ATAC-seq, gen ekspresyon düzenleyici mekanizmalarını anlamak için güçlü bir tekniktir. Bununla birlikte, yağ dokusu, büyük lipit içeriği, yüksek mitokondriyal kontaminasyon ve hücresel heterojenite nedeniyle bu tekniği kullanmak zordur. Bu protokolde, adiposit-spesifik ATAC-dizileme, minimal mitokondriyal DNA kontaminasyonu ile yüksek kaliteli veriler üreten floresan ile aktive edilmiş çekirdek sıralama kullanılarak gerçekleştirildi.
Bu yöntem, hücre tipine özgü Cre fare çizgilerinin nükleer etiketleme transgenik muhabir çizgileri ile mevcut olduğu diğer dokularda da kullanılabilir. Çekirdek izolasyonuna, numune başına bir cam Dounce ile cam Dounce homojenizatörlerini buz üzerinde soğutarak başlayın. Ardından, her cam sıçramasına 7 mililitre NPB karışımı ekleyin.
Ardından, cam sıçramasına 50 ila 100 miligram dondurulmuş yağ dokusu yerleştirin ve uzun bir makas çifti kullanarak birkaç küçük parçaya bölün. Tüm örnekler için gevşek bir havaneli ile 10 kez, daha sonra sıkı bir havaneli ile 10 kez inin. Filtrelenmiş homojenatları santrifüjleme için 15 mililitrelik bir tüpe aktarmadan önce içeriği 100 mikrometrelik bir süzgeçten yeni bir 50 mililitrelik tüpe filtreleyin.
Süpernatanı çıkardıktan sonra, pelet 500 mikrolitre PBS-N'de hafifçe ama tam bir parmak dokunuşuyla tekrar askıya alın. Daha sonra, süspansiyonu 40 mikrometrelik bir süzgeçten 50 mililitrelik bir tüpe filtreleyin ve süzgeci 250 mikrolitre PBS-N ile durulayın. Filtrelenmiş nükleer süspansiyonu, bir mikropipet kullanarak floresanla aktive edilmiş bir hücre ayıklamasına veya FACS tüpüne aktarın.
Yeni 1,5 mililitrelik tüpe 500 mikrolitre PBS-N ekleyerek toplama tüpünü hazırlayın ve tüm iç yüzeyleri tamponla ıslatmak için birkaç kez ters çevirin. Sıralamaya kadar buza yerleştirmeden önce tüm sıvıyı aşağı çekmek için tüpleri kısaca döndürün. FACS için, tekliler için FSC-A/FSC-H geçidini ve küçük veya büyük enkaz kaldırma için FSC-A/SSC-A'yı kullanın.
mCherry / GFP-pozitif adiposit çekirdeği popülasyonu için kapı ve daha önce hazırlanan her toplama tüpünde 10.000 çekirdek toplayın. Ayırma sonrası çekirdek hazırlığı için, her toplama tüpüne 500 mikrolitre PBS-N ekleyin ve toplama tüplerini 200 G'de 4 santigrat derecede 10 dakika boyunca santrifüj etmeden önce tüpü birkaç kez ters çevirerek karıştırın. Supernatan'ı tamamen çıkarın.
25 mikrolitre Tn5 ana karışımı hazırlamak için, 12.5 mikrolitre 2x etiketleme DNA tamponu veya TD tamponu, 1.25 mikrolitre Tn5 transpozaz veya TDE I enzimi ve 11.25 mikrolitre nükleaz içermeyen suyu karıştırın. Daha sonra, her çekirdek peletine 25 mikrolitre Tn5 ana karışımı ekleyin ve nazik pipetleme ile yeniden askıya alın. Bir termal karıştırıcı kullanarak 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca 600 RPM'de inkübe edin.
Tn5 çekirdek resuspension karışımının 25 mikrolitresine 25 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyerek son hacmi 50 mikrolitre haline getirin. Ardından, pH 5.2 ile 250 mikrolitre tampon PB ve 5 mikrolitre 3 M sodyum asetat ekleyin. Karışımı referans verilen kit ile birlikte verilen bir sütuna aktardıktan sonra, oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 17.900 G'de santrifüjleyin.
Akışı attıktan sonra, aynı toplama tüpüne bir spin sütunu yerleştirin. Tüpe mutlak etanol içeren 750 mikrolitre tampon PE ekleyin. Kolonu santrifüjleyin, akışı atın ve spin sütununu tekrar aynı toplama tüpüne yerleştirin.
Tüpü santrifüj edin ve toplama borusunu akışla birlikte atın. Transpoze DNA parçalarını büyütmek için, benzersiz bir Ad2 eklemeden PCR ana karışımını hazırlayın. n barkodlama astarı.
