCR بثلاث نسخ لجميع العينات.
   1. ضع جميع مكونات التفاعل ، بما في ذلك مزيج qPCR الرئيسي ، والبادئات ، والمياه الخالية من النوكلياز ، والمعايير ، والعينات ، على رف ثلج قبل البدء.
   2. قم بإعداد خليط تفاعل qPCR سعة 20 ميكرولتر لكل عينة ، وقياسي ، و NTC ، يحتوي على 10 ميكرولتر من مزيج SYBR Green الرئيسي ، و 0.5 ميكرولتر من كل 10 ميكرومتر بادئات أمامية وعكسية ، و 8 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز ، و 1 ميكرولتر من الحمض النووي القالب 10 نانوغرام / ميكرولتر ، أو الماء القياسي ، أو DI على التوالي.
      ملاحظة: استخدم مجموعات التمهيدي الموضحة لتحقيق أفضل النتائج لجينات pmoA1 و mcrA في تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي ل qPCR (انظر الجدول 1). لتحسين الدقة، قم بتشغيل كل عينة ثلاث نسخ. توفر الخطوات التالية طريقة فعالة لإعداد عينات ثلاثية النسخ بحجم إجمالي يبلغ 60 ميكرولتر لكل عينة.
      1. قم بإعداد خليط التفاعل للجمع بين المزيج الرئيسي ، والبادئات الأمامية والعكسية للجين المحدد ، والماء الخالي من النوكلياز في أنبوب سعة 2 مل ، باستثناء الحمض النووي للقالب.
         ملاحظة: قم بإعداد حجم خليط التفاعل مع مراعاة خطأ سحب العينات. على سبيل المثال، إذا كان هناك 24 عينة و8 معايير، فاحسب الحجم الإجمالي ل 33 تفاعلا بدلا من 32 تفاعلا لتقليل أخطاء سحب العينات. في هذه الحالة ، سيكون الحجم الإجمالي المطلوب للتفاعلات الثلاثية على النحو التالي: 990 ميكرولتر من المزيج الرئيسي (33 عينة × 3 مكررات × 10 ميكرولتر) ، 49.5 ميكرولتر من البادئات الأمامية (33 عينة × 3 مكررات × 0.5 ميكرولتر) ، 49.5 ميكرولتر من البادئات العكسية (33 عينة × 3 مكررات × 0.5 ميكرولتر) ، و 792 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز (33 عينة × 3 مكررات × 8 ميكرولتر).
      2. تحضير أنابيب PCR حسب عدد العينات والمعايير.
      3. قم بتوزيع 57 ميكرولتر من خليط التفاعل المحضر في كل أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).
         ملاحظة: لإجراء qPCR لكل عينة في ثلاث نسخ ، قم بإعداد حجم خليط تفاعل إجمالي يبلغ 57 ميكرولتر لكل عينة (باستثناء قالب الحمض النووي أو المعيار أو الماء). سيتم تقسيم هذا الحجم بالتساوي إلى ثلاثة آبار لعينة واحدة ، مع تخصيص 19 ميكرولتر لكل بئر.
      4. أضف 3 ميكرولتر من قالب الحمض النووي أو الماء القياسي أو الخالي من النوكلياز إلى كل أنبوب واخلطه عن طريق النقر برفق على قاع الأنبوب.
         ملاحظة: سيكون الحجم الإجمالي لخليط التفاعل المحضر لعينة واحدة 60 ميكرولتر الآن في كل أنبوب.
   3. Aliquot 20 ميكرولتر من خليط التفاعل المحضر من كل أنبوب في الآبار المخصصة للوحة qPCR 96 بئرا. أغلق لوحة PCR بغشاء مانع للتسرب PCR لاصق باستخدام قضيب.
   4. قم بالطرد المركزي للوحة محكمة الغلق عند 1,000 × جم لمدة 1 دقيقة لضمان الخلط المناسب للتخلص من أي فقاعات داخل الآبار.
3. ضع لوحة PCR في جهاز التدوير الحراري. قم بتشغيل جهاز qPCR ثم افتح البرنامج ذي الصلة لإعداد البروتوكول.
   1. قم بإعداد البروتوكول وفقا لإرشادات المزيج الرئيسي qPCR. استخدم البروتوكول التالي: 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، متبوعة ب 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، وخطوة تمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. قم بتنفيذ خطوة التلدين عند درجة حرارة التلدين المحددة للبادئات ذات الصلة في الجدول 1 لمدة 45 ثانية. قم بإجراء جميع عمليات تشغيل qPCR لمدة 35 دورة.
   2. قم بإعداد لوحة qPCR ذات 96 بئرا مع المعايير و NTCs في نفس تكوين اللوحة المحتوية على العينة.
4. استخدم طريقة المنحنى القياسي للقياس الكمي المطلق لتحديد كمية المنتج المضخم ورقم نسخة الجينات في كل^{عينة 33}.

