Laboratuvarımdaki araştırmalar, meme kanseri olan hastalarda kas yorgunluğunu teşvik eden altta yatan mekanizmaları anlamaya odaklanmıştır. Spesifik olarak, meme dokusunda lokalize bir tümör ile periferik iskelet kası arasındaki iletişimi ve daha sonra bu kas içindeki yorgunluğa yol açan moleküler tepkileri anlamak istiyoruz. 3D hücre kültürü modellerinin geliştirilmesi, kas yorgunluğu gibi fonksiyonel tepkilerin kontrollü koşullar altında incelenebildiği yüksek verimli çalışmalara olanak sağlamaktadır.
Fonksiyonel hücre kültürü deneyleri paralel olarak yürütülebilir ve eşdeğer hayvan modellerinden daha az zaman gerektirir, bu da hızlı keşif ve yeniliği kolaylaştırır. Geleneksel hasta kaynaklı ksenogreft modelleri kullanılarak ilgili fonksiyonel fenotiplerin değerlendirilmesi hem zaman alıcı hem de kaynak yoğundur. Bu protokol, PDX'lerin farelere eşzamanlı olarak enjekte edilmesini kolaylaştırır ve araştırmacıların iyi güçlendirilmiş hayvan deneyleri kullanarak insan tümörlerine sistemik tepkileri incelemelerine olanak tanır.
Bu protokol, hasta kaynaklı meme tümörü hücrelerinin mevcut yöntemlere göre gelişmiş bir ölçekte ortotopik enjeksiyonuna izin vererek, tek bir araştırmacı tarafından günde birkaç düzine farenin hızlı enjeksiyonunu kolaylaştırır. Ek olarak, tümörün ayrışması, hücre tiplerini hayvanlar arasında eşit olarak dağıtan homojen bir hücre süspansiyonu oluşturur. Laboratuvarımdan elde edilen veriler, PDX faresinde ve insan kanseri hastalarında meme kanserine benzer kas moleküler tepkileri tanımladı.
Bu nedenle, aday ilaçları taramak ve meme kanserli hastalarda yorgunluğu azaltma potansiyeline sahip tedavileri belirlemek için bu klinik öncesi fare modelini kullanmak istiyoruz. Başlamak için, insan tümör ayrışma kitinden H, R ve A enzimlerini çözün. Steril bir tüp C'ye 200 mikrolitre enzim H, 100 mikrolitre enzim R ve 25 mikrolitre enzim A ekleyin. Son hacmi yaklaşık beş mililitreye ayarlamak için C tüpüne 4.7 mililitre steril RPMI 1640 ortamı ekleyin.
Daha sonra çözülmüş tümör parçalarını ve beraberindeki dondurma ortamını steril 100 milimetrelik bir kültür kabının yarısına aktarın. Steril forseps kullanarak, tümör parçalarını steril beş mililitrelik bir mikro tüpe aktarın ve bir ila üç mililitre steril PBS ile yıkayın. Steril forseps kullanarak, dezenfekte edilmiş parçaları beş mililitrelik yeni bir mikro tüpe aktarın.
Steril PBS ile ikinci bir yıkamadan sonra, parçaları 100 milimetrelik kültür kabının kuru yarısına aktarın. İki steril 10 numara neşter bıçağı kullanarak, tümör dokusunu iyice kıyın. Kıyılmış tümör parçalarını bir bıçağa aktarın ve hazırlanan enzim çözeltisini içeren C tüpüne yerleştirin.
Enzim çözeltisi içinde tümör parçalarının eşit dağılımını sağlamak için C tüpünü birkaç kez ters çevirin. Şimdi C tüpünü mekanik ayrıştırıcıya yerleştirin ve tüm içeriğin ortama daldırıldığından emin olmak için tüpü ters çevirin. Dokunmatik ekran arayüzünden 37CHTDK3 programını seçin.
Ayrışma programının tamamlanmasının ardından, tüp içeriğini inceleyin. Yeterli ayrışma sağlandıktan sonra, C tüpünü 200G'de dört santigrat derecede beş ila sekiz dakika santrifüjleyin. Vakum aspirasyonu veya bir pipet kullanarak, süpernatanı dikkatlice çıkarın ve hücre peletini RPMI 1640'ta istenen son enjeksiyon hacminin yarısına eşdeğer bir hacme yeniden süspanse edin.
İki mililitrelik yuvarlak tabanlı bir mikro santrifüj tüpünde, RPMI'de istenen miktarda seyreltilmiş hücre süspansiyonunu eşit hacimde Matrigel ile birleştirin. Homojenliği sağlamak için süspansiyonu tekrar tekrar pipetleyerek nazikçe karıştırın. Başlamak için, insan meme tümörlerini tek hücreli bir süspansiyona ayırın.
Daha sonra, takılı bir iğne olmadan bir mililitrelik bir şırınga kullanarak, homojenliği sağlamak için hücre süspansiyonunu nazikçe yukarı ve aşağı aspire edin. Şırıngaya 26 gauge bir iğne takın ve istenen enjeksiyon hacmini geri çekin. Ardından, hava kabarcıklarını gidermek için şırıngaya hafifçe vurun veya hafifçe vurun.
Farenin hedef enjeksiyon bölgesine ince bir tabaka tüy dökücü krem sürün. Enjeksiyon bölgesini temizledikten sonra, fareyi güvenli bir şekilde dizginlemek ve fareyi sırtüstü pozisyona getirmek için sırt derisini ense ve sırttan sıkıca kavrayın. İğneyi, iğne uzunluğunu ayarlayarak yağ yastığına yaklaşık 0,5 ila bir santimetre kaudal kalçaya doğru 45 derecelik bir açıyla yerleştirin.
İğneyi yağ yastığının içine ilerletin ve kontrollü bir şekilde istenen hacimde hücre süspansiyonu enjekte edin. Enjeksiyondan sonra, iğneyi 180 derece döndürün ve enjeksiyon bölgesinden hücre kaybını en aza indirmek için yavaşça geri çekmeden önce pozisyonu kısa bir süre koruyun.
