Bu yöntem, geleneksel MEA'lara hücre içi benzer aksiyon potansiyellerinin kaydedilmesini sağlar, böylece AP şeklinin daha iyi tanımlanmasına ve pro-aritmik potansiyellerin daha hassas bir sınıflandırmasına izin verir. Tipik alan potansiyeli kayıtlarıyla karşılaştırıldığında, hücre içi benzer gerçek potansiyel şekil, altta yatan iyon kanallarının kesin olarak yetkilendirilmesi hakkında daha fazla bilgi sağlar. Kök hücre teknolojisi ile klinik hastalardan elde edilen kardiyomiyositlere uygulandığında, yöntem nedensel tanıya ve C RRP'nin kişiselleştirilmesine katkıda bulunabilir ve aritmiler gibi kalp hastalıklarını teknisyenimiz Karin Gebhardt kardiyomiyosit yetiştiriciliğini gösterecektir.
Daha önce otoklavlanmış MEA'ların elektrot alanlarını kaplamaya başlamak için, laminer akış başlığının altında 10 mikrolitrelik bir pipet kullanarak fibronektin ile Dropwise. Ozmotik şoku azaltmak için, kaplama çözeltisini 90 saniye boyunca damla damla dökülerek thawd kardiyomiyositler içeren 50 mililitrelik tüpe aktarın. Tüpe yavaşça sekiz mililitre kaplama ortamı ekleyin ve hücre süspansiyonunu dikkatlice karıştırın.
10 mililitrelik bir pipet kullanarak, peleti atmadığınızdan ve hücre numarasını son konsantrasyona ayarladığınızdan emin olarak süpernatanı çıkarın. Hücre oturmadan önce, uygulanan kaplama çözeltisini 10 mikrolitrelik bir pipet kullanarak MEA elektrot alanından çıkarın. Kaplama tohumunun kurumasını önlemek için, her ikisi için elektrot alanlarına damla damla dört mikrolitre hücre ekleyerek hücreleri derhal ekler, altı kuyu MEA ve bir kuyu M E A.Now, hücrelerin 37 santigrat derecede bir saat boyunca kuyucuklara yapışmasına izin verir ve% 5 karbondioksit.
Laminer akış başlığının altında, sırasıyla altı Kuyu MEA ve tek kuyu MEA için 37 santigrat dereceye ısıtılmış 200 mikrolitre ve bir mililitre steril kaplama ortamı ekleyin. MEA kayıtları için, MEA sistemini, MEA çip tutucusu objektif deliğin üzerine ortalanmış olarak cihazın üzerine yerleştirin. Ardından, MEA kurulumunu konumlandırarak lazerin elektrotlara odaklanmasına izin verin, böylece hedef doğrudan MEA sisteminin deliğinin altında olur.
Hücrelerin mekanik rahatsızlıktan kurtulmasına izin vermek için, MEA çipini ekili hücrelerle birlikte inkübatörden kayıttan 15 dakika önce MEA kurulumuna aktarın. Daha sonra, gürültü seviyelerini azaltmak için bir izopropanol çubuk kullanarak temas pedlerini ve pimlerini dikkatlice temizleyin. MEA'yı MEA kurulumuna dikkatlice yerleştirin ve altı kuyucuklu MEA çipini seri numarası sağ tarafta görünecek şekilde veya referans elektrodu solda olacak şekilde tek bir kuyucuklu MEA yongasını konumlandırın.
Şimdi, MEA sistemi entegre ısıtmasını 38 santigrat dereceye ayarlayın. Entegre emniyet şalteri lazerin etkinleştirilmesine izin verdiği için cihazın kapağını kapatın, kapak MEA çipi üzerinden kapalıysa. MEA yapılandırma programını kullanarak, yüksek geçişli ve düşük geçişli MEA sistem filtresini sırasıyla 0,1 hertz veya daha az ve 3.500 hertz'e ayarlayın.
Kayıt için MC raf yazılımını veya herhangi bir alternatif yazılımı kullanın. Giriş aralığını denemeye göre ayarlayın. Sinyalin amplifikatörü ve örnekleme hızını doyurmadığından emin olmak.
Kaydı kontrol etmek için yazılımın uzun vadeli görüntüleme işlevini kullanın. MEA çipini MEA kurulumuna yerleştirdikten ve yazılımı kurduktan sonra FB ALP yazılımını kullanarak lazer mekaniğini başlatın. Şimdi, başlatma düğmesine tıklayın.
Başlatmanın sonunda, sanal lazer noktası sırasıyla altı kuyulu bir MEA için D kuyusunda ve tek bir kuyu MEA için sol altta olacaktır. Ardından, kontrol tuşunu bir fare tıklamasıyla kullanarak sanal lazer noktasını D beş elektrodunun ortasına taşıyın ve kontrol tuşunu basılı tutarak ve fare tekerleği ile kaydırarak odağı ayarlayın. Alternatif olarak, otomatik odaklama işlevini kullanın.