6. تصور جينات دورة الميثان في خريطة الأراضي الرطبة الساحلية في جنوب تكساس

1. افتح برنامج نظام المعلومات الجغرافية (GIS) ArcGIS Pro واحفظ ملف المشروع باسم منطقة الدراسة في المجلد المحدد على الكمبيوتر.
2. انقر فوق الخريطة في أعلى اليسار | خريطة الأساس وحدد التضاريس مع التسميات كخريطة الأساس.
3. انقر فوق تحديد موقع | ابحث وعندما يفتح شريط البحث ، حدد موقع منطقة الدراسة عن طريق كتابة اسم المنطقة ؛ ستظهر المنطقة.
4. ارسم المنطقة المحددة باستخدام الإسناد الجغرافي.
   1. انقر فوق عرض | جزء الكتالوج من الطبقة العليا.
   2. انقر نقرا مزدوجا فوق مجلد من الكتالوج | اسم الملف.
   3. انقر بزر الماوس الأيمن على ملف قاعدة البيانات الجغرافية (.gdb) ثم انقر فوق جديد | ستظهر فئة الميزة وإنشاء فئة الميزة .
   4. اكتب مربع الاسم والاسم المستعار وانقر فوق إنهاء في الأسفل.
   5. انقر فوق عرض | المحتويات. سيظهر اسم الاسم المستعار في جزء المحتويات.
   6. انقر فوق تحرير من الطبقة العليا | إنشاء. سيتم فتح جزء إنشاء الميزات . انقر نقرا مزدوجا فوق الاسم المستعار في جزء إنشاء الميزات ، وستظهر خيارات تكوين ملاحظات الأداة .
   7. حدد خطوط، ثم ارسم خطوطا على الخريطة لإنشاء حدود خارجية لمنطقة الدراسة. انقر نقرا مزدوجا على الخريطة عند الانتهاء.
5. تصغير برنامج GIS، ثم افتح جدول بيانات. اكتب اسم العينة في العمود الأول، وأدخل خط العرض في العمود الثاني، وخط الطول في العمود الثالث. استخدم الأعمدة الأربعة التالية لبيانات qPCR ل pmoA1 و pmoA2 و mmoX و mcrA.
6. احفظ الملف بتنسيق CSV في أي مجلد محدد للكمبيوتر.
7. افتح برنامج نظم المعلومات الجغرافية مرة أخرى وانقر فوق إضافة بيانات | بيانات نقطة XY.
8. حدد ملف CSV من المجلد الموجود على الكمبيوتر في المربع جدول الإدخال . أعد تسمية اسم الملف في فئة معالم الإخراج، ثم انقر فوق تشغيل لعرض نقاط أخذ العينات على الخريطة.
9. انقر فوق شريط البحث في الجزء العلوي وابحث في Kriging.
10. حدد ملف محطة أخذ العينات ثم حدد pmoA1.
11. انقر فوق البيئة | حدد محطة أخذ العينات في الطبقة والقناع | انقر فوق تشغيل.
12. اتبع البروتوكولات المذكورة في الخطوات 6.9 و 6.10 و 6.11 لإنشاء Kriging ل pmoA2 و mmoX و mcrA لجميع مناطق الدراسة.
13. إنشاء تخطيط للخريطة.
    1. انقر فوق إدراج من الطبقة العليا | تخطيط جديد، وحدد ANSI - أفقي.
    2. انقر فوق Map Frame ، وحدد الخريطة باستخدام Kriging ، وضع جميع الخرائط في التخطيط عن طريق رسم مستطيل. سيؤدي ذلك إلى جعل الخريطة مرئية في التخطيط.
    3. حدد السهم الشمالي وضعه في التخطيط للإشارة إلى الاتجاه الشمالي.
    4. حدد شريط المقياس لعرض مقياس المنطقة على الخريطة.
    5. انقر فوق وسيلة الإيضاح لعرض وسائل الإيضاح ، ثم ضعها في التخطيط.
    6. انقر فوق الشبكة وحدد أيا من خيارات graticule الأسود. سيؤدي هذا إلى إنشاء الشبكة بخطوط الطول والعرض وعرضها في جزء المحتويات مع التسمية Black Horizontal Label Graticule.
    7. انقر نقرا مزدوجا فوق Black Horizontal Label Graticule ، ثم حدد المكونات. انقر فوق Ticks 1 و Grid ، وقم بإزالة هذه المكونات بالنقر فوق علامة التقاطع على يمينها.
14. انقر فوق مشاركة من الطبقة العلوية ، ثم انقر فوق تصدير التخطيط. حدد نوع الملف كPDF، واحفظ الملف على الكمبيوتر باستخدام مربع الاسم، واضبط الدقة الرأسية على 500 نقطة في البوصة، وانقر فوق تصدير لإنشاء ملف PDF للخريطة.

لفهم توزيع ووفرة الجينات المرتبطة بركوب الدراجات CH₄ (mcrA و pmoA1 و pmoA2 و mmoX) في الأراضي الرطبة الساحلية في جنوب تكساس ، تم تحليل الحمض النووي الإلكتروني المستخرج من كل عينة بواسطة cPCR و qPCR. تم اختيار بادئات عالمية لكل مؤشر حيوي لتشغيل cPCR من الدراسات الس...

يتم التعرف على الأراضي الرطبة الساحلية كمساهمين رئيسيين في غاز الميثان في الغلاف الجوي ، وهو أحد غاز الدفيئة المهم⁴⁰. على الرغم من وجود دراسات حول تدفق الميثان والميثانوجينات في الأراضي الرطبة^41،42،43 ، إلا أ?...

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

ونحن ممتنون لأعضاء C-REAL على مساعدتهم في المراقبة الميدانية والتحليلات المختبرية.