PCR'yi çalıştırın. Kantitatif PCR veya qPCR'yi çalıştırın. Amplifikasyon eğrilerini kontrol edin ve maksimumun yaklaşık% 35'ine ulaşan döngü sayısını tahmin ederek ihtiyaç duyulan ek PCR döngülerinin sayısını belirleyin.
PCR reaksiyonunun kalan 45 mikrolitresi için PCR'yi çalıştırmak üzere hesaplamaları kullanın. Daha önceki prosedürleri kullanarak, güçlendirilmiş DNA parçalarını 20 mikrolitre tampon EB ile temizleyin. Salınan DNA'yı yeni bir PCR tüpüne aktarın ve 80 mikrolitre tampon EB ekleyerek hacmi 100 mikrolitreye ayarlayın. Ardından, 55 mikrolitre SPRI boncuk ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakikalık inkübasyondan sonra, 5 dakika boyunca mini bir manyetik stand üzerinde ayırın.
İşiniz bittiğinde, 150 mikrolitre süpernatantı yeni bir PCR tüpüne aktarın, 95 mikrolitre SPRI boncuğu ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Mini manyetik stand üzerindeki boncukları ayırmadan önce reaksiyonu 5 dakika boyunca inkübe edin. Süpernatantı dikkatlice atın ve boncukları 200 mikrolitre% 70 etanol kullanarak 1 dakika yıkayın.
İki yıkamayı daha tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, tüpleri 1 dakika boyunca 1000 G'de santrifüj edin. Kalan etanolün pipetini dışarı atın ve peleti kapağı açık bir PCR makinesinde 2 dakika boyunca 37 santigrat derecede kurutun.
Kuruduktan sonra, pipetleme yaparak peleti 20 mikrolitre tampon EB'de tekrar askıya alın ve tüpü oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin. Son kütüphaneyi içeren süpernatantın 18 mikrolitresini yeni bir 1,5 mililitrelik tüpe aktarmadan önce boncukları mini manyetik standda 5 dakika ayırın. mCherry etiketli ve GFP işaretli adiposit çekirdekleri, bir Adipoq-NuTRAP faresinin yağ dokularından izole edilen diğer hücre tipi çekirdeklerinden ayırt edilebilirdi.
Yağ deposunun tipine bağlı olarak, adiposit fraksiyonlarında eWAT'ta yaklaşık% 50, iWAT'ta% 30 ve BAT'ta% 65 fark gözlenmiştir. 15'ten fazla PCR döngüsü gerektiren numuneler düşük kaliteli numunelere işaret ediyordu. ATAC-seq kütüphanelerinin boyut dağılımı analizi, nükleozomsuz bölgeye veya NFR'ye ve ortalama boyutları yaklaşık 500 ila 800 baz çifti olan mono, di ve çoklu nükleozomlara karşılık gelen çoklu zirveleri göstermiştir.
Düşük kaliteli örnekler tipik olarak çoğunlukla nükleozomal zirveleri olmayan veya az sayıda NFR gösterdi. qRT-PCR analizi ile yapılan kalite kontrol testleri, Adipoq, Fabp4, Plin1 ve Pnpla2 gibi adiposit marker genlerine yakın pozitif genomik elementlerle 10 ila 20 kat zenginleştirme gösterirken, negatif kontrol ile zenginleştirme gösterilmemiştir. Termojenik gen Ucp1 ile zenginleştirme özellikle BAT'de gözlendi.
Mitokondriyal okumalar% 2'den azdı ve piklerin altındaki fraksiyon yaklaşık% 18 ila% 44 idi Tüm yağ depolarından Adipoq, Fabp4 ve Plin1 gibi adiposit belirteç genlerinin yakınında yüksek sinyal-gürültü oranlarına sahip çoklu güçlü pikler ortaya çıkarıldı. BAT örneğindeki kahverengi adiposit markörü Ucp1 lokusunda güçlü ATAC-seq pikleri gözlendi. Bu protokol için en kritik faktör çekirdek kalitesidir.
Yüksek kaliteli doku örnekleri kullanmak ve deney boyunca, özellikle santrifüjleme ve sıralamadan sonra yeniden süspansiyon sırasında çekirdekleri nazikçe işlemek önemlidir. Bu protokolün nükleer etiketlemeli transgenik muhabir farelere dayandığını hatırlamak önemlidir. NuTRAP fareleri burada kullanıldı, ancak benzer herhangi bir sistem kullanılabilir.
FACS verilerimizle, biyolojik ortamlarda gen ekspresyonunu düzenleyen anahtar transkriptomik faktörleri bulmak için hesaplamalı çoklu analiz yapılabilir.