P one düğmesine basın ve sanal lazer noktası otomatik olarak kuyuya doğru hareket edecektir F.Sistem şimdi hizalanmış. Lazer gücünü ve işlem süresini deneysel gereksinimlere göre ayarlayın. Lazeri etkinleştirmek için, lazer açık olarak görünecek olan lazer kapatma düğmesine tıklayın, Kayıt yazılımına geçin.
Bir dosya adı seçin ve ölçümü kaydetmek için kırmızı kayıt düğmesine ve ardından pencerenin üstündeki oynat düğmesine tıklayın. Hücreleri lazerle açmadan önce 60 saniye boyunca bir taban çizgisi kaydedin. Başlatma yazılımına geri dönün ve yazılım penceresinin sağ tarafındaki sanal haritada lazer tarafından dışlanacak elektrotları devre dışı bırakın.
Lazeri başlatmak için Alt fare tıklamasını kullanın ve bu kuyucuğun orta elektrodunu seçin. Bu, lazeri bu kuyunun her elektrodundaki hücreleri otomatik olarak açmaya başlatır, seçilen bu kuyunun daha önce aktive edilmiş tüm elektrotlarını açmak için her kuyucuk için tekrarlayın. Nifedipin E-40 31'in milimolar konsantrasyonunu ve Dofetilid'i önce DMSO'da çözün, sonra da istenen konsantrasyonun 10 katına kadar tam bir ortamda çözün.
Kuyuda% 0.1'lik son DMSO konsantrasyonunu asla aşmayın. Temel etkinliği 60 saniye boyunca kaydedin. Lazer kaynaklı perasyonu daha önce gösterildiği gibi başlatın, bu da FPS'nin liAP'lere dönüşmesiyle sonuçlanır.
Tüm ilaçları kuyu başına tek konsantrasyon olarak uygulayın. Sırasıyla altı kuyu ve tek kuyu MEA'larından kuyu başına 20 mikrolitre ve 100 mikrolitre ortam çıkarın. Kuyuya ölçülecek ilaç stok çözeltisinden 20 mikrolitre veya 100 mikrolitre ekleyin.
MEA tipine bağlı olarak ve iki ila üç kez yukarı ve aşağı dikkatlice pipetleyin. Bileşiklerin 300 saniye boyunca yıkanmasına izin verin. Bu süre zarfında, liAP şekli FP şekline dönüşebilir.
Yine, indüklenen lazer kaynaklı perasyon ve liAP üzerinde olası bileşik kaynaklı kusurları 60 saniye daha kaydedin. Nifedipin ilavesi, liAP'lerin plato fazını konsantrasyona bağlı bir şekilde azalttı ve böylece tüm liAP'yi kısalttı. Bu kısaltma, manipüle edilmemiş elektrotlardan kardiyomiyositlerin alan potansiyelleriyle karşılaştırılabilirdi.
E-40 31, ilgili KV bir nokta 11 potasyum kanalının repolarizasyonunu inhibe etti ve kardiyomiyositlerin artan konsantrasyonlarda aritmik davranışına yol açtı. Ayrıca, E-40 31 liAP süresini konsantrasyona bağlı olarak arttırdı. LiAP'nin sonunda, 0.1 mikromolar'da küçük pozitif voltaj sapmaları gözlendi ve bu da EAD'ler adı verilen geçici yeni bir depolarizasyona işaret eden daha yüksek konsantrasyonlarla daha belirgin hale geldi.
0.1 mikromolar'ın en yüksek konsantrasyonunda, bu EAD'ler zamanla ektopik atımlara yükseldi. Bunlar erken aksiyon potansiyelleridir. EAD ve ektopik atımlar, profesyonel aritmik aktivitenin temel göstergeleridir.
Ve sonunda, elektriksel aktivite aritmik dayak ile sonuçlanır. Konsantrasyon yanıtı ilişkileri FP ve liAP kayıtlarıyla korelasyon gösterdi. Ayrıca, dofetilid varlığında, hem FP hem de liAP aynı kuyu içinde yaklaşık iki saniyelik süreler gösterdi, FP dalga formu düzenli repolarizasyon sapmaları sundu.
LiAP'de iken EAD'ler tespit edilebilir. Odak dışı mikroskop görüntüsü hücrelerin açılmasını etkileyebileceğinden, her melomen önce odağı ayarlamak önemlidir. Ayrıca, analiz için opterperasyonun kullanılması gerektiğinden kısa bir süre sonra aksiyon potansiyeli alınır.
Bu teknik, standart MEA'ya kıyasla önceki aritmik etkileri tespit etmede daha hassastır ve olumsuz bileşik etkilerin daha kesin olarak tespit edilmesini sağlar.
