Araştırmamız veya ana araştırmamız, mikrobiyal çeşitlilik, filogenomik ve fermantasyon uygulamalarına odaklanmakta ve maya çeşitliliği, adaptasyonları ve özellikle maya biyolojisinin endüstriyel uygulamalarına vurgu yapmaktadır. Özellikle bu uygulamalara giderek, mayada fermantasyon verimliliği, aroma üretimi ve stres toleransı üzerinde çalışıyoruz. Bu nedenle, en son gelişmelerimiz, özellikle Patagonya'dan gelen maya filogenomiği ile ilgilidir.
Sonra bunu bira fermantasyonu için yeni bira mayası üretmek için kullanıyoruz, ancak aynı zamanda düşük alkollü bira için yeni maya da kullanıyoruz. Biyojenolojik uygulamalar için bu yeni mayayı geliştirmek için hep birlikte farklı omik teknikler ve deneysel evrim kullanıyoruz. Şu anda genom dizilimi, uzun okunan genom dizilimi ve ayrıca transkriptomik gibi farklı teknikler kullanıyoruz.
Sonra hep birlikte, bu bilgiyi sahip olduğumuz farklı suşların deneysel evrimini yapmak için kullanıyoruz ve daha sonra CRISPR teknikleri veya farklı maya dönüşüm teknikleri kullanarak bazı genomik değişiklikleri doğrulamaya çalışıyoruz ve bu şekilde mayanın fermantasyon ortamlarına adaptasyonunun moleküler detaylarına ulaşıyoruz. Bu yüzden iki büyük zorluğumuz var. Biri, verimli bira fermantasyonu ile yeni bira mayası üretmek, diğeri ise tam tersi.
Özellikle Patagonya'dan düşük alkollü bira üretebilen yeni türler elde etmek istiyoruz. Laboratuvarımızdan elde edilen iki ana sonucu vurgulamak isterim. Bunlardan biri, bira mayasının annesi Saccharomyces eubayanus'un Patagonya dışı bir kökenini tespit etmemizdir.
Ve şimdi bira fermantasyonu için düzinelerce yeni lager melezi de ürettik. Sanırım bunlar araştırmamızın iki ana bulgusu. Başlamak için, dönüştürülmüş bir maya suşu yamasından bir numune alın ve bunu% 5 glikoz ve 200 mikromolar higromisin içeren bir maya pepton ortamına aşılayın.
Kültürü 24 saat boyunca çalkalamadan 25 santigrat derecede inkübe edin. Kültürleri 24 saat daha inkübe etmeden önce 1 ila 10 seyreltmede taze ortamda yenileyin. Hücreleri şekersiz maya pepton ortamı ile yıkayın, daha sonra 1 ila 10 seyreltme ile test ortamına aşılayın.
Plazmit stabilitesini korumak için test ortamını lusiferin ile 3 milimolar nihai konsantrasyona ve 200 mikromolar higromisin ile destekleyin. Karışık şeker büyüme testi için, maya pepton ortamında artan glikoz ve maltoz konsantrasyonlarına sahip bir glikoz-maltoz matrisi kullanın. 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 200 mikrolitre kültür dağıtın.
Şimdi 72 saat boyunca her 30 dakikada bir 620 nanometrede lüminesans ve optik yoğunluğu ölçmek için bir luminometre plaka okuyucusu kullanın. Entegrasyon süresini bir saniyeye ayarlayın ve sürekli raporlayıcı etkinliği ve hücre yoğunluğu izleme sağlamak için zayıflamayı devre dışı bırakın. Fermantasyon örneklemesi ve lüminesans izleme için, malt özü ortamını hazırlamak için önce malt özütünü suda çözün.
Kültür öncesi, maya suşlarını 20 santigrat derecede 5 mililitre YPD ortamında 24 saat boyunca 200 RPM'de çalkalama ile dönüştürdü. Ön kültürü 50 mililitre malt özü ortamına aktarın, daha sonra 24 saat daha dakikada 200 dönüşte çalkalama ile 20 santigrat derecede inkübe edin. Hücreleri hasat etmek için kültürü oda sıcaklığında bir dakika boyunca 21, 380 G'de santrifüjleyin.
Daha sonra hücreleri, 50 mililitrelik mikrofermantasyonlar için üç kopya halinde 12 derecelik malt özü ortamında yeniden süspanse edin. Fermantasyon performansını artırmak için ortamı litre başına 0.3 miligram çinko klorür ile destekleyin. Replikasyonlar arasında tutarlı hücre yoğunlukları sağlamak için aşı hacmini hesaplayın.
Hazırlanan ortamı hesaplanan inokülum miktarı ile aşılayın. Daha sonra kültürleri 14 gün boyunca çalkalamadan 20 santigrat dereceye getirin. Günlük olarak kaybedilen karbondioksiti kaydederek fermantasyon ilerlemesini izleyin.
Karbondioksit üretiminin bir göstergesi olarak kümülatif kilo kaybını ölçmek için her gün kapları tartın. Lüminesans izleme için, her mikrofermantasyondan periyodik olarak 200 mikrolitre numune alın. 3 milimolar nihai konsantrasyon elde etmek için lusiferin ekleyin.
Zayıflama ve bir saniyelik entegrasyon süresi olmadan bir luminometre plaka okuyucu kullanarak 620 nanometrede lüminesansı ve optik yoğunluğu ölçün. Epizomal raportör plazmid pRS426-PMAL32-LUC-HphMX, PMAL32 promotörü lusiferaz ORF ve hphMX kaseti ile başarıyla oluşturuldu. Değişen glikoz ve maltoz konsantrasyonları altında dönüştürülmüş üç suş arasında diferansiyel lusiferaz aktivitesi gözlendi.
CBS12357T ve CL467.1 glikoz olmadan aktivasyon gösterirken, QC18 aktivasyon için% 1'in üzerinde glikoz konsantrasyonu gerektirdi. Mikrofermantasyon koşulları altında, dönüştürülmüş üç suşun tümü, farklı zamanlarda zirveye ulaşan güçlü lüminesans gösterdi. Yabani tip suşlarda lüminesans yoktu.
